CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术

规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)协同其相关蛋白Cas组成了细菌和古细菌的获得性免疫系统。利用该系统可以对外来某一特定单链或双链DNA实施高度特异性沉默或降解的特性,近年来对基因组进行精确定点编辑的CRISPR/Cas系统迅速发展。着重介绍了CRISPR/Cas系统的研究历史、结构、分类及作用机制,并分析讨论了现阶段以Cas9为核心的Ⅱ型系统在应用方面存在的问题及前景。     

CRISPR/Cas9与心血管疾病

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9(CRISPR-associated proteins)作为一种新型基因组编辑技术,为解释疾病的发生机制和治疗疾病提供了新方法。来自Ⅱ型原核CRISPR系统的CRISPR/Cas9能够通过单链向导RNA(single guide RNA, sgRNA)将Cas9核酸酶靶定到特定的基因组序列发挥作用。已经被成功用来进行基因编辑构建疾病模型,以进行相关领域的功能研究和疾病的治疗。CRISPR/Cas9技术正在迅速的应用于生物医学研究的各个领域,包括心血管领域,它促进了人们对电生理、心肌病、心律失常以及其他心血管疾病的更多了解,已经创建了靶向很多基因的细胞和动物模型,为新一类疗法打开了大门。本综述介绍了CRISPR/Cas9的作用原理、优点和局限性,以及在心血管疾病中的应用进展。     

CRISPR/Cas9:基因编辑的新时代

基因编辑技术是通过核酸内切酶对基因组DNA进行定向改造的技术,可以实现对特定DNA碱基的缺失、替换等,常用的四种基因编辑工具分别是:巨型核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶以及CRISPR/Cas9系统.其中CRISPR/Cas9系统作为一种新型的基因组编辑技术具有组成简单、特异性好、切割效率高的优点.该文对...     

CRISPR/Cas基因编辑系统研究进展

规律性成簇间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)的发现和工程技术对生命科学的发展带来巨大的推动作用。RNA引导的Cas(CRISPR-associated)酶已被用作操纵细胞、动物和植物基因组的工具。这加速了基础研究的步伐,并使其在临床和农业上的应用成为可能。CRISPR/Cas9对在实验系统中进行的功能基因组学的研究有重大影响。CRISPR/Cas9系统自发现以来,因其操作便捷、成本低、特异性高、可同时打靶任意数量基因等优点而被广泛应用。经过近几年研究发现,Cas9变异体(Cas12a、Cas13)有利于突破和克服CRISPR/Cas9应用中的一些限制,Cas12a极大地扩展了基因编辑靶位点的选择范围,同时其介导的多基因编辑具有明显的优势;Cas13等蛋白能特异性结合和编辑RNA,开启了转录组研究的新篇章。本文主要就CRISPR/Cas的研究背景以及Cas9、Cas12a和Cas13系统研究进展和应用进行综述,并对其应用前景和发展方向进行了展望。     

植物中CRISPR/Cas系统的应用研究进展

成簇规律间隔短回文重复—CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)是近年来新兴的基因组编辑技术,因其操作简便、靶向效率高和应用范围广而备受关注。国内外关于CRISPR/Cas系统在细菌和动物研究中的应用报道较多,但对其在植物研究中的应用报道较少。该文综述了CRISPR/Cas系统的发现、结构、作用机制及其在植物研究中的应用,以期为CRISPR/Cas系统在提高农作物产量及培育抗性品种等方面的应用研究奠定基础。     

CRISPR/Cas9系统研究进展

CRISPR/Cas9系统的发展彻底改变了人们编辑DNA序列和调控目标基因表达水平的能力,从而为生物体的精确基因组编辑提供了有力的工具。简化后的CRISPR/Cas9系统由两部分组成:Cas9蛋白和sgRNA。其作用原理为sgRNA通过自身的Cas9把手与Cas9蛋白形成Cas9-sgRNA复合体,Cas9-sgRNA复合体中sgRNA的碱基互补配对区序列与目标基因的靶序列通过碱基互补配对原则进行配对结合,Cas9利用自身的核酸内切酶活性对目标DNA序列进行切割。与传统的基因组编辑技术相比,CRISPR/Cas9系统具有几大明显的优势:易用性、简便性、低成本、可编程性以及可同时编辑多个基因。CRISPR/Cas9基因组编辑技术以及衍生出来的CRISPRi和CRISPRa基因表达调控技术已经广泛应用于多种真核和原核生物中。综述了CRISPR/Cas9系统的起源、作用机理、在生物体中的应用和其衍生出的技术,并概述了其脱靶效应和未来前景。     

CRISPR/Cas系统的分类及研究现状

CRISPR技术作为一种新型的基因编辑技术,被广泛应用于微生物、动物和植物领域。对CRISPR/Cas系统的起源、分类特点等进行了阐述,重点梳理了CRISPR/Cas系统分类的发展历程,并根据最新分类方法,介绍了不同类型的CRISPR/Cas系统的作用机制、内部不同蛋白的作用特点及应用与发展,以期探寻更多的CRISPR/Cas系统,扩大该系统的应用领域。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在丝状真菌中的应用

随着对丝状真菌基因水平研究的不断深入,CRISPR/Cas9技术作为先进的基因编辑技术,已被广泛应用于丝状真菌的基因编辑。探究了CRISPR/Cas9系统在不同丝状真菌中的应用情况,主要从sgRNA的构建与表达、Cas9蛋白的改造与表达、不同的DNA双链断裂修复（DNA double-strand break,DSB）方式等方面进行概述,并对编辑效率、脱靶效应进行总结,旨在为今后丝状真菌中CRISPR/Cas9系统的构建及改良提供思路。     

Efficient Editing of an Adenoviral Vector Genome with CRISPR/Cas9

Immunotherapy based on genetic modification of T cells has played an important role in the treatment of tumors and viral infections. Moreover, adenoviral vectors engineered with improved safety due to their inability to integrate into the host genome have been key in the clinical application of T cell therapy. However, the commonly used adenoviral vector Ad5 exhibits low efficiency of infection of human T cells and the details of the intracellular trafficking pathway of adenoviral vectors in human primary T cells remains unclear. Resolution of these issues will depend on successful modification of the adenoviral vector. To this end, here we describe the successful establishment of a simple and efficient method for editing adenoviral vectors in vitro using the CRISPR-Cas9 gene editing system to target the adenoviral fiber gene. Electronic supplementary materialThe online version of this article (10.1007/s12088-020-00905-3) contains supplementary material, which is available to authorized users.     

靶向番茄SlACS2基因CRISPR-Cas9 sgRNA的设计和分析

番茄为呼吸跃变型果实,伴随呼吸跃变产生大量乙烯,即系统II乙烯,易使番茄果实过熟,导致腐烂变质。SlACS2是番茄系统II乙烯合成的限速酶,通过CRISPR-Cas9基因组编辑系统修饰该基因,调控系统II乙烯过量表达,将迟滞番茄过熟。本研究基于RNA-seq建立了SlACS2基因的数字表达谱,表明该基因呈果实特异性表达,在植株的根、茎、叶等部位不表达。SlACS2位于番茄1号染色体,含4个外显子和3个内含子。利用在线工具CRISPRdirect 和CRISPR-P发现第1、2、3外显子分别具有18、9和11条sgRNA。其中,sgRNA1-14和sgRNA3-8及二者的近PAM的12 nt 种子序列在番茄基因组是唯一序列,GC含量高于40%,不存在TTTT终止序列。BLAST结果表明,sgRNA1-14和sgRNA3-8与GenBank公布的8条SlACS2同源序列高度一致,位于该基因的保守区,而与SlACS4和SlACS6的同源序列存在多个SNP,预示这2条sgRNA可用于番茄不同品种SlACS2基因的靶向编辑,并可规避对SlACS家族其他同源基因的脱靶效应。     

CRISPR/Cas9 system in Plasmodium falciparum using the centromere plasmid

The CRISPR/Cas9 nuclease system is a powerful method to genetically modify the human malarial parasite, Plasmodium falciparum. Currently, this method is carried out by co-transfection with two plasmids, one containing the Cas9 nuclease gene, and another encoding the sgRNA and the donor template DNA. However, the efficiency of modification is currently low owing to the low frequency of these plasmids in the parasites. To improve the CRISPR/Cas9 nuclease system for P. falciparum, we developed a novel method using the transgenic parasite, PfCAS9, which stably expresses the Cas9 nuclease using the centromere plasmid. To examine the efficiency of genetic modification using the PfCAS9 parasite, we performed site-directed mutagenesis of kelch13 gene, which is considered to be involved in artemisinin resistance. Our results demonstrated that the targeted mutation could be introduced with almost 100% efficiency when the transfected PfCAS9 parasites were treated with two drugs to maintain both the centromere plasmid containing the Cas9 nuclease and the plasmid having the sgRNA. Therefore, the PfCAS9 parasite is a useful parasite line for the genetic modification of P. falciparum.     

基于CRISPR/Cas9的激活系统研究进展

基因编辑技术自问世以来就一直作为生物技术领域的研究热点。基因编辑工具成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关系统(CRISPR/Cas系统)具有特异性、简便性和灵活性等优点,为研究人员提供了丰富的遗传操作工具,也让CRISPR/Cas系统的应用在多种生物中得到了飞速发展。特别是将转录激活因子与失活的Cas蛋白结合,可在RNA转录水平实现基因表达特异性调控,为生物技术在医学研究及农业领域的发展做出了重要的贡献。外源基因的过表达是验证基因功能和基因调控的常用方法,然而由于载体容量的限制难以实现多基因过表达。基于CRISPR/Cas9激活系统可在不同向导RNA的引导下对多个基因进行调控,实现调控水平验证基因功能。本文通过对CRISPR/Cas9激活系统组成及不同激活策略进行总结,整理针对过度激活的解决方案,为CRISPR/Cas9激活系统应用于棉花遗传改良及除草剂抗性研究提供更多参考。     

CRISPR/Cas9基因编辑在三维基因组研究中的应用

CRISPR/Cas9系统在基因编辑方面具有巨大优势,能够低成本、可编程、方便快捷地用于动物、植物以及微生物的基因组靶向编辑和功能改造。三维基因组学是近年来兴起的一门研究染色质高级结构动态调控及基因组生物学功能的交叉学科。在三维基因组研究中,通常采用对DNA片段进行基因编辑以模拟基因组结构性变异,标记特定DNA片段,进而研究调控元件对于基因调控、细胞分化、组织发生、器官形成、个体发育的影响,最终阐明三维基因组的组装调控机制和生物学功能。因此,CRISPR及其衍生技术为研究三维基因组提供了极好的遗传学工具。本文主要综述了CRISPR片段编辑及其衍生技术在三维基因组调控与功能研究中的应用,以期为后续研究工作提供理论参考以及新的研究思路。     

利用CRISPR/Cas9系统检测果蝇细胞中组蛋白甲基化修饰对20E信号传导的调控

[目的]利用CRISPR/Cas9基因敲除系统在黑腹果蝇Drosophila melanogaster细胞中筛选并检测组蛋白甲基化修饰对蜕皮激素20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)信号传导的调控.[方法]通过Flybase网站分析并总结黑腹果蝇组蛋白甲基转移酶及其修饰位点;将5个组蛋白甲基转...