锌指核酸酶技术制备肌肉生长抑制素基因敲除的五指山小型猪成纤维细胞

敲除猪肌肉生长抑制素(Myostatin, MSTN)基因可能提高猪瘦肉率, MSTN基因敲除猪也可作为相关疾病的动物模型。文章利用锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFNs)技术敲除五指山小型猪胎儿成纤维细胞MSTN基因, 为制备MSTN基因敲除猪奠定基础。ZFNs质粒或编码ZFNs的mRNA均能高效敲除MSTN基因, 使用ZFNs mRNA能直接得到MSTN+/-和MSTN-/-两种基因型的细胞克隆。DNA序列测定与分析发现, 细胞克隆的突变类型多为ZFNs作用靶位点处不大于10 bp的碱基插入或缺失(92.18 %); 氨基酸预测发现, 突变型MSTN基因的终止密码子常常提前出现。将MSTN基因敲除的细胞进行体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer, SCNT)发现, 胚胎体外早期发育潜力与野生型无显著差异, 表明这些细胞可用于后续MSTN基因敲除猪的制备。     

利用启动子缺陷型打靶载体敲除牛胎儿成纤维细胞中的Prnp

利用启动子捕获对中靶细胞进行富集是提高体细胞基因打靶效率常用的策略之一.敲除动物的Prnp可使其具有抵抗Prion病感染的能力.采用启动子捕获策略,构建了牛Prnp启动子缺陷型打靶载体BoPrneo,线性化后,再通过电穿孔转染牛胎儿成纤维细胞BFF,用250 μg/mLG418进行药物筛选,共得到99个药物抗性细胞克隆.对细胞克隆进行PCR、测序及Southern blotting鉴定,结果表明,其中的4个细胞克隆为中靶细胞,说明牛胎儿成纤维细胞中的Prnp一条等位基因被成功敲除.本研究为牛Prnp的敲除提供了一种简单、安全、有效的方法.     

BAI1基因敲除打靶载体的快速构建

BAI1(脑血管生成抑制因子1)因其具有抑制血管生成的作用而得名,研究表明肿瘤的发生可能与BAI1的低表达有关.为了进一步探索BAI1的作用机制,运用改良的Red重组系统和低拷贝中间载体,利用50 bp的同源重组序列直接从BAC载体中克隆长片段的小鼠基因组序列;将得到的基因组序列再次通过重组和改造,构建了BAI1基因的完全敲除并带有报告基因的打靶载体,为后续的构建BAI1基因敲除小鼠模型、在动物体内研究基因功能奠定了基础.     

五指山小型猪下颌骨的测量及分析

目的通过对五指山小型猪(WZSP)下颌骨23个主要变量进行测量分析,以确定该小型猪下颌骨主要遗传变量的数值范围。方法临床解剖取出下颌骨,用水煮沸后剔除肌肉和骨膜,然后用10%甲醛浸泡24h,再用万能角度尺、游标卡尺、卷尺对25例五指山小型猪(8～14月龄,17例雄性,8例雌性)的23个主要变量进行测量。并对测量结果进行统计学分析。结果在测得的雄性和雌性五指山猪下颌骨的23项变量中有4项差异有显著性,2项差异有极显著性,其他差异无显著性;下颌骨各变量之间存在一定的相关性,雄性下颌骨变量x7、x16、x22与其他17项变量相关有显著性或相关有极显著性,雌性下颌骨变量x21与其他11项变量相关有显著性或相关有极显著性。雄性五指山猪下颌骨测量变量显著、极显著相关性所占比例达到52.97%,雌性达到17.00%。与琉球野猪的下颌骨相比,雄性五指山小型猪的x15、x16、x21等变量差异无显著性,雌性的x15、x16、x21、x22等变量差异无显著性,而x2差异有显著性,琉球野猪的下颌骨显得更为狭长。与人及恒河猴(Macacamulatta)、猕猴等动物相比,五指山小型猪下颌骨的多项变量要高。结论测得五指山小型猪育成猪的下颌骨23项变量,可为五指山小型猪遗传、牙科等方面研究提供下颌骨形态学特征的资料。     

利用CRISPR/Cas9技术建立OXTR基因敲除猪胎儿成纤维细胞系

利用CRISPR/Cas9系统建立催产素受体(oxytocin receptor,OXTR)基因敲除的巴马猪胎儿成纤维细胞系(porcine fetal fibroblasts,PFFs),为构建OXTR基因敲除巴马猪模型提供供体细胞。首先,对人和猪的OXTR基因进行了生物学信息分析。其次,利用在线设计工具设计了2个靶向猪OXTR外显子区的sgRNA,并克隆至pX330骨架质粒中,最后将打靶质粒和Neomycin抗性质粒共转染至PFFs中,用G418药物筛选出抗性单克隆细胞,测序鉴定其基因型。生物信息学分析显示人和猪OXTR基因进化距离较近,氨基酸序列一致性达到91%,相似性为93%,三维结构的RMSD值为0.009。成功构建OXTR基因的Cas9/sgRNA打靶载体,转染PFFs细胞后,药物筛选获得OXTR基因敲除的单克隆细胞并测序证实了基因突变型。人和猪OXTR基因具有高度同源性;构建的Cas9/sgRNA表达载体高效实现了OXTR基因编辑,成功获得基因敲除的单细胞克隆,为后续构建OXTR敲除的巴马猪模型奠定了前期基础。     

不同月龄近交系五指山小型猪免疫器官的组织形态学

目的对不同月龄近交系五指山小型猪免疫器官组织特点进行观察,为其用于建立人类免疫相关疾病模型提供基础形态学资料。方法2、4和12月龄小型猪免疫器官被分别固定,常规石蜡切片、HE染色,光镜观察。结果4月龄前,胸腺内胸腺细胞和胸腺小体的数量均随年龄的增长逐渐增多;12月龄时,胸腺细胞数量有所减少,排列比较疏松,胸腺小体的数量和体积基本没有变化;2月龄时胸腺小体周围可见许多大小不同的空泡状细胞和细胞碎片。4月龄前,脾白髓动脉周围组织淋巴鞘和脾小结在也随年龄增长而逐渐增多增大,但12月龄时有所减少并维持在一定水平,其变化与大鼠和鸡的基本一致。2月龄淋巴结皮质靠内,髓质靠外,4月龄两者分界不明显,12月龄淋巴小结较大,淋巴细胞排列疏松,髓质内淋巴细胞较少,毛细血管增多。结论从整体结构上观察,近交系五指山小型猪免疫器官的组织学结构与人和其它哺乳动物之间没有明显的差异。     

西藏小型猪IGF-1基因的克隆测序分析

目的克隆西藏小型猪的肝脏组织中的IGF-1基因的c DNA序列,并与Pubmed中查询到的猪c DNA进行比对分析。方法提取了西藏小型猪肝脏组织的总RNA,应用RT-PCR技术扩增了IGF-1基因的c DNA序列,将扩增出的片段克隆到p MD18-T载体上,构建重组质粒p MD18-T-IGF-1,进行测序分析。结果克隆出西藏小型猪肝脏组织中的IGF-1的c DNA序列,获得了大小为567 bp长的片段,编码了186个氨基酸,与Pubmed中查询到的猪(NM_214256.1)的IGF-1基因高度同源,比对序列发现,在440、455 bp处发生了G→A、C→T的突变,该位点的突变引起相应编码氨基酸的变化,分别由组氨酸变成了精氨酸、亮氨酸转变成了丝氨酸。结论为西藏小型猪的生长发育机制研究提供了分子学依据。两个位点的突变引起的氨基酸的改变是否是导致西藏小型猪矮小的原因,需要进一步论证。     

五指山小型猪高脂血症模型的心脏自主神经功能变化

目的观察五指山小型猪高脂血症模型的心脏自主神经功能的动态变化,探讨血脂异常对自主神经功能的影响和与昼夜的关系。方法利用高脂饮食诱发五指山小型猪高脂血症,造模后,每2周一次测定小型猪TG、TC、HDL-C和LDL-C和监测动态心电图,并进行24 h和昼夜心率变异性（HRV）分析,以评估小型猪的心脏自主神经功能。结果高脂饮食2周后五指山小型猪血清TC、HDL-C、LDL-C水平均显著升高（P〈0.01）,TG水平亦在高脂饮食后6周显著升高（P〈0.05）,其中,TC、LDL-C在高脂饮食0～4周时呈快速上升,在4～6周达到高峰,8～10周基本稳定并维持在一定水平;HDL-C在高脂饮食0～2周迅速上升并达到高峰,2～10周基本稳定。HRV参数分析结果,时域指标（RRI、SDNN、RMSDD、SDANN、PNN50、SDANN index、STV、LTV）和频域指标（VLF、LF、HF和TP）均渐进性显著降低（P〈0.05,P〈0.01）,LF/HF升高（P〈0.05）,夜间HRV参数变化程度均高于白天;相关分析显示HRV各参数与TC、LDL-C、TC/HDL-C、LDL-C/HDL-C具有显著的相关性（P〈0.05,P〈0.01）,经多元线性逐步回归分析发现,SDNN与TC、LDL-C、TC/HDL-C、LDL-C/HDL-C比值的相关性依次为0.673、0.672、0.665、0.681。结论高脂饮食诱发五指山小型猪高脂血症的血脂异常可引起自主神经功能的下降和紊乱,自主神经功能的紊乱程度与高血脂状态的持续时间有关;血脂异常所致心血管疾病的危险程度夜间高于白天;HRV降低与TC、LDL-C、TC/HDL-C和LDL-C/HDL-C比值升高呈一定的依赖性,SDNN降低可作为预测高脂血症引发心血管病风险的独立相关指标。     

借助慢病毒将EGFP基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞

目的借助慢病毒将EGFP基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞（porcine embryonic fibroblasts,PEFs）,以基于PEFs建立慢病毒介导的外源基因体外投递系统。方法取35d西藏小型猪胚胎,酶消化法分离培养西藏小型猪的PEFs;按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒（携带EGFP基因）包装（脂质体介导的瞬时转染）,随后用病毒上清感染PEFs,24～48h后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光以证实慢病毒是否成功生产和成功感染PEFs。结果成功分离培养西藏小型猪的PEFs,按标准程序生产的携带EGFP基因慢病毒高效率感染西藏小型猪的PEFs。结论针对西藏小型猪的PEFs建立了相应的慢病毒介导的外源基因体外投递系统,为相关后续研究打下了良好基础。     

应用多重PCR和基因扫描技术对五指山猪13个家系32个微卫星基因座的遗传分析

五指山猪是我国著名的珍稀畜种,体型小、性成熟早、遗传稳定、近交程度高,可用于医学、药学和生物材料等方面。作者利用多重PCR和基因扫描技术对五指山猪13个家系的32个微卫星基因座进行遗传检测。统计各家系的等位基因组成,计算各家系的平均杂合度和多态信息含量(PIC);结果,各家系32基因座的平均等位基因数为13.66个,平均PIC为0.731,平均杂合度为0.559。表明海南五指山猪具有丰富的遗传多样性。这些结果对于海南五指山猪的保种、定向选育、开发利用都具有重要的指导意义。     

Atherosclerosis Induced by a High-Cholesterol and High-Fat Diet in the Inbred Strain of the Wuzhishan Miniature Pig

Coronary artery disease has a significant genetic predisposition, which mainly results from atherosclerosis. Miniature pig is an excellent model to investigate atherosclerosis. This study investigated whether the occurrence and development of atherosclerosis in the Wuzhishan miniature pigs (WZSPs) that were closely bred 12 generations had better consistency. The WZSPs (n?=?9) were fed a high-cholesterol and high-fat diet (HCFD). After continuous feeding, 3 WZSPs each were sacrificed at 6, 8, and 12 months, respectively, and the general clinical manifestations and serological indexes were detected. The pathological changes of the major arteries and main organs were recorded. The results showed WZSPs were quite susceptible to the HCFD. At 6 months, plaque lesions appeared in the abdominal aorta and iliac artery, while at 8 months, they appeared in the coronary artery. At 12 months, atherosclerotic lesions could be found in all major arteries, while lipid core, cholesterol precipitation, and calcium deposition appeared in the most serious sites. The progression of arterial lesions and distribution of the lesions were highly consistent in the pigs. However, apparent variations in serum markers were observed. In conclusion, inbred WZSP is a good model to investigate atherosclerosis and has good predictability for the occurrence and development of the disease.     

Generation of GGTA1 biallelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and somatic cell nuclear transfer

Genetically modified pigs are valuable models of human disease and donors of xenotransplanted organs.Conventional gene targeting in pig somatic cells is extremely inefficient.Zinc-finger nuclease(ZFN)technology has been shown to be a powerful tool for efficiently inducing mutations in the genome.However,ZFN-mediated targeting in pigs has rarely been achieved.Here,we used ZFNs to knock out the porcineα-1,3-galactosyl-transferase(GGTA1)gene,which generates Gal epitopes that trigger hyperacute immune rejection in pig-to-human transplantation.Primary pig fibroblasts were transfected with ZFNs targeting the coding region of GGTA1.Eighteen mono-allelic and four biallelic knockout cell clones were obtained after drug selection with efficiencies of 23.4%and 5.2%,respectively.The biallelic cells were used to produce cloned pigs via somatic cell nuclear transfer(SCNT).Three GGTA1 null piglets were born,and one knockout primary fibroblast cell line was established from a cloned fetus.Gal epitopes on GGTA1 null pig cells were completely eliminated from the cell membrane.Functionally,GGTA1 knockout cells were protected from complement-mediated immune attacks when incubated with human serum.This study demonstrated that ZFN is an efficient tool in creating gene-modified pigs.GGTA1 null pigs and GGTA1 null fetal fibroblasts would benefit research and pig-to-human transplantation.     

利用基因诱捕技术进行小鼠基因剔除的初步研究

对利用基因诱捕技术进行小鼠基因剔除做了初步的探索,为进一步应用该技术进行小鼠基因功能研究奠定了基础.利用基因诱捕载体转染小鼠ES细胞,获得了36株neo基因单拷贝整合的诱捕ES细胞,其中14株细胞表达有活性的β半乳糖苷酶.将3株诱捕ES细胞分别经显微注射引入到受体囊胚中,再植入假孕母鼠的子宫中使其发育成小鼠.两株细胞得到了程度不同的嵌合体小鼠,其中一株诱捕ES细胞整合至生殖系.利用质粒拯救实验获得了诱捕载体整合位点附近的基因组序列,通过序列比对发现被诱捕的基因可能是一个新基因.X-gal染色结果显示,该基因的表达局限于小鼠腹部及肢芽的部位.     

Myogenin蛋白在五指山猪和长白猪骨骼肌中的表达

本研究采用免疫荧光及免疫组化DAB显色技术来检测Myogenin蛋白在五指山猪和长白猪胎儿和成年猪的骨骼肌中的定位和表达情况,并通过平均光密度统计分析Myogenin蛋白在五指山猪和长白猪胎儿和成年猪骨骼肌中表达水平.结果表明:Myogenin蛋白表达定位于骨骼肌细胞核表达;在五指山猪和长白猪胎儿和成年猪的腿部骨骼肌和背部骨骼肌中均检测到阳性产物,在猪胎儿期间骨骼肌中Myogenin蛋白的表达水平高于其在成熟猪骨骼肌中的表达;且在同种猪腿部骨骼肌中的表达水平显著高于其在背部骨骼肌中的表达;此外还检测到Myogenin蛋白在五指山猪骨骼肌中表达均显著高于其在长白猪骨骼肌中的表达(p<0.05).本研究得到的Myogenin蛋白在五指山猪和长白猪骨骼肌中存在显著的表达差异结果,为今后研究不同猪种间骨骼肌发育差异及探讨五指山猪矮小机制和发育机理提供了理论基础.     

三品系小型猪35个微卫星基因座的遗传学研究

利用35个微卫星基因座对中国三个品系的小型猪（贵州小型香猪、广西巴马小型猪、版纳小耳猪近交系）进行了遗传检测。计算出三个小型猪品系个体样本在35个微卫星基因座的纯合率,并对其进行t检验。计算出各品系的平均杂合度,多态信息含量（PIC）及品系间的遗传距离,并进行了系统聚类。结果表明三个品系的小型猪其基因纯合率均较高,其中版纳小耳猪近交系的基因纯合率最高;PIC和平均杂合度均较低;贵州小型香猪和广西巴马小型猪亲缘关系较近,并均与版纳小耳猪近交系的亲缘关系略远。 Abstract：The polymorphism of 35 microsatellites in the three miniature pig breeds in China(Guizhou miniature pig, Guangxi Bama miniature pig, Banna miniature pig inbred) was analysed. Rates of homozygote for 35 microsatellite loci in three miniature pig breeds were calculated,and t-test for them were performed. Mean heterozygosity and polymorphism information content(PIC) were calculated for all breeds, and genetic distances between these breeds were estimated. The dendrograms were obtained based on genetic distances. The results suggest that rates of homozygote in the three breeds are all high, and that is the highest in Banna miniature pig inbred. The results also suggest that polymorphism information content and mean heterozygosity in all the three breeds are low, and the genetic relationship between Guizhou miniature pig and Guangxi Bama miniature pig is closer than their relationship with Banna miniature pig inbred.