基于双碱基编辑系统的植物基因靶向随机突变技术

遗传性变异是表型多样性的基础,靶向饱和突变作物基因可以促进产生具有优异农艺性状的突变体。相较于传统诱变育种和异源物种中的定向进化方法,基于双碱基编辑系统的植物基因靶向随机突变技术可对植物内源基因产生高效突变,从而实现原位定向进化,加快植物育种及功能基因研究进程。该文介绍了使用饱和靶向内源基因突变编辑器(STEME)对植...     

单细胞测序方法研究进展

近年来,高通量测序技术(Next-generation sequencing,NGS)快速发展,已广泛应用于生命科学各个领域,但传统的混合细胞测序(Bulk cell sequencing)检测的是细胞群体的总平均反应,无法反应每个细胞的真实情况,这会影响研究者对细胞功能认知的准确性。单细胞测序技术(Single cell sequencing,sc-Seq)的出现,从一定程度上解决了传统测序固有的缺陷。单细胞测序是针对单个细胞的RNA或DNA进行测序,能够准确测出单个细胞的基因结构和表达状态,从而分析相同表型细胞的异质性。本文首先介绍单细胞测序的原理、测序类型和测序平台,有助于理解单细胞测序和在进行科研项目时设计合适的项目方案。进一步介绍单细胞转录组测序的分析流程和各种常用的分析工具或软件,并重点阐述单细胞转录组测序分析中的细胞聚类和拟时序分析的原理和研究进展,为进行单细胞转录组测序数据分析提供参考。最后,本文简述了单细胞测序研究热度、单细胞测序的应用、挑战和展望等,有助于更全面地认识单细胞测序。     

基于功率谱分析的基因编码序列单碱基突变研究

针对DNA序列单碱基的不同类型突变,利用数字信号处理方法,研究了单碱基替换突变、删除突变、插入突变对DNA序列三周期功率谱的影响。研究结果表明:对于不同长度的编码序列,替换突变对序列功率谱的影响较小,删除突变和插入突变对序列功率谱的影响较大;随着序列编码区长度的减小,替换、删除、插入突变对序列编码区的功率谱影响会越来越大。对于中等长度外显子,插入突变对序列三周期功率谱影响最大,对于短外显子,删除突变对序列三周期功率谱的影响最大。研究结果可为含突变基因编码区的识别与检测提供参考。     

单细胞RNA测序数据分析方法研究进展

单细胞RNA测序(Single cell RNA sequencing,scRNA-Seq)已经广泛应用于细胞分化、肿瘤微环境及多种疾病病因学研究。目前,由于scRNA-Seq具有低捕获率、高噪声、高变异性等特点,通过优化数据分析方法提高测序结果准确性已经成为测序领域的研究热点。对近年来数据分析过程中利用的数学方法进行了总结,讨论了数据分析的优势及存在的问题,以期为新算法的开发和应用提供参考,逐步提高测序结果的可靠性。     

单碱基突变的检测

单碱基突变的检测吴学军,柴建华（复旦大学遗传所,上海２００４３３）关键词单碱基突变,检测在临床上有很多遗传病是由基因内的单碱基替换所致。如何快速简便地进行检测,发现这种点突变,是临床医学家的需要。１．单碱基检测方法的回顾用来检测单碱基错配的方法有等位...     

基于单细胞测序构建胶质母细胞瘤预后模型

[目的]基于单细胞测序筛选胶质母细胞瘤特征基因并构建预后模型。[方法]分析GEO数据库单细胞RNA测序数据集GSE84465,筛选出GBM细胞分化相关的差异基因。下载TCGA数据库GBM的基因表达谱和临床数据,采用Lasso回归、Cox回归分析筛选出特征基因构建预后模型,根据独立预后因素构建列线图,GSE83300作为外部验证集。基于风险评分中位数将患者分组,比较两组生存差异。[结果]通过scRNA-seq得到492个分化差异基因,经过回归分析得到基于6个基因(PLAUR、RARRES2、G0S2、MDK、SERPINE2、CD81)的预后模型。其1、3、5年ROC曲线下面积均大于0.7;KM分析显示高低风险组预后存在差异(P<0.001),GSE83300验证结果与TCGA一致。多因素Cox回归分析表明年龄和风险评分可以作为独立影响因素(P<0.01);C-Index(0.679)、校准图显示列线图预测模型有良好的拟合度。GSEA分析示高低风险组差异基因集参与细胞因子受体相互作用、抗原处理与提呈等通路。[结论]由PLAUR、RARRES2、G0S2、MDK、SERPINE...     

基于CRISPR的单细胞转录组测序技术研究进展

基于CRISPR的单细胞转录组测序技术是将单细胞转录组测序技术与CRISPR集中筛选技术结合,用于研究传统技术无法完成的细胞异质性、细胞谱系追踪、细胞互作及空间位置、药物作用靶点预测和鉴定等。本文简单比较了六种最常用的单细胞转录组测序技术,重点介绍了五种基于CRISPR的单细胞转录组测序技术及应用研究,并对其推广应用所面临的挑战作出了分析,旨在为单细胞转录组测序技术的应用及创新提供参考。     

结核分枝杆菌耐药相关单碱基突变的计算方法比较

[目的] 耐药结核分枝杆菌（drug-resistant Mycobacterium tuberculosis）的产生给结核病（tuberculosis）的治疗带来巨大困难。[方法] 使用基于全基因组测序的关联分析探究耐药强相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）突变,主要有GEMMA、phyc、plink。为了阐明其中最优的耐药相关SNP计算方法,本研究下载NCBI上已有的1504株结核分枝杆菌数据,并获取它们对于3种常见的一线抗结核治疗药物（isoniazid、rifampicin、ethambutol）的耐药性检验结果。并使用这3种耐药相关SNP计算方法计算与结核分枝杆菌耐药相关的SNP;并评估计算得到的耐药相关SNP在预测耐药表型的敏感性和特异性。[结果] 发现通过phyc可以预测到最多的已知耐药相关SNP和最少的耐药无关SNP,而且phyc预测的耐药相关SNP的敏感性和特异性恒定大于52.49%。[结论] phyc在预测结核分枝杆菌耐药相关SNP中结果最准确,但考虑到运行时间和表型数据的更新,GEMMA和plink的结果也应作为参考。     

单细胞测序和基因编辑技术在造血干细胞研究中的应用

造血干细胞对血液系统稳态维持发挥着至关重要的作用,它通过自我更新以维持自身不被耗竭,同时通过定向分化,补充各类功能血液细胞。当造血干细胞自我更新和定向分化出现问题,就会产生一系列造血系统疾病,例如髓系白血病、淋系白血病和骨髓增生性疾病等。关于造血干细胞的衰老和疾病变迁的调控机制一直是研究的热点。作为异质性细胞群,造血干细胞命运受到细胞内调控因子、细胞外生长因子、细胞外基质蛋白等多种因素调控,这是一个高度复杂且精确的调控过程。单细胞测序技术的发展,可以在单细胞水平从基因组、转录组、表观遗传组和蛋白质组等方面了解造血干细胞的命运调控网络。利用基因编辑技术可以建立多种基因修饰动物模型,不仅可以用于基因功能研究,也可以用于评价造血干细胞的安全性。此外,基因修饰动物模型结合单细胞测序技术,还能对造血干细胞实现命运示踪和调控分析。单细胞测序和基因编辑等新技术的应用,极大地推动了造血干细胞相关研究的进展。本文将从这些新技术在造血干细胞研究领域中的应用和存在的问题进行阐述,方便大家了解这些技术的优缺点,以便在以后的应用中提供帮助。     

基于单细胞ATAC测序数据的乳腺癌上皮细胞转录因子研究

研究表明,乳腺肿瘤细胞染色质开放区域上的转录因子显著影响乳腺癌患者的临床表型和预后。然而,在单细胞层面,这些调控元件如何调控乳腺癌发生发展尚不明确。为此,本研究从GEO数据库中下载了45 216个正常和肿瘤乳腺组织的单细胞染色质可及性测序(single-cell ATAC sequencing, scATAC-seq)数据,并对其进行了分析。根据标记基因在细胞群的基因活性得分进行细胞类型注释后得到7种乳腺细胞类型。皮尔逊相关性分析表明,肿瘤和正常乳腺样本的上皮细胞存在明显的染色质可及性差异,且乳腺上皮细胞存在高度样本间异质性(PCC=-0.07),暗示其是乳腺肿瘤的主要恶性细胞类型。为了探究正常和恶性乳腺上皮细胞的差异可及性区域中转录因子结合基序的富集情况,在提取上皮细胞群后对4个上皮细胞亚型的特征开放区域进行了转录因子结合基序富集分析。结果表明,恶性乳腺上皮细胞有194个转录因子显著富集(P<0.001),它们可能涉及乳腺肿瘤发展和转移等调控过程。对上皮细胞亚型中富集程度较高的转录因子进行活性分数计算及转录组数据验证,结果进一步显示这些差异调控元件可能与乳腺细胞恶性发展相关。此...     

单细胞测序技术在干细胞领域的研究进展

细胞异质性是生物体内普遍存在的一种特性,这种特性容易受外界因素的影响,甚至是单一类型的细胞在生长环境发生改变时,其基因表达也可能出现变化并产生差异。干细胞是一类具有无限自我更新和分化潜能的特殊类型的细胞,在胚胎组织发育和成体组织的动态平衡中发挥了重要作用。单细胞测序为分析包括干细胞在内的细胞异质性提供了强有力的工具,这种技术可通过更加准确的方式剖析细胞异质性。该文综述了近年来发展起来的单细胞测序技术,包括单细胞分离、基因组扩增和测序分析,并讨论了它们在干细胞(包括多能干细胞、肿瘤干细胞和组织特异性干细胞)研究中的应用。     

基于焦磷酸测序技术建立基因编辑水稻检测方法

基因编辑技术发展迅速,但对应的检测方法较少。为寻找创建基因编辑作物适用的检测方法,以 PL3 基因编辑水稻编辑位点为靶标,有效设计了焦磷酸测序的扩增引物及测序引物,并进行有效性检测,分别利用Sequence to Analyze等程序以及SNP和AQ两种模式完成了对PL3 基因的定性和定量检测试验,建立了 PL3 基因编辑水稻编辑位点焦磷酸测序检测方法。结果表明,基于焦磷酸测序技术可以通过检测编辑位点从而将基因编辑型水稻与野生型水稻进行区分。与常规的转基因检测方法相比,该检测方法具有较好的准确性、高效性及高灵敏度等优点,在基因编辑型水稻编辑位点定性和定量检测分析方面具有很好的应用前景。     

基因测序法检测FLT3和NPM1的突变研究

目的:基因测序法检测FLT3和NPM1突变在急性髓系白血病(AML)中预后判断和分子靶向治疗的意义。方法:利用基因测序法检测35例急性髓系白血病的突变。结果:发现35例样本中FLT3-ITD突变4(13.3%)例,NPM1突变6(20%)例,没有发现FLT3和NPM1都突变,其它25(71.4%)例均为FLT3阴性、NPM1阴性。结论:AML存在NPM1突变958bp处出现插入突变,缺失TGGCAGTG和缺失后替换成gcccgcggttta的突变,FLT3中出现内部串联重复突变,直接测序法最方便检测此突变。     

基于工程菌高效合成靶向昆虫基因的dsRNA的方法

外源或内源双链RNA(dsRNA)可以干扰昆虫基因的表达。目前,利用RNA干扰(RNAi)技术防治农业害虫已经取得了一定进展,但高昂的dsRNA合成成本是RNAi技术在田间应用的主要限制因素。本方法利用L4440质粒和大肠杆菌HT115(DE3)菌株,建立了一种经济、高效的昆虫靶标基因dsRNA合成方法。与商业化的dsRNA合成试剂盒相比,工程菌合成dsRNA的方法大幅降低了dsRNA的合成成本。本方法将为大规模昆虫基因功能解析和RNAi制剂的田间应用提供可能,有望促进以RNAi为核心的害虫防治技术的实践和发展。     

循环肿瘤细胞单细胞测序——液体活检的新视角

循环肿瘤细胞是实体肿瘤原发灶或转移灶侵袭、脱落进入外周血的,具有高活力、高转移潜能的肿瘤细胞。由于肿瘤存在异质性,导致肿瘤组织高通量测序分析难以发现低丰度肿瘤干细胞的基因组特征。循环肿瘤细胞单细胞测序,通过比较患者外周血循环肿瘤细胞、肿瘤原发灶和转移灶及转移淋巴结中单细胞基因组、转录组和表观遗传组的差异,避免肿瘤异质性的干扰,为认识肿瘤的生物学进程提供了全新视角。现综述了运用单细胞测序技术分析实体肿瘤外周血循环肿瘤细胞基因组变异的主要技术和研究进展。     

图神经网络在单细胞测序数据上的研究进展

单细胞测序技术使得科研人员能够以细胞级别的分辨率进行基因表达数据分析,以此发现组织(如肿瘤组织或器官组织)中具有异质性的细胞。这项技术对癌症病理学的研究、生命发育过程的探索等起到了重大推动作用。单细胞测序数据有着样本量大、特征多且稀疏的特点,因此近些年一些研究工作尝试使用图神经网络进行单细胞测序数据的挖掘。这些研究工作一般先根据细胞内的基因表达信息将单细胞测序数据转化为细胞图结构,然后使用图神经网络聚合细胞间邻域信息来进行细胞表示学习,并在细胞聚类任务和细胞类型标注任务上取得了很好的效果。本文旨在介绍图神经网络在单细胞测序数据挖掘上的研究进展,并设计实验展示scGNN、scGCN和scDeepSort三个主流的用于单细胞测序数据的图神经网络模型的性能。最后,结合研究进展与实验分析,本文对图神经网络处理单细胞测序数据这一领域的未来研究方向进行了展望,以促进图神经网络更好地服务于单细胞测序数据的挖掘。     

基于TransformerMGI的microRNA靶向基因预测

生物小分子microRNA可以对基因表达进行正向或负向调控,研究microRNA与基因之间的关系对于机体稳态的维持和疾病治疗都有着重要意义。利用深度学习方法对microRNA和基因靶向关系进行预测,提出了TransformerMGI模型。在特征工程阶段,针对生物序列潜在信息难以准确地提取这一问题,TransformerMGI模型分别采用了基于图卷积神经网络的GP-GCN方法和DNA2Vec模型对microRNA和基因数据的潜在信息进行提取,得到了二者的表征嵌入矩阵,在模型方面,TransformerMGI模型引入了幂归一化来改进经典的深度学习模型。利用microRNA和基因数据经过特征提取后得到两个表征矩阵,这两个矩阵分别被放入TransformerMGI模型中,通过TransformerMGI模型内部的Attention机制对二者自身和相互的特征信息进行了聚合和关联运算,最终预测出microRNA调控基因的概率。采用ROC曲线下面积和准确召回率曲线作为模型性能评价指标,将TransformerMGI与其他现有模型进行了比较评估。实验结果表明,TransformerMGI模型的AUC和AUPRC评分均可达0.91以上,优于现有的其他模型。TransformerMGI模型能在不考虑生物学原理和基因组背景的前提下,仅依赖microRNA和基因的碱基序列信息,实现microRNA靶向基因的预测,从而为后续的microRNA靶向基因预测研究提供了可借鉴的深度学习方法。     

基于新一代测序技术的mtDNA突变检测方法学的建立

目的:大量研究证实线粒体DNA(mtDNA)突变与肿瘤发生及进展密切相关,但使用传统测序方法难以高通量、高精确度的检测mtDNA突变,为此本研究建立了基于新一代测序技术的mtDNA突变检测方法.方法:提取肝癌患者癌、癌旁组织以及外周血细胞总DNA,利用PCR技术对线粒体基因组进行富集并对PCR产物进行平末端、粘性末端连接或对PCR引物进行氨基修饰,构建mtDNA测序文库.经Illumina HiSeq 2000平台测序后利用生物信息学方法与人类mtDNA参考序列进行比对,并进行测序数据分析.结果:通过对不同质量基因组DNA进行评估后,发现三对引物法适用于大部分DNA样本的mtDNA富集.进一步我们发现PCR引物的氨基修饰可显著提高测序数据覆盖均一性,降低测序成本.结论:本研究利用新一代测序技术通过对线粒体DNA富集方法以及测序覆盖度均一性进行优化,建立了一套灵敏、特异、高通量的mtDNA突变检测策略,为mtDNA突变与疾病研究提供了新方法.     

水稻蜡质基因第一内含子碱基突变引起其RNA二级结构的可能变化

通过体外转录得到籼稻品种232蜡质基因第一内含子5’端430 bp的ssRNA分子,以及在此区域发生了自然突变的粳稻品种寒丰蜡质基因第一内含子5’端同样长度的ssRNA分子。部分变性胶电泳结果表明两种ssRNA分子的迁移速率不同。将两种ssRNA分子的核酸序列用计算机分析,表明此两种ssRNA分子能形成不同的茎-环结构,自由能值也有差异。对突变引起的这些不同与两种水稻品种蜡质基因转录本剪接的差异进行了讨论。