辣椒疫霉RXLR型效应子PcAvh2的序列多态性、基因转录特征及功能

【目的】分析辣椒疫霉中RXLR型效应子PcAvh2的序列多态性,研究该效应子在辣椒疫霉生长发育和侵染阶段的转录特征及其生物学功能。【方法】本研究通过高保真扩增,分析2个烟草疫霉、1个恶疫霉和31个辣椒疫霉菌株的PcAvh2序列;提取辣椒疫霉菌丝、游动孢子囊、游动孢子、萌发休止孢和7个侵染时间点(1.5、3、6、12、24、36、72 h)的本氏烟根部总RNA,利用RT-qPCR分析PcAvh2的转录表达水平;利用PVX瞬时表达系统,分析PcAvh2是否抑制6种效应子(BAX、INF1、PsojNIP、PsCRN63、PsAvh241、R3a/Avr3a)激发的植物免疫反应;利用CaCl_2-PEG介导的原生质体稳定转化技术,沉默PcAvh2基因,分析辣椒疫霉致病力的变化。【结果】PcAvh2为典型的RXLR效应子,在辣椒疫霉群体中该效应子具有10个等位基因,而且烟草疫霉和恶疫霉中也存在该效应子。该基因在辣椒疫霉的侵染阶段上调表达,它能够抑制6种效应子激发的植物免疫反应,进一步研究发现基因沉默导致辣椒疫霉的致病力显著下降。【结论】RXLR型效应子PcAvh2是辣椒疫霉中一个重要的侵染致病因子。     

改良ATMT转化技术在深绿木霉基因敲除中的应用

木霉菌是环境中具有重要经济价值的丝状真菌之一。高效率的基因敲除技术是深入研究木霉菌功能的必要手段。研究改进了传统的农杆菌介导的遗传转化技术(ATMT),成功构建深绿木霉T23中碳代谢抑制因子cre1基因敲除突变株。首先查找深绿木霉全基因组序列,比对并扩增cre1基因侧翼序列,以改造后的p1300qh质粒为骨架构建cre1敲除载体p C1300qh:cre1-up∷hyg∷cre1-down,转化到农杆菌AGL-1。通过优化ATMT转化中木霉菌分生孢子浓度,改良培养方式和延长诱导转化时间等参数,获得最佳转化条件:木霉菌分生孢子浓度为8×10~6,筛选培养基改为IM培养基,诱导转化时间延长,成功筛选到可能的转化子10个。最后,经鉴定有1个转化子为cre1敲除转化子,9个为T-DNA随机插入。因此,为深绿木霉菌基因功能研究提供了可借鉴的高效便捷的遗传转化方法。     

禾谷镰刀菌中FgPDE1基因的敲除及其功能的研究

目的:旨在敲除禾谷镰刀菌Fusarium graminearum Fg PDE1基因,确定其缺失突变体表型,从而分析该基因的生物学功能。方法:应用Split-marker技术构建含有潮霉素基因敲除盒,通过PEG介导原生质体转化,PCR筛查抗潮霉素转化子以获得缺失突变体ΔFg PDE1,根据突变体表型变化及致病性的检测对Fg PDE1基因的功能进行分析。结果:采用Split-marker技术,成功构建了Fg PDE1基因敲除盒;PEG介导转化禾谷镰刀菌原生质体后成功获得转化子。经PCR筛查,得到3个PCR确认的敲除突变体;表型观察发现,ΔFg PDE1菌落的外型及菌落生长速度与野生型没有明显差异。孢子侵染西红柿果实实验证明:以西红柿为侵染宿主,相对于野生型,突变体致病性没有明显减弱;但突变体分生孢子产量显著下降。结论:Fg PDE1基因可能与禾谷镰刀菌分生孢子的形成有关。     

根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究

利用根癌农杆菌EHA105进行了哈茨木霉Th-33的转化,在优化的转化条件下,EHA105对木霉菌的转化效率约45-100个转化子/106个孢子。本实验室利用该方法已建立了含4000多个转化子的木霉T-DNA插入突变体库。随机挑选24个转化子进行遗传稳定性分析,结果显示转化子经过5代无选择压力连续转接后都能在选择平板上正常生长;潮霉素抗性基因的PCR扩增和Southern blot杂交分析表明,木霉转化子含有该基因,Southern blot杂交进一步表明转化子多为单拷贝随机插入。该转化体系的改进将有利于木霉菌生防功能基因的克隆和作用机制的研究。     

Split-marker 重组技术构建泛素C 末端水解酶基因缺失菌株

目的:对烟曲霉(Aspergillus fumigatus)泛素末端水解酶(creB)基因进行敲除。方法:通过氨基酸序列分析软件初步分析烟曲霉CreB蛋白结构.利用split-marker重组技术构建重组片段,并通过PEG-原生质体方法对烟曲霉野生菌株进行转化,采用PCR方法对转化子进行筛选,最后选取初步筛选的转化子进行测序鉴定。结果:结构分析显示烟曲霉CreB蛋白具有泛素特异蛋白酶(ubiquitin-processing protease)UBP亚家族六个结构域。本实验构建了转化片段并转化,在抗性平板中获得了25个Hyg抗性转化子,进一步采用PCR方法筛选到20个转化子,最终通过测序分析获得一株creB基因缺失菌株。结论:Split-marker重组技术是对烟曲霉creB基因进行敲除的快速有效的方法。获得的creB缺失菌株可用于基因功能研究。     

外源合成dsRNA介导大豆疫霉PsCdc14基因沉默后对孢子囊发育的影响

真核生物中,蛋白磷酸酶Cdc14在细胞有丝分裂过程中发挥着重要的调控作用.已有研究表明,在导致马铃薯晚疫病的致病疫霉病原菌中,Cdc14对游动孢子囊的形成过程起关键性的调控作用.但其在导致大豆根腐病的大豆疫霉病原菌中的作用机制还不清楚.实时定量PCR分析大豆疫霉PsCdc14在不同的生活史和侵染阶段的转录水平发现,PsCdc14在游动孢子囊形成、游动孢子和休止孢3个阶段具有较高的转录水平,但是在菌丝和侵染阶段转录水平很低.由此推测,PsCdc14在疫霉无性繁殖阶段发挥着重要的调控作用,进而影响病害的传播及蔓延.双链RNA（dsRNA）介导的转录后目的基因沉默是真核生物十分保守的一种调控机制.将体外合成dsRNA和聚乙二醇（PEG）介导的大豆疫霉原生质体转化技术相结合,建立了大豆疫霉dsRNA介导的瞬时基因沉默体系,并利用此体系对大豆疫霉中PsCdc14基因进行了功能分析.结果表明,体外合成的PsCdc14dsRNA转入大豆疫霉原生质体后,能够导致内源的基因转录水平显著下降,沉默转化子的游动孢子囊产量显著降低.本研究表明,利用dsRNA介导的瞬时基因沉默能够更加方便、快捷地分析大豆疫霉的基因功能,加深人们对大豆疫霉生长发育和致病机制的理解.     

高效大丽轮枝菌(Verticillium dahliae) 基因敲除体系的构建

[目的]为了深入研究大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)致病基因的功能,构建高效大丽轮枝菌基因敲除体系.[方法]融合PCR构建基因敲除载体;利用农杆菌介导法转化大丽轮枝菌;使用在T-DNA之间加入致死基因的双元载体,使T-DNA随机插入转化子在添加5-氟脱氧尿苷的培养基上不能存活,实现对随机插入转化子的"反向筛选".[结果]对大丽轮枝菌腺嘌呤合成酶基因和几丁质合成酶基因进行基因敲除验证,基因敲除转化子在总转化子中的比例分别达到87%和44%.[结论]成功构建大丽轮枝菌高效基因敲除体系,为大丽轮枝菌致病基因的功能验证提供了技术平台.     

3株抗水稻和荔枝病原菌的海洋真菌的分离鉴定

本研究采用平板对峙法和菌丝块法测定分离自广西北部湾的3株海洋真菌MF-3、MF-6和MF-13的抗荔枝和水稻病原菌抗菌活性,并通过形态学观察结合分子生物学方法鉴定其分类地位。结果表明,当采用平板对峙法时,3株海洋真菌对荔枝霜疫霉、炭疽病菌、水稻纹枯病菌和水稻稻瘟病菌等4种指示菌的菌丝生长均有强的抑制作用;菌丝块法试验结果发现3株真菌的发酵液均对荔枝霜疫霉菌有很好的抑制效果,菌丝相对生长抑制率分别达到94.29%、98.16%和86.37%,对水稻纹枯病病原菌抑制效果次之,其菌丝相对生长抑制率达到80%左右;其中,MF-3菌株对荔枝霜疫霉、炭疽菌、水稻纹枯病菌和水稻稻瘟病菌都有较好的抑制作用,MF-6对霜疫霉、水稻纹枯病菌和水稻稻瘟病菌也有较好的抑菌效果和广谱性。结合形态学观察和ITS rDNA序列比对分析,初步将MF-3鉴定为布雷正青霉(Eupenicillium brefeldianum),MF-6为微紫青霉(Penicillium janthinellum),MF-13为短棒曲霉(Aspergillus clavatonanicus)。耐盐度试验结果表明这3株真菌是适应海洋环境的兼性海洋真菌。该3株海洋真菌表现的抗真菌活性,对应用于荔枝或水稻病害的生物防治和新型农药的研发有潜在的应用价值。     

6种植物提取物对荔枝霜疫霉的抑制作用

采用菌丝生长速率法测定了双氢青蒿素、厚朴酚、辣椒碱、青蒿琥酯、蛇床子素以及蒿甲醚6种植物提取物对32个采自广东,福建以及海南的荔枝霜疫霉菌菌株的抑制作用,以期为后期植物源农药的开发提供基础。结果显示,6种植物提取物对供试的32个菌株均有一定的抑制作用,以厚朴酚的抑制作用最好,双氢青蒿素次之,其它4种植物提取物的抑制作用相对较差,但均未出现不抑制现象。6种植物提取物对荔枝霜疫霉菌均有用于开发防治荔枝霜疫霉的植物源农药的潜力,以厚朴酚最佳。     

丝状真菌瑞氏木霉外源基因表达系统的构建

采用PCR技术体外扩增获得了瑞氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ (CBHⅠ )启动子和终止子序列 .并以大肠杆菌质粒pUC1 9为骨架 ,在该启动子和终止子序列间加入多克隆位点 ,构建了瑞氏木霉强表达整合型载体pTRIL .以质粒pAN7 1为模板 ,体外扩增了带有潮霉素磷酸转移酶(hph)基因的DNA片段 ,将hph插入pTRIL的cbh1启动子和终止子序列之间 ,构建了Pcbh1 hph Tcbh1表达盒 .用此表达盒转化瑞氏木霉C30原生质体 ,在潮霉素平板上得到 1 5株抗性转化子 .对其中的H1转化子进行了PCR和Southern印迹分析 ,证实hph基因确实整合到转化子染色体DNA上 ,并在Pcbh1 启动子控制下进行高效表达 .转化子H1对潮霉素抗性达 1 5 0mg L ,比出发菌株提高 2倍 .瑞氏木霉强表达整合型载体pTRIL的构建成功为开展瑞氏木霉分子生物学研究以及进一步的工程菌株构建工作奠定了基础     

马铃薯致病疫霉研究进展

马铃薯致病疫霉(Phytophthora infestans)属卵菌纲(Oomycetes)霜霉目(Peronosporales)腐霉科(Pythiaceae)疫霉属(Phytophthora),是马铃薯和番茄晚疫病病原菌。由于晚疫病对马铃薯生产的毁灭性和严重性,对致病疫霉的研究一直是关注的重点。本文首先对病害引起的症状、发生特点及流行规律进行阐述,对有性生殖发生的遗传规律和多种交配型共存的大环境下病原菌群体结构变异特点进行归纳总结。随着2009年致病疫霉基因组测序的完成,本文比对了疫霉属目前已完成测序各个种的基因组学特点,介绍了致病疫霉在效应子克隆方面的研究进展及线粒体基因组研究现状,阐述了功能基因组学的两个重要技术:高密度遗传连锁图谱(high density linkage mapping)和全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS),及其在挖掘致病疫霉重要功能基因上的应用。本文有助于了解致病疫霉研究热点及后续突破方向,可为深入解析致病疫霉的功能基因及致病机制提供参考,对开发马铃薯晚疫病菌药物靶标及预测病害的大规模流行趋势也具有重要意义。     

一株阴环炭团菌(香灰菌)转化子形态变异的成因

遗传转化方法是基因功能研究的重要方法之一,但在转化过程常出现转化子变异的现象,影响目标基因功能的判断。本文以阴环炭团菌菌落形态特征异常的拟基因TJAS01-V10012900敲除菌株12900-5为研究对象,通过PCR手段验证基因敲除的真实性,基因组重测序分析各转化子在基因敲除区域以及基因组其他区域的差异,转录组测序比较12900-5与其他转化子在基因表达层面的差异。比较基因组发现,12900-5与12900-6菌株在潮霉素抗性基因插入位置与片段一致,且不存在多拷贝现象。12900-5菌株有两个特异SNP位于不同的基因,一个与细胞周期S期有关,另一个与囊泡转运有关,两者均与菌丝生长有关。由此推测,转化子12900-5形态特征异常很有可能与这两个非靶标位点突变有关。转录组分析结果发现12900-5菌株在氨基酸代谢通路、翻译过程等多个代谢与信号途径基因的表达量明显下降。本研究例证了转化过程存在的非靶标变异现象,但导致这种变异的原因仍需进一步研究。     

农杆菌介导的绿木霉遗传转化及重寄生缺陷突变体的筛选

绿木霉(Trichoderma virens)是一种重要菌寄生真菌,该菌已广泛应用于多种病害的生物防治上。本研究构建了双元载体pCATPH-I(GenBank登录号为：KC252999),并利用该载体成功实现了农杆菌介导的绿木霉遗传转化,转化效率可达385~460个转化子/106绿木霉分生孢子。转化子的PCR和遗传稳定性分析表明, T-DNA已整合进该菌的基因组中且在无选择压力的条件下能够稳定遗传。利用该转化体系成功建立了超过2000个转化子的转化子库,通过转化子与病原真菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)对峙培养在该转化子库中成功筛选到两个重寄生缺陷突变体,D441和A281。本研究的完成可为绿木霉的功能基因组学及重寄生分子机制的研究打下基础。     

三种猕猴桃根腐病致病菌多重实时定量PCR检测技术的建立及应用

[背景]近年来,随着猕猴桃种植面积的不断扩大,病害的频繁发生已逐渐影响猕猴桃的产量和品质。恶疫霉(Phytophthora cactorum)、樟疫霉(P.cinnamomi)和雪松疫霉(P.lateralis)是一类可以引起猕猴桃根腐病的致病疫霉菌。[目的]建立并优化可以同时检测3种致病疫霉的多重实时定量检测技术,并调查猕猴桃主要产区的致病菌分布情况。[方法]基于Ypt1 (ras-related protein gene)基因设计恶疫霉、樟疫霉和雪松疫霉的特异性TaqMan探针和引物,建立并优化多重实时荧光定量PCR检测体系。利用近缘种检验检测体系特异性并进行灵敏度测试,应用该检测体系分析猕猴桃主要产区根际土壤中3种致病疫霉的Yt1基因含量。[结果]供测试的11个恶疫霉近缘种、11个樟疫霉近缘种、13个雪松疫霉近缘种及非目标菌种DNA样品中均无荧光信号,反应结果为阴性,而在恶疫霉、樟疫霉和雪松疫霉DNA样品中分别检测出HEX、FAM和ROX荧光信号,反应结果为阳性。三种疫霉的检测灵敏度均达到100fg。此外,通过对猕猴桃主产区陕西省周至县和眉县果园共166份土壤样品的检测发现,恶疫霉的分布最广泛且Ypt1基因含量最高,樟疫霉和雪松疫霉则相对较少。[结论]建立的猕猴桃根腐病致病疫霉多重实时定量检测体系特异性强、灵敏度高,适合于恶疫霉、樟疫霉和雪松疫霉的检测及定量分析。该技术可为猕猴桃疫霉病害的早期诊断、监测及预防提供指导。     

荔枝霜疫霉的研究

对华南的荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii Chen ex Ko et al)的形态和营养特性进行了研究,并和新模式种进行了比较。发现此菌孢囊梗的生长是一种有限-无限生长类型,或称之为多级有限生长。即孢囊梗上的小分枝大多数是有限生长的,在其顶端同时形成孢子囊。但有时在同一孢囊梗上有的小分枝会继续生长,形成二级、三级甚至四级孢囊梗。在营养要求上与疫霉无大差别,能在天然和合成培养基上旺盛生长,需要硫胺素,ca~(++)和有机二元酸,能利用NH_4~+ 或No_3~-为其氮源,并能利用淀粉为其碳源,菌体匀浆中测出淀粉酶活性。根据孢囊梗的独特生长方式,我们认为完全有理由承认这菌是一个新属,并可成为新科,霜疫霉科。本文中已将霜疫霉科作了修改描述。孢囊梗已被修改为:孢囊梗多级有限生长。无疑这菌是腐霉科和霜霉科的中间类型。在营养类型与有性器官上和疫霉相近,而其孢子囊的形成和霜霉相似。但其孢囊梗的多级有限生长方式则和这两科都不相同。     

重组PCR技术的应用及优化

重组PCR是通过DNA重叠序列的衔接作用,使多个DNA分子融合在一起的体外扩增技术。它使基因全序列的拼接、基因融合、基因破坏及启动子交换等DNA操作变得简单易行。如今重组PCR已成为DNA分析的有效利器。本研究通过重组PCR在分子进化、基因敲除及基因敲入、启动子研究和转基因植物转化载体的构建等方面的实际应用,分析了该技术的影响因素,并针对引物设计、DNA碱基重叠长度、温度参数等重要反应条件提出了优化方案。     

红火蚁共生链霉菌Streptomyces sp. DF-5的分离培养及其发酵液对植物病原真菌的抑制活性研究

自入侵中国以来红火蚁Solenopsis invicta Buren受到广泛关注,明确与该蚁共生或者伴生的微生种类及其生物学功能具有重要意义。本研究从红火蚁工蚁体中筛选出一个共生菌株,观察、分析了其生长、生理生化特性和16S rRNA同源序列特征,应用菌丝生长速率法测定了该菌株发酵液滤液对3种植物病原真菌的抑菌作用。鉴定结果表明该菌株属于链霉菌属Streptomyces,命名为Streptomyces sp.DF-5,其发酵液滤液对常见植物病原真菌如荔枝霜疫霉病菌Peronophythora litchii、香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense和稻瘟病菌Magnaporthe oryzae具有较好的抑制效果,抑制率均在70%以上,其中对荔枝霜疫霉病菌的抑制效果高达94.5%。本研究可为利用红火蚁共生菌开发新型生物农药提供参考。     

哈茨木霉A25-2纤维二糖水解酶玉基因的克隆及其编码催化功能域的序列在绿色木酶HP35-3中的表达

本研究从哈茨木霉(Trichoderma harzianum) A25-2总RNA中利用RT-PCR的方法扩增到其纤维二糖水解酶I基因的cDNA序列,并对该基因编码的氨基酸序列进行分析,得到cbhI基因中编码催化功能域的序列。将催化功能域编码序列克隆到表达载体pCP-GH中,用PEG-CaCl2介导的原生质体转化方法将重组质粒转化到绿色木霉(Trichoderma viride) HP35-3中,筛选得到12个转化子。以p-NPC为底物,测定了该12个转化子的酶活力,获得比活力最高的转化子Tv/CDHl-CBM-5,其纤维二糖水解酶活力是HP35-3的3.8倍。SDS-PAGE分析表明,绿色木霉表达了导入的含A25-2纤维二糖水解酶I催化功能域的编码序列。     

pSH-CUP重组质粒的构建及面包酵母酸性海藻糖 酶基因的敲除

设计含有与面包酵母(Saccharomyces cerevisiae BY-6)编码酸性海藻糖酶ATH基因内部部分序列同源的长引物,以质粒pUG6为模板进行PCR构建带有Cre/loxP系统的敲除单元,转化面包酵母获得G418阳性克隆.将铜抗性基因(cuP1-MT1)导入Cre重组酶表达质粒pSH47,得到重组质粒pSH-CUZ,并转化阳性克隆,以铜抗性筛选面包酵母转化子.半乳糖诱导表达Cre酶切除Kanr基因.重组质粒pSH-CUP的构建,不仅解决了酵母转化子筛选标记问题和非酵母基因的引入,而且使LoxP-kanMX-loxP基因敲除体系在进行真核生物基因敲除时更加方便可行.     

核糖体基因ITS作为苎麻疫霉、恶疫霉分类辅助性状的研究

以2个雄器大多围生、少数侧生的苎麻疫霉菌株与1个雄器侧生、偶有围生的恶疫霉菌株为材料,采用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物,PCR扩增3个供试菌株核糖体基因的ITS1和ITS2,并对PCR产物进行了克隆和序列分析。结果是苎麻疫霉的ITS1和ITS2分别由206和453个碱基组成,而恶疫霉则分别由218和415个碱基组成。2个供试苎麻疫霉菌株的ITS1和ITS2的碱基序列同源性均分别为100%。苎麻疫霉和恶疫霉ITS1同源性为74.9%,其中中间区域40bp-164bp之间在两种间变异丰富,同源性只有59.4%,而1bp-39bp和165bp-239bp两区域的同源性分别为92.3%和92.1%;ITS2在两种疫霉菌间的同源性为71.0%。结果表明苎麻疫霉和恶疫霉ITS的碱基序列有明显差异。上述结果提示,ITS区域碱基序列可区分苎麻疫霉和恶疫霉。