hCGβ-CTP37多聚体在巴斯德毕赤酵母中的表达及其表达产物的结构预测

hCGβ-CTP37(简称CTP)肽段是hCG分子的特有部分,存在hCG的特异表位。为了解CTP利用毕赤酵母进行表达的情况及探索其作为研制调节生育和抗肿瘤疫苗的可行性,本研究中我们将2、3、4个CTP以头尾串联的方式重组成多聚体基因,然后克隆入载体pPIC9K得到表达质粒pPIC9K-Cα-(CTP)_n(n=2,3,4),电转染入酵母细胞进行表达。在培养基上清中我们检测到了目的基因表达产物,Westernblot结果显示它们的分子量分别约为:20KDa、30KDa、40KDa,且能与抗hCG多克隆抗体结合。另外,我们还利用ANTHEPROT4.3蛋白序列分析软件包对表达产物CTP四聚体的结构进行了预测分析,结果表明CTP四聚体的抗原性明显强于hCGβ-CTP37单聚体,CTP四聚体与hCGβ二级结构较为相似,但CTP四聚体的抗原专一性要优于hCGβ。CTP多聚体在毕赤酵母系统中的成功表达及对表达产物抗原性的初步分析为今后利用CTP研制调节生育和抗肿瘤疫苗奠定了基础。     

hCGβ-CTP37多聚体在巴斯德毕赤酵母中的表达及其表达产物的结构预测

hCGβ-CTP37(简称CTP)肽段是hCG分子的特有部分,存在hCG的特异表位。为了解CTP利用毕赤酵母进行表达的情况及探索其作为研制调节生育和抗肿瘤疫苗的可行性,本研究中我们将2、3、4个CTP以头尾串联的方式重组成多聚体基因,然后克隆入载体pPIC9K得到表达质粒pPIC9K-Cα-(CTP)n(n=2,3,4),电转染入酵母细胞进行表达。在培养基上清中我们检测到了目的基因表达产物,Western blot结果显示它们的分子量分别约为：20KDa、30KDa、40KDa,且能与抗hCG多克隆抗体结合。另外,我们还利用ANTHEPROT 4．3蛋白序列分析软件包对表达产物CTP四聚体的结构进行了预测分析,结果表明CTP四聚体的抗原性明显强于hCGβ-CTP37单聚体,CTP四聚体与hCGβ二级结构较为相似,但CTP四聚体的抗原专一性要优于hCGβ。CTP多聚体在毕赤酵母系统中的成功表达及对表达产物抗原性的初步分析为今后利用CTP研制调节生育和抗肿瘤疫苗奠定了基础。     

水稻CAT与逆境应答关系及酶活性分析

过氧化氢酶(catalase,CAT)是一种四聚体血红素酶,主要存在于过氧化物酶体与乙醛酸循环体及相关细胞区域内.水稻中含有CAT1、CAT2和CAT3三种主要同工酶.它们在各组织不同的发育阶段,发挥着重要作用.在本研究解析了水稻过氧化氢酶同工酶基因在NaCl、NaHCO3、Na2CO3、PEG6000、H2O2、低温等逆境处理下mRNA表达特性.结果表明在不同的逆境下过氧化氢酶同工酶在表达上存在差异性.同时利用蛋白表达系统,对水稻过氧化氢酶CAT1和CAT3蛋白进行了纯化实验,对纯化的蛋白的酶活性分析的结果表明,CAT1和CAT3的酶活性没有十分显著的差别.     

水通道蛋白研究动态

水通道蛋白是对水专一的通道蛋白,它普遍存在于动、植物及微生物中,不同水通道蛋白之间具有类似特征.哺乳动物中水通道蛋白主要分为六类,分布于水分代谢活跃的器官中;植物除了质膜上水通道蛋白外,液泡膜也存在着水通道蛋白,它们在植物生长,发育及胁迫适应中起着重要作用.目前有关水通道蛋白的详细的结构和功能信息主要来自对红细胞膜上水通道蛋白的研究,它由同源的四聚体组成,每个单体具有独立的水通道功能,四聚体在膜上分布具有不对称性,在膜内侧四聚体呈伸展状态,在膜外侧形成大的中心空腔.     

加载HCMV抗原肽的HLA-A*0201单体及其四聚体制备和鉴定

细胞毒T淋巴细胞(CTL)在控制病原体感染以及抗肿瘤过程中发挥重要作用,因而特异性CTL的检测相当重要;而过去检测CTL的方法都是间接的,最近发展起来的四聚体技术则是直接检测抗原特异性CTL的有效而特异的方法,成为目前研究T细胞免疫应答的关键技术。报道一种简化的四聚体制备程序,利用该程序成功制备加载人巨细胞病毒(HCMV)抗原肽的HLA-A2四聚体,具有特异性结合CTL活性。HLA-A*0201重链基因是通过RT-PCR方法从HLA-A2⁺供者白细胞中克隆,进而以PCR方法构建在羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A*0201(A2)重链胞外区原核表达载体, A2重组蛋白在大肠杆菌中得到高表达,主要以包涵体形式存在。加载抗原肽的可溶性A2单体是A2胞外区在轻链β2微球蛋白和HLA-A2限制性HCMV pp65_495-503抗原肽(NLVPMVATV,NLV)存在时通过稀释法复性获得,以BirA对其进行生物素化,然后以阴离子交换树脂纯化,得到的纯化A2-NLV单体与Streptavidin_PE按4:08比例混合形成四聚体,结合程度在85％以上,流式细胞仪分析显示该四聚体具有与HLA-A2+供者的特异性CTL结合活性。总之,这种简化的四聚体制备程序,不仅有利于该技术的推广,为特异性T细胞免疫研究建立必要的技术平台,而且A2-NLV四聚体在临床监测CMV特异性CTL水平等方面也有应用价值。     

OVA—接头—β2m融合基因的构建及体内特异性CTL的诱导

构建融合基因OVA 接头 β2m的表达载体 ,通过接头 (linker)序列使 β2微球蛋白 (β2m)与肽段共价结合 ,限制其在体内的扩散 ,以期获得更具潜力的免疫原结构。采用PCR技术 ,从人肝癌细胞株SMMC 772 1中克隆人 β2m基因 ,拼接上卵白蛋白 (OVA) (2 5 7— 2 6 4 )序列及接头后 ,克隆入 pET 4 2b( )高效表达载体进行诱导表达。对表达产物进行纯化与复性后 ,用其作为免疫原诱导特异性CTL ,并构建H 2Kb 四聚体检测特异性CTL。应用H 2Kb 四聚体对特异性CTL检测结果与经典的细胞毒试验一致 ,同时对胞外IFN γ进行了定量检测。结果表明 ,OVA 接头 β2m的表达产物可有效诱导体内特异性CTL反应 ,在体外构建MHC I类分子四聚体 ,为特异性T细胞的检测提供了有利的工具     

禽流感病毒M2蛋白研究进展

禽流感病毒M2蛋白是由97个氨基酸残基组成的同源四聚体,大量表达于感染细胞的表面,具有对病毒脱壳和出芽起重要作用的离子通道活性。M2蛋白不仅可诱导机体产生抗体,而且是CTL的靶抗原,因此可作为研究流感亚单位疫苗的靶蛋白。     

人β2-微球蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

β2-微球蛋白(β2m)是主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子的轻链部分,为制备MHCⅠ类分子四聚体的必要成分。根据已报道的序列设计特异引物,利用RT-PCR方法从人白细胞中克隆了β2m基因,并构建了成熟β2m的原核表达载体,在大肠杆菌中得到高效表达。表达的β2m大部分在包涵体中,经洗涤、变性和复性,并以强阴离子交换柱层析纯化,获得SDS-PAGE纯的人重组β2m,Western印迹法分析表明该蛋白具有与抗人天然β2m抗体反应的特性。此工作为制备MHCⅠ类分子四聚体奠定基础。     

毛竹脱氧辛糖酸-8-磷酸合酶的原核表达、纯化及酶的特性

脱氧辛糖酸-8-磷酸合酶(3-Deoxy-D-manno-octulosonate 8-phosphate synthase,KDO8PS)是一种参与细胞壁八碳糖(KDO)合成代谢的关键酶之一。为了解该酶催化特性和功能,本实验采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法首次分离得到毛竹Pe KDO8PS基因。序列分析表明该基因CDS区全长876 bp,编码291个氨基酸。通过IPTG诱导,含有该基因的原核表达载体在大肠杆菌中获得了大量可溶性活性蛋白表达;经Ni-NTA亲和层析和分子筛层析(SEC)方法进行酶蛋白的两步分离纯化,得到纯度大于90%以上的高纯度酶;SEC结果发现,纯化后目的蛋白KDO8PS在溶液中主要以二聚体形式存在。戊二醛交联实验证实该酶具有形成二聚体/四聚体的可能性,进一步通过超速离心(AUC)分析,发现水溶液中KDO8PS在高浓度时二聚体会聚合转化形成四聚体。推测形成二聚体/四聚体可能是保持酶稳定性的一种机制。通过测定毛竹KDO8PS酶学性质,发现该酶催化反应的p H值范围在4.0-9.0,最适p H值为8.0;热稳定性范围25-65℃,最适作用温度为55℃;各种二价金属阳离子在低浓度下均对酶活性存在不同程度的抑制作用,其中以Fe3+对酶活性的抑制作用最强,而低浓度EDTA可通过螯合作用消除金属离子的抑制作用。以上研究结果为植物KDO8PS蛋白结构与功能及其在新型抗生素领域中的工业化应用提供了重要理论基础。     

HLA-A*2402-BSP在大肠杆菌中的优化表达及其四聚体的制备和鉴定

HLA-A*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒(HCMV)特异性细胞毒T细胞(CTL)免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A*2402重链胞外域融合蛋白(HLA-A*2402-BSP)的表达载体,但该载体不能在大肠杆菌(E.coli)中有效表达HLA-A*2402-BSP融合蛋白;通过对氨基端(N端)区域编码区的密码子进行优化,构建了同义突变的HLA-A*2402-BSP表达载体,融合蛋白在E.coli中获得了高效表达。进而制备了负载HLA-A*2402限制性HCMVpp65341-349抗原肽(QYDPVAALF,QYD)的可溶性HLA-A*2402-QYD单体分子和四聚体,获得的四聚体具有与HLA-A24 供者抗原特异性CTL的结合活性,特异性CTL的频率为总CD8 T细胞的0·09%～0·37%。这些结果为进一步研究HLA-A*2402限制性的特异性CTL免疫应答规律奠定基础。     

纳豆激酶基因工程研究进展

纳豆激酶是由纳豆芽孢杆菌(Bacillussubtillisnatto)分泌的一种具有纤溶作用的碱性丝氨酸蛋白酶。对纳豆激酶基因的克隆与表达,基因与蛋白质结构以及基因工程纳豆激酶的特性和功能进行了综述。     

斑马鱼基因工程的研究进展

对国内外斑马鱼基因工程研究进展。包括最近获得的大批转基因斑马鱼品系、靶向筛选的转基因斑马鱼、斑马鱼转基因技术的发展和斑马鱼基因工程的热点问题与应用前景进行了综述。指出我国已建立日趋成熟的斑马鱼转基因技术、细胞核移植技术和染色体组操作技术,具有斑马鱼细胞遗传学和胚胎学基础,我国有望在不久的将来获得定向整合的基因工程斑马鱼,并推动生物技术应用研究领域的进步和发展。     

我国淡水养殖鱼类育种的实践和思考

用于鱼类育种的传统方法 ,如引种驯化、选种和杂交 ,虽然有其自身的局限性 ,但都是行之有效的 .自本世纪 70年代以来兴起的生物工程技术 ,已应用于鱼类育种 ,如细胞工程中的雌核发育、多倍体形成和性别控制等方面都取得了较好的成效 .80年代以来 ,基因工程技术也已用之于鱼类育种的研究中 ,并取得了一些成效 .实践证明 ,基因工程育种离生产尚有一定距离 .根据当前的实际 ,鱼类育种仍然离不开传统方法 ,应该是细胞工程和传统方法相结合 ,或是细胞工程和基因工程相结合 ,或是传统方法、细胞工程和基因工程相结合的综合技术育种     

新一代转基因植物研究进展

转基因植物具有抗病、抗虫、抗逆、高产、营养成分改善等优良性状,但其安全性引起了人们的关注。新一代植物转基因技术,如叶绿体基因工程、基因约束、多基因共转、去除抗性标记基因、对外源基因进行实时监控、抗性管理策略、最小程度地改变基因等技术的发展,将使未来的转基因植物更好地适应人们的需求,更有利于消费者食用安全和生态环境的可持续发展 。     

植物抗寒基因工程研究进展(综述)

低温是严重影响植物生存的因素之一。本文综述几种转植物抗寒基因：转抗冷诱导基因、转脂肪酸去饱和酶基因、转抗氧化酶基因工程的研究概况,并探讨今后的研究方向。     

蓝藻基因转移系统的选择与建立

蓝藻是一类进行光合放氧的原核生物 ,因其结构的特殊性 ,已成为表达外源基因的理想宿主之一。然而外源基因转化系统的选择与建立一直影响着蓝藻基因工程的快速发展。总结了各类蓝藻基因转移系统的特点、影响因素、各系统间的优缺点、以及不同蓝藻株系最适基因转移系统的选择等 ,为利用蓝藻进行遗传操作提供可能 ,为蓝藻基因工程发展提供信息。     

雄性不育基因工程及其在园艺植物中的应用

利用基因工程创造植物雄性不育是近年研究的活跃领域之一。本文较全面地综述了创造雄性不育的各种基因工程途径,包括通过核酸酶基因的特异空间表达、使胼胝质提前降解、利用反义基因、改变某些激素含量与比例、导入细胞质雄性不育的有关基因、将特异启动子与催化产生某种毒素的酶基因结合转化植物、通过共抑制、通过双重转基因系杂交及一些新的设想如RNAi、凋亡;及上述不育系的保持与恢复的各种基因工程途径,包括利用引起雄性不育基因的抑制基因、利用雄性不育基因的反义基因、通过化学调控、利用定位重组系统。文中还尽可能列出了上述技术在园艺植物中的应用情况,并就该技术存在的问题与发展前景进行了探讨。     

酵母表达基因工程产物特性分析

阐述了酵母表达系统在表达外源基因特别是大分子真核生物基因方面的优越性,分析了由于酵母表达系统的局限性如聚合体的存在、信号肽加工不完全、内部降解等而造成的产物不均一现象,提出了相应的解决方法。     

Engineering Streptomyces tenebrarius to synthesize single component of carbamoyl tobramycin

Aims: To engineer Streptomyces tenebrarius for producing carbamoyl tobramycin as a main component. Methods and Results: The aprH‐M gene fragment (apramycin biosynthetic gene from GenBank) in S. tenebrarius Tt49 was knocked out by genetic engineering to form S. tenebrarius T106 (△aprH‐M). Compared to the wild‐type strain, mutant strain T106 (△aprH‐M) no longer produced apramycin, while mainly synthesize carbamoyl tobramycin. TLC and HPLC‐MS analyses indicated that the mutant strain significantly increased the production of carbamoyl tobramycin. Conclusions: The metabolic flow for the apramycin and its analogues biosynthesis was blocked by disrupting the aprH‐M gene clusters. The aprH‐M gene clusters might be essential for the biosynthesis of apramycin. The mutant strain T106 mainly synthesized carbamoyl tobramycin. Significance and Impact of Study: The mutant T106 mainly produces carbamoyl tobramycin without synthesizing apramycin, which will reduce cost of postextraction from fermentation products. Therefore, it has good prospects for industrial application.     

植物抗病基因工程的研究进展

对植物抗病基因工程的原理、抗病基因、转化方法等方面的进展进行了综述,并对抗病基因工程的应用前景做了展望。