人肿瘤坏死因子衍生物b cDNA的构建与表达

构建了人肿瘤坏死因子缺失1～7位和102～107位共13个氨基酸编码序列的cDNA,即人肿瘤坏死因子衍生物b(rhTNFαDb),转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导后,目的蛋白的表达量占菌体总蛋白量的30%～60％。其中可溶性rhTNFα Db蛋白约占超声上清总蛋白的40%。经柱层析纯化后,目的蛋白纯度达95%以上。以L929细胞株检测rhTNFα Db的细胞毒活性,测得rhTNFα Db的比活性为2×10⁸IU/mg。较rhTNFα 原型提高一个数量级。rhTNFα Db的体内外抑瘤试验也取得了初步结果     

利用Ph电极流加葡萄糖培养重组大肠杆菌生产人α-肿瘤坏死因子的研究

应用一种新型的pH电极流加葡萄糖方法,用于培养重组大肠杆菌生产人α-肿瘤坏死因子。流加后培养液中菌体OD₆₀₀达到9.0,而α-肿瘤坏死因子的比活保持1.05±0.11×10⁵u/mg。与指数流加方法比较,二者能达到的最大菌体密度相近,而利用pH电极流加葡萄糖更具有设备简单,操作方便的特点。     

人α型肿瘤坏死因子基因在昆虫细胞中的表达

将人肿瘤坏死因子α(Tumoor Necrosis Factor α,TNF-α)cDNA片段克隆到转移载体pat610上．然后与苜蓿尺蠖核型多角体病毒(Autogropha californica Nuclear PolyhedrinVirus,AcNPV)DNA共转染草地贪夜蛾细胞(Sptodoplet frugiperda)Sf21,获得含hTNF-a基因的重组病毒。以L929细胞毒方法测得重组病毒感染Sf21细胞72小时时的表达量最高,为1．0×10^-4u／lO 6细胞;同时,培养液中小牛血清浓度对hTNF－α表达量有较大影响,当浓度为6%时hTNF—α表达量最高．感染72小时表达量可达5．2×10⁴u／1O⁶细胞,ELISA实验结果证明其产物确为hTNF—α。     

利用pH电极流加葡萄糖培养重组大肠杆菌生产人α—肿瘤坏死因子？…

应用一种新型的ｐＨ电极流加葡萄糖方法,用于培养重组大肠杆菌生产人α－肿瘤坏死因子。流加后培养液中菌体ＯＤ６００达到９．０,而α－肿瘤坏死因子的比活保持１．０５±０．１１×１０＾５ｕ／ｍｇ。与指数流加方法比较,二者能达到的最大菌体密度相近,而利用ｐＨ电极流加葡萄糖更具有设备简单,操作方便的特点。     

重组人肿瘤坏死因子α(hTNFα)衍生物发酵条件的研究

本文对一种新型重组人肿瘤坏死因子衍生物（命名为ｈＴＮＦＤ）的发酵条件进行了初步研究。通过实验优化选择了适宜该衍生物表达的培养基、ＩＰＴＧ使用浓度、诱导时期以及诱导时间的长短等,并在５０Ｌ发酵罐进行了中试规模的放大培养,菌体的收获量湿重可达１６４３ｇ／Ｌ,ｈＴＮＦＤ表达量占总蛋白的６０％,纯化的衍生物比活为１０１×１０１０Ｕ／ｍｇ,比原型ｈＴＮＦα提高了４６５倍,具有潜在的临床应用价值。     

人干扰素α-2b生产工艺的研究

人干扰素α-2b的简易、高效生产工艺研究,包括高效率、小型化的发酵技术．不用单克隆抗体亲和层析的纯化工序．以及大肠杆菌表达的人干扰索α-2b包涵体蛋白的天然构型复性等问题．从10L基因工程大肠杆菌发酵液所得l000g菌体中得人干扰素α-2b约500mg,效价为l×10³u／mg,设备投资少,生产成本低,产品表现了高纯度、高效价。适宜大量生产,为广大人民群众提供廉价高质量药品创造了条件。     

恒pH葡萄糖流加方法培养重组大肠杆菌生产人肿瘤坏死因子-α及其动力学研究

研究了一种新型的流加方法──恒pH流加葡萄糖法,用于培养重组大肠杆菌生产人肿瘤坏死因子-α。流加后培养液中菌体OD(600)达到9．0,是在LB培养基培养的15倍,而α-肿瘤坏死因子的比活保持（1．05±0．11）×105u/mg,并建立了菌体生长的动力学方程。     

重组人α2a干扰素的高效表达与纯化

构建了人α2a型干扰素的表达载体,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量平均为10~ IU/L菌液。还对其表达产物进行了纯化。经盐酸胍裂解菌体、硫酸铵沉淀、酸化处理,再经阴、阳离子交换层析和单克隆抗体亲和层析,使表达产物纯化了1072倍,比活性达1.2×IO~ IU/mg蛋白,达到序列纯,回收率达54％。表达产物N端21个氨基酸序列分析结果与IFN-α2a cDNA推导的序列相符合。     

应用痘苗病毒载体在动物细胞中高效表达人α-瘤坏死因子cDNA及其特性的研究

构建了含不同长度的人α-肿瘤坏死因子(hTNF-a)cDNA的两种重组痘苗病毒。hTNF-α cDNA插入痘苗病毒(天坛株)的tk区,在11k启动子的控制下,表达量可达1.6×10~7U/L,如果缩短hTNF-α cDNA起始密码子ATG与启动子之间距离并去除3′端非编码区,可使hTNF-α的表达量提高3倍。表达产物的细胞毒活性可被抗hTNF-α单克隆抗体所中和,免疫沉淀产物的SDS-PAGE有一特异性17kD的蛋白条带;同时,在细胞毒活性相同的前提下,哺乳动物细胞表达的hTNF-α的抗病毒活性高于大肠杆菌表达的hTNF-α。     

恒pH葡萄糖流加方法培养重组大肠杆菌生产人肿瘤坏死因子—α及？…

研究了一种新型的流加方法－恒ｐＨ流加葡萄糖法,用于培养重组大肠杆菌生产人肿瘤坏死因子－α。流动后培养液中菌体ＯＤ６００达到９．０,是在ＬＢ培养基培养的１５倍,而α－肿瘤坏死因子的比活保持（１．０５±０．１１）×１０＾５ｕ／ｍｇ,并建立了菌体生长的动力学方程。     

脓毒症患者血清TNF-α与T淋巴细胞亚群、凝血功能及预后的关系研究

摘要 目的：探讨脓毒症患者血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与T淋巴细胞亚群、凝血功能及预后的关系。方法：选取2017年4月~2019年4月期间我院收治的脓毒症患者93例作为脓毒症组,另选取同期来我院行健康体检的志愿者90例作为对照组,比较脓毒症组、对照组的TNF-α、T淋巴细胞亚群、凝血功能,根据28d后转归情况分为死亡组和存活组,比较死亡组和存活组TNF-α、T淋巴细胞亚群水平、凝血功能,采用Pearson相关分析分析TNF-α与T淋巴细胞亚群、凝血功能的相关性。结果：脓毒症组TNF-α高于对照组,凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）长于对照组,而CD3⁺、CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺均低于对照组（P<0.05）;脓毒症组、对照组CD8⁺比较差异无统计学意义（P>0.05）。死亡组TNF-α高于存活组,PT、APTT长于存活组,而CD3⁺、CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺均低于存活组（P<0.05）;死亡组、存活组CD8⁺比较差异无统计学意义（P>0.05）。Pearson相关分析结果显示,脓毒症患者血清TNF-α与PT、APTT呈正相关,与CD3⁺、CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺呈负相关（P<0.05）;TNF-α与CD8⁺无明显相关性（P>0.05）。结论：脓毒症患者血清TNF-α、T淋巴细胞亚群、凝血功能均存在异常变化,TNF-α与患者的T淋巴细胞亚群、凝血功能和预后有关,检测TNF-α有助于评估脓毒症患者的病情和预后。     

利用带有原核增强子样序列的新型载体在大肠杆菌中高效表达人α肿瘤坏死因子

将去除信号肽的人肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)cDNA插入到带有原核增强子样序列Px的新型表达载体pBV320中,使TNF cDNA 5′端直接置于大肠杆菌trp启动子下游,采用37℃恒温培养,使TNF在大肠杆菌中获得了高效表达,表达活性达1.35(±0.17)×10~6U/L菌液。表达的TNF-α对L929细胞的毒性作用可被抗人肿瘤坏死因子-α的单克隆抗体所中和。表达菌裂解液作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,显示有一条分子量与TNF分子量吻合、约为17000道尔顿的蛋白带。利用DEAE-Sepharose阴离子交换层析及Sephacryl S-200凝胶过滤对上述重组人TNF-α进行纯化,获得电泳纯产品,比活性为1.48×10~6U/mg。     

葡萄糖氧化酶产生菌Z—l—C的分批发酵与恒化培养

本文对葡萄糖氧化酶产生菌z—I—c的分批发酵与恒化培养进行了研究。实验发现,在以葡萄糖为生长限制性基质的恒化培养中,该产生菌的维持系数为O．04 g葡萄糖／g菌体．H,生长得率系数Y^max_G=O．714 g菌体／g葡萄糖,最大比生长速率μmax=O．385h^-1,饱和常数Ks=4．76g/L,理论最适稀释度Dm=0．260h^-1,最大酶比活(E／x)max为2．16×10³μ／mg,其值较分批发酵的最大酶比活(1．5l×10³μ／mg)提高43％。当向恒化培养的补料培养基中添加0．02％的α-甲基-D-葡萄糖时,由于该葡萄糖结构类似物的诱导作用,可使(E／x)max达3．11×10³μ／mg,较分批发酵之值提高106％。     

产气肠杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆和表达及影响重组酶活性的因素

用PCR方法从产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)中克隆出09kb的DNA片段,经DNA测序证明是α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase,α-ALDC)基因。将α-ALDC基因重组到质粒pBV220后,转化大肠杆菌,经筛选获得高效表达的重组子菌株。重组α-ALDC基因表达量占菌体总蛋白量的27%。酶活检测表明重组子细胞表达的α-ALDC活性是产气肠杆菌的12000倍。另外,粗提的重组α-ALDC的最适pH为6.5～7.0,pH稳定范围为5.5～8.0,适合的温度为35～45℃。Ba²⁺、Cd²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Sn²⁺可提高重组α-ALDC的活性。氨基酸修饰剂可降低其活性。     

λ[ 3H]DNA的制备和酶制剂中污染的核酸外切酶的检测

本文介绍一种简便制备λ[ ³H]DNA的方法。用该方法制备λ[ ³H]DNA,每升培养物可得10mg以上的产物。比放射性为6.75×10⁴cpm／μGλDNA,酸不溶的放射性产物达99%以上。用单链和天然的λ[ ³H]DNA作底物,能方便地检测出酶制剂中极微量的核酸外切酶Ⅰ与Ⅱ和Ⅲ的污染活性。     

人γ－干扰素生产工艺的研究

采用高密度发酵法发酵重组人γ－干扰素产生菌SW－INF／DH5α并成功地获得高表达、高产量的菌体,表达的γ－干扰素蛋白占菌体总蛋白的60％以上,20L发酵液可收获2kg(湿重)菌体。纯化过程中采用尿素抽提、稀释、复性、浓缩后通过Sephacryl S-200柱的纯化方法。简化了纯化步骤,缩短周期,提高了蛋白回收率。纯化中来采用单抗亲和层析技术,使产品更为安全可靠。最终产品经SDS－PAGE检测纯度达100％,核酸含量和热原均合格,A280／A260>1．5．比活性达1×10⁷IU／mg,总回收率达40％。这说明整个工艺适宜大规模生产的需要,具有实际应用价值。     

抗人重组肿瘤坏死因子(rHTNFα)单克隆抗体的研制

肿瘤坏死因子(TNF)对许多肿瘤细胞具有细胞毒和抑制生长的作用。为进一步研究TNFα的结构和功能,并为临床研究提供rHTNFα纯品。本实验应用杂交瘤技术制备了一组抗rHTNFct单克隆抗体3、H₂、B₃,B₅、E₆、Zl₂、Z₈和Z₂₀)。ELISA结果证实它们鼻rlL－1、rlL-2、rlFNγ、rlFNα₁及E．Coli菌裂解液(MM₂₉₄)无均交叉反应,仅与rHTNFα有反应。Western blot结果进一步证实这组抗体对rHTNFα的特异性。这组抗体具有不同程度中和rHTNFα细胞毒能力。用抗rHTNFα抗体制备的亲和层析柱纯化rHTNFα,可以得到在SDS-PEAG上分子量为17000道尔顿的rHTNFα纯品。     

人干扰素α 2b-胸腺肽α 1融合基因在家蚕细胞中的表达和活性研究

根据细胞因子协同作用的特点,采用重组DNA技术构建了人干扰素(IFN)α2b-胸腺肽(THY)α1融合基因,克隆到pBacPAK8上,获得重组转移载体pBacPAK-IFN-THY.与线形化Bm-BacPAK6病毒基因组DNA共转染家蚕细胞,经过体内重组,筛选到重组病毒Bm-BacPAK-IFN-THY.将Bm-BacPAK-IFN-THY感染家蚕细胞进行表达.DNA印迹证明IFN-THY已插入Bm-BacPAK6中（4 kb左右的杂交带）;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白质印迹证明IFN-THY在家蚕细胞中得到了表达（分子质量为23 ku左右）,且具有IFN蛋白的免疫原性;微量细胞病变抑制法和玫瑰花结法显示96 h的表达产物IFN活性为3.72×10⁴ U/ml,120 h表达产物IFN活性为3.10×10⁵ U/ml,48～72 h表达产物IFN活性较低;48～120 h表达产物的玫瑰花结形成率均在10％以上.结果表明融合基因在家蚕细胞中得到了高效表达,表达的融合蛋白具有IFN-α2b和THY-α1的双重生物活性.     

一种新型人TNF表达质粒的构建及在大肠杆菌中的高表达

在详细分析TNF结构及前人有关TNF结构与功能关系研究的基础上,应用PCR技术构建了一种新型人肿瘤坏死因子(TNF)分子的编码基因,并将该编码基因插入表达质粒,转化大肠杆菌,通过温度诱导获得了高表达.活性测定的结果表明,新型人TNF对L929细胞的细胞毒活性较原型人TNF升高了10³数量级.     

增加植酸酶基因appA-m的拷贝提高其在巴斯德毕赤酵母的表达量

为了进一步提高植酸酶的发酵效价,降低植酸酶生产成本,对毕赤酵母表达载体pGAPZα-A进行了改造。将表达载体pPIC9的AOX1启动子序列引入pGAPZα-A,使之成为甲醇可诱导型表达载体pAOXZα, 插入植酸酶基因appA-m后得到重组载体pAOXZα-appA-m 。以染色体上带有一个拷贝的appA-m基因、发酵效价可达到7.5×10⁶IU/mL发酵液的重组酵母菌株74#为受体菌进行转化,在该重组菌株的染色体上的另一位点整合含有植酸酶基因的表达盒,经筛选到高表达植酸酶的重组子。通过PCR进行验证,植酸酶基因被整合到重组酵母的染色体上,且受体菌中原有的植酸酶基因结构未改变。重组菌在5L发酵罐经甲醇诱导120h植酸酶蛋白表达量达到4mg/mL发酵液, 酶活性(发酵效价)达到1.2×10⁷IU/mL发酵液以上, 较含单拷贝植酸酶基因的受体菌株表达量有较大程度提高。PCR检测及表达量分析证明改良的菌株具有很好的遗传稳定性和表达稳定性。