利用恒溶氧．补料分批技术高密度培养大肠杆菌生产重组人骨形成蛋白-2A

对表达人骨形成蛋白２Ａ（ＢＭＰ２Ａ）的重组大肠杆菌ＹＫ５３７／ｐＤＨＢ２ｍ在５００ｍｌ摇瓶中进行了培养条件的摸索实验,继后用５Ｌ自控发酵罐进行分批培养和分批补料培养,以获取ｒｈＢＭＰ２Ａ。两种培养方式结果比较表明,在培养过程中保持３０％～４０％左右的溶解氧和限制性流加葡萄糖可以使ＢＭＰ２Ａ的含量达到２７８ｇ／Ｌ,最终菌体密度为ＯＤ６００５３（相当于干菌２１２ｇ／Ｌ）,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的２５％。该培养技术的关键是：（１）在培养过程中保持适当的溶解氧;（２）限制性流加葡萄糖;（３）４２℃起始诱导的时间控制在对数生长中期,持续表达时间为４ｈ;（４）细菌持续生长的比生长速率控制在０３ｈ１左右。     

人骨形成蛋白2A活性片段在大肠杆菌中的高效表达

将编码人骨形成蛋白２Ａ（ＢＭＰ２Ａ）Ｃ端１７３个氨基酸（ＢＭＰ２３）和１３４个氨基酸（ＢＭＰ２４）的ＤＮＡ基因片段分别重组克隆进入ＰＬ启动子控制下的表达载体,构建了表达质粒ｐＢＬＢＭＰ２３和ｐＢＬＢＭＰ２４,分别转化大肠杆菌进行表达研究．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析温敏诱导的表达菌,可以分别观察到分子量为２０ｋＤ和１５．５ｋＤ的高表达条带,与理论计算的分子量一致,表达量分别占细菌蛋白质总量的１０％和２０％左右。表达产物经包含体制备达到８０％以上纯度。Ｎ端序列测定的１５个氨基酸,与重组ｃＤＮＡ基因编码的序列相同．ＢＭＰ２３和ＢＭＰ２４包含体经复性处理后,得到二聚体分子蛋白质条带,与骨基质胶原重组后在大鼠体内测活,观察到ＢＭＰ２３诱导软骨细胞生成,ＢＭＰ２４刺激丰富的骨样胶原组织合成．     

重组人骨形态发生蛋白－2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性

报告了人骨形态发生蛋白－２（ＢＭＰ－２）成熟肽的基因克隆,及其在大肠杆菌中的表达。用ＡｆｌⅡ酶剪除ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ中的信号肽及前肽部分的序列,将编码成熟肽的ｃＤＮＡ３′端０．３６ｋｂ基因片段克隆于大肠杆菌表达载体ｐＭＸ－１质粒的ＡＴＧ下游,受控于ＰＬＰＲ启动子。重组子以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主细胞进行温度诱导表达。工程菌经４２℃６ｈ诱导后,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新蛋白带,分子量约为１２ｋＤ,约占菌体总蛋白的２０％。主要以包涵体形式存在的表达产物经初步纯化后,可获得纯度较高的重组人骨形态发生蛋白－２成熟肽（ｒｈＢＭＰ－２ｍ）。小鼠肌肉植入试验发现。ｒｈＢＭＰ－２ｍ植入后的不同时间,在局部出现间质细胞的聚集和增生、软骨细胞及软骨基质的生成和硬质骨的形成,证明ｒｈＢＭＰ－２ｍ具有明显的诱导新骨形成的作用。     

高密度发酵生产突变型重组人肿瘤坏死因子rhTNFα-DK2的研究

通过对发酵基质和发酵关键参数的优化,确定了发酵培养基的磷酸盐浓度为０．１５Ｍ,甘油浓度为１．２ｍｌ／Ｌ,补料中甘油浓度为２０ｍｌ／Ｌ,发酵过程中溶解氧控制在３０％～６０％,ｐＨ控制在６．８５左右。在５Ｌ在ＮＢＳ－Ｂｉｏｆｌｏ３０００型自动控制发酵罐中采取加速补料的补料分批培养,重组大肠杆菌ＹＫ５３７／ｐＳＢ－ＴＫ经１０ｈ３０°Ｃ培养和５ｈ４２°Ｃ诱导培养,最终密度达到６０ＯＤ６００,ｒｈＴＮＦα－ＤＫ２的表达量占菌体总蛋白的５０％以上,每升发酵液纯化可得到近２ｇ的ｒｈＴＮＦα－ＤＫ２。     

hBMP－2cDNA在COS细胞和小鼠肌肉中的表达

研究了骨形态发生蛋白ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ在ＣＯＳ细胞和小鼠肌肉中的表达的情况,从ｐＳＰＳ６５ＢＭＰ－２质粒中回收ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ,删除５＇端的非翻译序列,插入ｐＳＶＬ载体中,构建了含有ＢＭＰ－２全长编码序列的重组表达质粒ｐＳＶＬＢＭＰ－２。将表达质粒导入ＣＯＳ－７细胞中,细胞ＲＮＡ点杂交结果表明,转染ＢＭＰ－２基因的细胞内ＢＭＰ－２的ｍＲＮＡ水平明显升高;细胞培养上清的ＥＬＩＳＡ显示,转染ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ后,细胞分泌产生的ＢＭＰ－２显著增加。小鼠实验发现,在肌肉内用注射法导入ＢＭＰ－２重组质粒后,局部组织内ＢＭＰ－２的ｍＲＮＡ转录水平也明显提高。     

hBMP—2cDNA在COS细胞和小鼠肌肉中的表达

研究了骨形态发生蛋白ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ在ＣＯＳ细胞和小鼠肌肉中的表达的情况,从ｐＳＰＳ６５ＢＭＰ－２质粒中回收ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ,删除５端的非翻译序列,插入ｐＳＶＬ载体中,构建了含有ＢＭＰ－２全长编码序列的重组表达质粒ｐＳＶＬＢＭＰ－２将表达质粒导入ＣＯＳ－７细胞中,细胞ＲＮＡ点杂交结果表明,转染ＢＭＰ－２基因的细胞内ＢＭＰ－２的ｍＲＮＡ水平明显升高,细胞培养上清的ＥＬＩＳＡ显示,转染ＢＭＰ－２ｃ     

6—DMAP对小鼠卵母细胞减数分裂启动及孤雌发育作用

小鼠卵泡卵母细胞体外培养过程中加入２ｍｍｏｌ／Ｌ６－ＤＭＡＰ可抑制卵母细胞自发的染色持浓缩和生发泡破裂（ＧＶＢＤ）。源自超排的ＭⅡ期卵母细胞则能为６－ＤＭＡＰ所激活。ｈＣＧ注射后１８－１９ｈ的卵母细胞置于２ｍｍｏｌ／Ｌ６－ＤＭＡＰ的ＣＺＢ溶液中培养０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、３ｈ,卵母细胞的激活率分别为２６．１％、７５．２％、７５．８％、７７．３％、卵裂率分别为８８．２％、７３．２％、６７．０％、５８．     

重组人骨形态形成蛋白2在家蚕幼虫中表达及产物纯化

将编码人ＢＭＰ２ｃＤＮＡ基因插入昆虫杆状病毒转移载体ｐＢａｃＰＡＫ１,与修饰的家蚕核形多角体病毒Ｂｍ－ＢａｃＰＡＫＤＮＡ共转染家蚕细胞,通过同源重组得到含有在多角体蛋白基因启动子控制下的ＢＭＰ２ｃＤＮＡ基因的重组病毒Ｂｍ－ＢａｃＰＡＫ－ＢＭＰ２。用重组病毒感染家蚕幼虫,第五天ＢＭＰ２表达率最高,每毫升蚕血淋巴中约１０μｇ表达产物;表达产物在在体内被加工成Ｃ－端１６ｋＤ片段,以二硫键连结成分子量为３０ｋＤ的同源二聚体;经纯化获得９０％以上纯度的成熟ＢＭＰ２,与骨基质胶原结合后植入大鼠皮下,７天后在局部诱导生成软骨组织。     

Mn-SOD与抗癌胚抗原单链抗体基因的融合及高效表达

将Ｍｎ－ＳＯＤ与抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单链抗体基因（Ｓｃ－Ｆｖ ｇｅｎｅ）融合,重组到含Ｔ７启动子的表达载体ｐＥＴ－２２ｂ（＋）中,构建表达质粒ｐＥＴＭｎ－ＳＯＤ－ＳｃＦｖ,并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,进行高效表达,表达物占菌体可溶性总蛋白的２４％。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质和迹图谱显示表达物分子量为４５ｋＤ与融合基因编码蛋白质的理论值相符。该蛋白质在大肠杆菌中为泌型表达有利于纯化。ＲＩＡ测定表     

缩短的人巨噬细胞集落刺激因子（M—CSF）在大肠杆菌中…

本文用聚合酶链反应（ＰＣＲ）获得了一个缩短的人巨噬细胞集落刺激因子ｃＤＮＡ基因,并克隆在质粒ｐＡＥＴ３ｄ中,在Ｔ７启动子指导下,在大肠杆菌ＢＬ２ＬｙｓＥ中获得了和一个６组氨酸短肽标签的融合表达。重组的融合Ｍ－ＣＳＦ表达量占菌体总蛋白的１２％,表达产物一部分以不溶性包涵体形式存在,另一部分则以可溶性蛋白存在。经过金属螯合新和层析一步纯化,所得的融合（Ｈｉｓ）６－Ｍ－ＣＳＦ在还原型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上基     

抗癌胚抗原单链抗体基因在家蚕细胞和幼虫中的表达

将抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单链抗体基因插入家蚕杆状病毒转移载体ｐＢａｃＰＡＫＨｉｓ, 与修饰的家蚕核型多角体病毒ＢｍＢａｃＰＡＫＤＮＡ共转染家蚕细胞, 经同源重组得到含有在多角体蛋白基因启动子控制下的抗ＣＥＡＳｃＦｖ 基因的重组病毒ＢｍＢａｃＳｃＦｖ。用重组病毒分别感染家蚕细胞和幼虫, 在两者中均得到了高效表达, 产物分子量为２８ｋＤ, 前者占细胞总蛋白的６ ％ , 后者为０ ．３ ｍｇ／ 蚕。目的基因在家蚕细胞和幼虫中表达产物经Ｎｉ２＋ＩＤＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ亲和柱纯化, 前者纯度可达９０％ 以上, 后者纯度较低; 纯化后的融合蛋白具有ＣＥＡ 结合活力, 其亲和常数分别为５ ．４×１０８／ｍｏｌ·Ｌ－ １ 和２．３ ×１０８／ｍｏｌ·Ｌ－１ , 略低于其亲本单抗Ｅ７Ｂ１０ ２．７ ×１０９／ｍｏｌ·Ｌ－ １ 。     

重组人骨形成蛋白—3羧基端肽在大肠杆菌中表达及其诱骨活性

以双顺反子表达载体,在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达了人骨形成蛋白－３羧基端肽段（ｈＢＭＰ－３Ｃ）,表达量占菌体总蛋白量的１８．５％。目的蛋白为２５ｋＤ、含ｈＢＭＰ－３Ｃ端２１５个氨基酸残基组成的肽段,包括ｈＢＭＰ－３成熟肽和一部分前肽。表达产物以包涵体的形式存在,用含ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的洗涤液和５ｍｏｌ／Ｌ以下脲溶液连续涤,可获得较高纯度的重组人骨形成蛋白－３Ｃ端肽,经复性处理成可溶性蛋白,植     

人白细胞介素18在大肠杆菌中的表达,纯化和复性

用ＲＴ－ＰＣＲ从ＰＨＡ刺激的人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中扩增出人白细胞介素１８（ＩＬ－１８）的ｃＤＮＡ,克隆到表达载体ｐＪＷ２中,经热诱导后在大脾性杆菌中得到高效表达。表达的重组ＩＬ－１８占菌体总局旧白质的２０％,表达的蛋白南分子量约为１８ＫＤ,与预期分子量相符。产物主要以包涵体的形式存在。包涵体经超声破碎、洗涤后以８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解,经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００柱纯化后,纯度可达９０％以     

丙型肝炎病毒非结构区NS4b基因片段的克隆和表达

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术和ＤＮＡ体外重组方法,克隆出５７９ｂｐ的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ４ｂ基因片段,插入到原核高效表达载体ｐＥＴ－２８ａ中,构建重组质粒ｐＥＴ／ＮＳ４ｂ,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株,经ＩＰＴＧ诱导培养后,获得了目的蛋白的高效表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示在３０ｋＤ处有一条表达的目的蛋白区带。通过固定化金属配体亲和层析（ＩＭＡＣ）纯化目的的蛋白,ＥＬＥＳＡ检测结果表     

中麻黄悬浮培养体系的建立

本文用中麻黄无菌苗为外植体,其切段培养在附加２ｍｇ／Ｌ２,４－Ｄ和０．５ｍｇ／Ｌ　６　ＢＡ的ＭＳ培养基上,全部脱分化形成白色疏松愈伤组织。愈伤组织继代培养于ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌ２,４－Ｄ＋０．２ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋０．２ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ＋４％蔗糖的培养某上。以继代培养愈伤组织为材料进行悬浮培养,培养基为附加０．２ｍｇ／Ｌ２,４－Ｄ＋０．１ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋０．１ｍｇ／ＬＮＡＡ＋２％蔗糖的ＭＳ液体培养基,得到分散性好,细胞形状接近圆形,细胞大小均一,细胞团多由２－３０个细胞组成的悬浮培养体系。第三代悬浮培养细胞增长率为０．３５ｇ·ｆｗ／２０ｍｌ·ｄ,细胞有丝分裂指数为１１．２％。条件培养和高密度接种可缩短延迟期,条件培养不能提高分裂指数,１ｇ／１０ｍｌ接种密度可使分裂指数提高至２１．２％。     

百脉根愈伤组织原生质体再生植株

百脉根无菌苗幼茎在含２．０ｍｇ／Ｌ－,２,４－Ｄ,０．１ｍｇ／Ｌ２－ｉｐ的ＭＳ培养基上诱导和继代培养愈伤组织。选取绿色松散颗粒愈伤组织分离原生质体。原生质体培养在调整珠ＫＭ８Ｐ,Ｖ－ＫＭ,ＭＳ和ＳＨ培养基上「含３００ｍｇ／Ｌ,ＣＨ,２％ＣＷ,２％蔗糖,６％葡萄糖,２．０ｍｇ／Ｌ,２,４－Ｄ,０．５ｍｇｇ／Ｌ,ＢＡ,５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ」,原生质体再生细胞均能分裂,并形成小愈伤组织,但以ＫＭ８０为     

党参原生质体再生植株

党参下胚轴愈伤组织原生质体在附加１．２ｍｇ／Ｌ２,４－Ｄ,０．２ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ,０．２ｍｇ／Ｌ ＢＡＰ和０．１ｍｇ／Ｌ ＺＴ的ＭＳ,Ｃ８１Ｖ,ＤＰＤ及ＫＭ８ｐ培养基中进行液体体层培养。在ＫＭ８ｐ中获得了最高的分裂频率。葡萄糖作渗透剂优于甘露醇,两结合使用效果更好。在合适的条件下,原生质体培养３天出现第１次分裂,４周内形成大细胞团,培养６周后形成０．５－１．０ｍｍ大小的小愈伤组织。在附加２％蔗糖     

鼠伤寒沙门氏菌外膜蛋白诱发BALB／C小鼠免疫保护的研究

本文采用超声破碎ＴｒｉｔｏｎＸ—１００和超速离心技术提取了鼠伤寒杆菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ,ＳＴＭ）的外膜蛋白（Ｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｓ,ＯＭＰｓ）,并发现ＯＭＰｓ中脂多糖ＬＰＳ的含量约为５％,ＯＭＰｓ经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ显示１０余条蛋白带。对ＯＭＰｓ诱发ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠产生典型迟发型变态反应ＤＴＨ和ＩＬ—２的水平进行了检测。经腹腔免疫的小鼠用５００ＬＤ５０鼠伤寒杆菌（５０１１５）攻击,１００％可得到保护;用５００ＬＤ５０伤寒杆菌（Ｅ６８６）攻击,３３．３％可得到交叉保护。免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠的Ｔ淋巴细胞,经尾静脉注射给非免疫小鼠,可使后者得到８５．７％的被动免疫保护,上述结果说明ＯＭＰｓ能诱发ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠细胞免疫和保护性免疫,并提示成为分子疫苗的可能性。     

一个新的蛋白质剪切系统及其剪切条件的研究

将含麦芽糖结合蛋白－内蛋白子－几丁质结合区（简称ＭＹＢ）基因的重组质粒ｐＭＹＢ１２９转入Ｅ．ｃｏｌｉ２４２６,在ＬＢ培养基中发酵,ＩＰＴＧ低温诱导表达,菌体超声破碎,离心,上清液经直链淀粉糖亲和层析,获得ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳纯的前体蛋白ＭＹＢ．ＭＹＢ中内蛋白子的Ｎ端可被还原剂ＣｙＳＨ、ＤＴＴ、β－巯基乙醇等诱导发生剪切反应．结果表明,三种还原剂中以ＤＴＴ为最佳．同时对剪切过程中温度、ｐＨ值等影响进行了研究     

重组含有Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)基因的杆状病毒在昆虫细胞中的表达

用杆状病毒表达系统重组病毒,在昆虫细胞中表达了完整的含有ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因３个外显子开放读码框架的长２．３ｋｂ的ｃＤＮＡ片段。用重组病毒感染Ｓｆ９细胞,用免疫荧光染色,结果表明：４８小时表达重组蛋白,７２小时细胞较完整,免疫荧光染色强阳性,９６小时后细胞出现破碎。我们采集７２小时的组织培养上清和细胞破碎裂解液,分别采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ分子筛法,用免疫蛋白印迹法实验证明,表达的蛋白能被抗ＬＭＰ１的单克隆抗体所识别,测定表达蛋白的分子量为６０ｋＤ。经蛋白含量扫描图分析,采用Ｓｅｐｈａｄｅｘ－７５柱初步纯化表达的ＬＭＰ１蛋白,将后者进行裸鼠体内致瘤实验,未见肿瘤生长。