实验犬布氏杆菌的多重PCR检测与分型鉴定

目的建立实验犬及相关生物制品布氏杆菌的多重PCR检测与分型鉴定方法。方法选择布氏杆菌Omp2基因同源性较高的区域设计引物对布氏杆菌进行多重PCR扩增,扩增结果一致的样本进行酶切以区分不同型,同时进行序列测定,以确定该方法的准确性;然后验证该方法的特异性和敏感性。结果成功扩增得到目的条带,并通过酶切区分五种布氏杆菌;PCR产物与布氏杆菌DNA序列同源性达到99%,并验证了该方法的检测结果。实验结果证明该方法特异性较好,灵敏性为1.8×10^-7μg/mL。结论成功建立布氏杆菌多重PCR检测与分型鉴定方法,所建立的方法特异性好,灵敏度高。本研究对保证实验犬群的质量,保护饲养人员、实验人员的身体健康具有重要意义。     

北京地区实验动物绿脓杆菌分离株MLVA分型

目的通过多位点可变数目串联重复序列分析（multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis,MLVA）分型方法,研究北京地区实验动物绿脓杆菌分离株基因型和分布情况。方法选择13个可变数目重复序列（variable-number tandem-repeat,VNTR）位点,对实验动物及设施中检测出的141株绿脓杆菌的基因组DNA进行重复序列扩增,所得指纹图谱使用BioNumerics软件进行聚类分析,绘制系统发育树和最小生成树（minimum spanning tree,MST）。结果所采用的13个VNTR位点能够对全部分离株进行有效分型。141株绿脓杆菌主要被分为了3个基因群,56个基因型。各群所占比例分别为A群82.3%,B群占12.8%,C群占5.0%,辛普森多样性指数为0.763。同一区域内相邻实验动物单位的绿脓杆菌分离株同源关系较远。结论 MLVA方法对绿脓杆菌具有很好的分型能力,能够有效的追踪绿脓杆菌的来源。北京地区实验动物中绿脓杆菌分离株基因型多态性丰富,但无地域性同源关系。     

新疆喀什维吾尔族结核病患者结核分枝杆菌5个VNTRs基因分型研究

目的:应用多位点数目可变串联重复序列分析(multiple loci VNTR analysis,MLVA)技术,对新疆喀什地区维吾尔族结核病患者结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型,探讨5个数目可变串联重复序列(VNTR)基因型种类及其分布。方法:收集结核分枝杆菌,采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术,结合BioNumerics5.0软件,对其5个VNTR位点进行结果分析。结果:分离出58株结核分枝杆菌,分为4个基因群21个基因型,分别为Ⅰ群占19.1%,含7个基因型;Ⅱ群占3.4%,含2个基因型;Ⅲ群占67.2%,含9个基因型;Ⅳ群占10.3%,含5个基因型。结论:新疆喀什地区维吾尔族结核病患者的结核分枝杆菌存在明显的基因多态性,且存在主要流行菌群。     

犬体200株布氏菌的判定与特性

先后收到我国一些地区从犬体分离的待检布氏菌200株,经细菌形态、生长特性和血清凝集等初步检查,其中176株疑似布氏菌(85．59％).用单相和粗糙血清检测、s和R群噬菌体裂解试验,证明均为犬种布氏菌。部分菌种作DNA同源性测定与电镜形态观察,发现其基因系列和电镜图像与国际参考菌一致。在R血清反应中,有4.75％菌株无凝集原性。在硫堇和复红染料抑菌试验中,典型株占72．49％;对两种染料均不被抑制者占22．75％。这部分菌和被R／C噬菌体裂解的粗糙羊种菌难以鉴别。     

沙门氏菌的分子分型方法

沙门氏菌是一类危害人和动物健康的重要致病菌,是引起食物中毒的最常见病原菌之一.本文对目前常用的3种分子分型方法脉冲场凝胶电泳(Pulsed-field gel electrophoresis,PFGE),多位点序列分析(Multi-locus sequence analysis,MLST)及多位点可变数串联重复分析(Multiple-locus variable number tandem repeats analysis,MLVA)在沙门氏菌分子分型的应用做了阐述和比较,为沙门氏菌分型研究提供一定的参考.     

多杀性巴氏杆菌分子分型方法简述

多杀性巴氏杆菌是一种能感染多种动物甚至是人的重要革兰氏阴性病原菌。目前临床上用于多杀性巴氏杆菌诊断的分型方法主要包括血清学分型方法和分子分型方法。其中血清学分型方法主要基于免疫学实验技术建立,操作过程繁琐,技术要求高,工作量大,不适用于临床上大规模快速开展多杀性巴氏杆菌流行病学调查的需要;而基于分子生物学手段建立的分子分型方法相对于传统的血清学分型方法而言具有快速、简单、灵敏、灵活等特点,特别是某些分子分型方法与传统的分型方法形成了较为精确的对应关系,因而在临床上得到了广泛的应用。目前适用于临床上开展多杀性巴氏杆菌分离鉴定的分子分型方法主要包括多重PCR方法及多位点序列分型法(MLST),其中多重PCR方法又包括基于荚膜编码区及脂多糖外核编码簇建立的PCR方法。本文将重点就这3种常用的多杀性巴氏杆菌分子分型方法进行综述,介绍其建立原理、实现手段以及各自的优缺点,为临床上开展多杀性巴氏杆菌的流行病学调查特别是分子流行病学调查提供参考。     

重复序列PCR(rep-PCR)指纹分析技术在病原真菌鉴定和分型中的应用

随着医学科学的发展及人们对深部真菌感染的重视,越来越多的新技术用于临床真菌的检测和鉴定。重复序列PCR(rep-PCR)指纹分析技术因其高分辨力、快速、简便、经济等优势,已成为分析真菌基因组、明确菌属间克隆来源的重要方法。本文就rep-PCR指纹技术及其自动化DiversiLab System在病原真菌分类鉴定和流行病学研究中的应用加以综述。     

醋酸钙—鲍曼不动杆菌复合体临床分离株多重PCR分型和感染特征分析

目的 在临床微生物实验室建立醋酸钙‒鲍曼不动杆菌复合体分型的方法,对相应菌株的药敏情况和临床特征进行分析,为临床准确诊断和有效治疗提供参考依据。方法 收集苏州大学附属第一医院2015年10月至2016年1月临床分离的45株醋酸钙‒鲍曼不动杆菌复合体菌株,用多重PCR法进行基因分型,用K-B法进行药敏试验,并采用SPSS 17.0软件进行统计分析。结果 45株醋酸钙—鲍曼不动杆菌复合体用多重PCR法鉴定为鲍曼不动杆菌38株,基因3型5株,基因13TU 2株,未鉴定出醋酸钙不动杆菌。标本来源以痰最多（35例）,其次为血液标本（6例）,脑脊液（2例）。科室分布在神经外科（11例）和ICU（10例）最多,其次是重症医学科（7例）和心胸大外科（6例）。年龄分布以41~60岁（17例）以及61~80岁（15例）两个年龄段最多;性别分布以男性较多（31例）,女性较少（14例）,而且各个年龄段男性均多于女性。在8种临床常用药物中,对头孢吡肟、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、环丙沙星和亚胺培南的耐药率均超过了70.0%,其中哌拉西林的耐药率最高（84.4%）,阿米卡星的敏感率最高（51.1%）。结论 多重PCR技术能对醋酸钙‒鲍曼不动杆菌复合体进行快速基因分型,它成本低、操作简便,适合在临床微生物实验室推广。目前鲍曼不动杆菌引起的感染形势严峻,患者以中老年患者、男性、呼吸道感染、神经外科和ICU科室居多。鲍曼不动杆菌感染大多呈多重耐药甚至泛耐药。推荐临床通过积极治疗原发病,医护人员做好手卫生,加强消毒隔离,根据药敏结果合理选择抗生素等方法尽量减少和延缓耐药菌株的出现。     

中德生物STR荧光ZDgenetype 9+1基因分型试剂盒应用结果分析

目的:确证中德生物STR荧光ZDgenetype 9 1基因分型试剂盒应用于个体基因分型的准确性和重复性。方法:应用中德生物ZDgenetype 9 1 STR荧光基因分型试剂盒扩增100例无关个体样本,建立扩增产物在ABI 310遗传分析仪上基因分型的方法,相同样本扩增结果与AmpFLSTR Identifiler基因分型结果进行比较。结果:ZDgenetype 9 1荧光基因分型试剂盒对100例无关个体血样进行复合扩增并实现了在ABI 310遗传分析仪上进行基因分型,其结果与AmpFLSTR Identifile扩增相同样本的基因分型结果吻合率为100%。结论:中德生物ZDgenetype 9 1 STR荧光基因分型试剂盒适用于法庭科学日常办案和科研使用。     

多重PCR方法快速检测4种主要致腹泻性大肠埃希菌

肠毒素性大肠埃希菌(ETEC)、肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)和侵袭性大肠埃希菌(EIEC)是引起腹泻的主要大肠埃希菌,威胁着食品安全和人类健康,建立同时检测4种致腹泻性大肠埃希菌的方法具有重要意义。基于ETEC LT肠毒素基因、EPEC bfpA基因、EHECO抗原基因和EIEC侵袭性质粒特异性基因,设计了4对特异性引物,通过对单一PCR反应条件的优化建立了快速检测4种主要致腹泻性大肠埃希菌的多重PCR方法,彼此之间无交叉反应。该多重PCR方法具有良好的特异性和灵敏性,对24株致病菌进行检测,所试4株致腹泻性大肠埃希菌均为PCR阳性,其他菌株则为阴性。实践证明,利用所建立的多重PCR方法对124份肉类、奶类制品及人工污染样品等进行检测,检出15份阳性,与国标(GB4789.6-1994)检测结果相同。结果表明本文建立的多重PCR方法可用于ETEC、EPEC、EHEC和EIEC的单一或混合感染的鉴别诊断及食品安全风险评估,具有良好的实用性。     

新疆绵羊种布鲁氏菌HtrA基因的克隆与序列分析

根据已发表的牛流产型布鲁氏菌(B.abrotus)HtrA(High temperature requirment A)基因的核酸序列设计引物,从新疆绵羊种布鲁氏菌(B.ovis)基因组中扩增到了大约1600bp的片段。将该片段纯化后克隆到PBS-T载体上,对所得到的重组质粒进行PCR鉴定、酶切分析后,对克隆的片段进行测序表明,新疆绵羊种布鲁氏菌HtrA基因与发表的牛流产型布鲁氏菌、马耳他布鲁氏菌(B.melitensis)、猪种布鲁氏菌(B.suis)的HtrA基因核苷酸序列的同源性分别为99.68%、99.81%、99.55%,推导的氨基酸序列也存在很高的同源性。     

Differentiation of Lactobacillus plantarum, L. pentosus, and L. paraplantarum by recA Gene Sequence Analysis and Multiplex PCR Assay with recA Gene-Derived Primers

In this study, we succeeded in differentiating Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pentosus, and Lactobacillus paraplantarum by means of recA gene sequence comparison. Short homologous regions of about 360 bp were amplified by PCR with degenerate consensus primers, sequenced, and analyzed, and 322 bp were considered for the inference of phylogenetic trees. Phylograms, obtained by parsimony, maximum likelihood, and analysis of data matrices with the neighbor-joining model, were coherent and clearly separated the three species. The validity of the recA gene and RecA protein as phylogenetic markers is discussed. Based on the same sequences, species-specific primers were designed, and a multiplex PCR protocol for the simultaneous distinction of these bacteria was optimized. The sizes of the amplicons were 318 bp for L. plantarum, 218 bp for L. pentosus, and 107 bp for L. paraplantarum. This strategy permitted the unambiguous identification of strains belonging to L. plantarum, L. pentosus, and L. paraplantarum in a single reaction, indicating its applicability to the speciation of isolates of the L. plantarum group.     

鹅副粘病毒SF02 F基因的序列分析及SF02的多重RT—PCR鉴别

对新近分离的鹅副粘病毒SF0 2采用RT PCR方法 ,扩增F基因后测序 ,得到全长的F基因。该基因的ORF总长为 16 6 2nt,编码 5 5 3个氨基酸 ,其裂解位点的序列为112 R R Q K R F117,与新城疫病毒强毒株的特征相符。其核苷酸和氨基酸同源性分析 ,并与国内新城疫病毒标准强毒株F4 8E9相比较 ,表明该毒株在F基因上已发生了较大的变异 ,而与近年来在我国台湾和部分西欧国家流行的禽副粘病毒有很高的亲缘关系。在分析F基因序列的基础上 ,设计 3条引物 ,建立了一种新的多重RT PCR方法 ,能区分鸡新城疫病毒与鹅副粘病毒。     

Molecular Differentiation of Opisthorchis viverrini and Clonorchis sinensis Eggs by Multiplex Real-Time PCR with High Resolution Melting Analysis

Opisthorchis viverrini and Clonorchis sinensis are parasites known to be carcinogenic and causative agents of cholangiocarcinoma in Asia. The standard method for diagnosis for those parasite infections is stool examination to detect parasite eggs. However, the method has low sensitivity, and eggs of O. viverrini and C. sinensis are difficult to distinguish from each other and from those of some other trematodes. Here, we report a multiplex real-time PCR coupled with high resolution melting (HRM) analysis for the differentiation of O. viverrini and C. sinensis eggs in fecal samples. Using 2 pairs of species-specific primers, DNA sequences from a portion of the mitochondrial NADH dehydrogenase subunit 2 (nad 2) gene, were amplified to generate 209 and 165 bp products for O. viverrini and C. sinensis, respectively. The distinct characteristics of HRM patterns were analyzed, and the melting temperatures peaked at 82.4±0.09℃ and 85.9±0.08℃ for O. viverrini and C. sinensis, respectively. This technique was able to detect as few as 1 egg of O. viverrini and 2 eggs of C. sinensis in a 150 mg fecal sample, which is equivalent to 7 and 14 eggs per gram of feces, respectively. The method is species-specific, rapid, simple, and does not require fluorescent probes or post-PCR processing for discrimination of eggs of the 2 species. It offers a new tool for differentiation and detection of Asian liver fluke infections in stool specimens.     

嗜铁钩端螺旋菌(Leptospirillum ferriphilum)gyrB基因的PCR扩增、克隆与序列分析

根据GenBank和ICB数据库中gyrB蛋白氨基酸序列的两个保守区域TPGMYIG和QRY(F)KGLGEM设计简并引物,以L.ferriphilum菌株YSK基因组DNA为模板,PCR扩增出获得大小约为2.2kb的DNA片段.序列分析表明,菌株YSK的扩增片断的开放阅读框(ORF)能够推导出一个编码分子量约为82....