抑制VEGF基因表达对乳腺癌细胞细胞周期的影响

目的：研究针对VEGF基因的siRNA（small interferenceRNA）对乳腺癌MCF-7细胞细胞周期的影响。方法：依据Promega公司在网上提供的设计软件,设计针对VEGF基因的siRNA,合成DNA模板,体外转录合成siRNA。脂质体转染法将合成的siRNA转染入MCF-7细胞,以未转染细胞以及错义序列siRNAscr转染细胞为对照。用细胞计数法检测siRNA对MCF-7细胞增殖的影响：流式细胞法检测细胞周期变化,RT—PCR法比较转染前后p21、CyclinDl表达水平的变化,Westemblot检测转染前后磷酸化ERK的表达。结果：细胞计数法结果显示,转染24h后siRNA明显抑制MCF-7细胞增殖,转染48h后,抑制效率稳定。siRNA转染后能有效地抑制MCF-7细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0／G1期,S期细胞明显减少,G0／G1期细胞比例逐渐增多;p21mRNA表达显著上调,抑制CyclinD1mRNA及磷酸化ERK蛋白的表达。结论：体外转录合成的siRNA可能通过上调细胞周期蚤白激酶抑制剂p21的表达,下调CyclinDl及磷酸化ERK的表达,将细胞周期阻滞于G0／G1期,从而显著抑制MCF-7细胞的增殖。     

siRNA抑制c—myc基因的表达对宫颈癌细胞增殖的影响

目的：利用siRNA（small interference RNA）技术研究C-myc基因的对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法：依据Promega公司在网上提供的设计软件,设计针对C-myc基因的siRNA,合成DNA模板,体外转录合成siRNA。通过阳离子聚合物jet—SITM—ENDO将合成的siRNA转染入HeLa细胞,以未转染细胞以及错义序列siRNA—scr转染细胞为对照。用细胞计数法检测siRNA对HeLa细胞增殖的影响。流式细胞法检测细胞周期及蛋白表达的变化,RT—PCR法比较转染前后C-myc mRNA表达水平的变化。结果：细胞计数法结果显示,转染24h后c-myc基因siRNA明显抑制MCF-7细胞增殖,转染48h后,抑制效率稳定。c-myc基因siRNA转染后能有效地抑制HeLa细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0／G1期,siRNA转染组c-myc mRNA、蛋白的表达量明显低于空白对照组、错义序列组。结论：体外转录合成的siRNA可有效降低HeLa细胞c-myc基因的表达,抑制细胞增殖。     

抑制VEGF基因表达对大肠癌细胞HT-29的增殖影响

选择血管内皮生长因子（VEGF）基因为靶基因,设计两组针对VEGF mRNA的小干扰RNA．合成DNA寡核苷酸链,体外转录合成siRNA．以人大肠癌细胞系HT-29为靶细胞,应用脂质体转染的方法,将siRNA导入细胞．MTT法检测siRNA对细胞增殖率的影响,RT—PCR法比较转染前后VEGFmRNA表达水平的变化．ELISA法检测细胞培养液中VEGF蛋白分泌量的变化．结果表明,两组siRNA转染后均能有效地抑制HT-29细胞的生长,VEGF mRNA的表达量大幅度减少;相对应的VEGF蛋白水平也显著降低,而作为阴性对照的错义序列组siRNA转染后则无上述作用．     

靶向HPV16-E6的siRNA对宫颈癌CaSki细胞的抑制作用

以RNA干扰技术为手段,HPV编码的癌蛋白E6为靶标．探讨靶向HPV16-E6的siRNA对宫颈癌细胞生物学行为的影响,并试图阐明该实验的临床意义．构建靶向HPV16-E6的siRNA表达载体,应用体外转染试剂转染HPV16-E6阳性的宫颈癌CaSki细胞．以RT—PCR检测CaSki细胞中E6蛋白的mRNA的表达．借助细胞色素c测定来分析细胞凋亡相关分子的表达和活性．从而研究靶向HPV16-E6的siRNA诱导细胞凋亡的分子机制．RT．PCR检测结果表明,将靶向HPV16-E6的siRNA的表达载体瞬时转染到HPV16-E6阳性的CaSki细胞后,其所舍E6蛋白质和mRNA的表达下调;Westernblotting栓出抑凋亡蛋白Bcl．2的表达亦告下调;细胞色素C释放实验结果显示,HPV16-E6siRNA能够诱导细胞色素c从线粒体释放到细胞浆中。从而诱导细胞凋亡．靶向HPV16-E6的siRNA能够有效抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡．靶向HPV16-E6的siRNA为研究重要致瘤蛋白HPV16-E的功能开辟了新途径,给HPV16-E6阳性肿瘤的靶向基因治疗提供新的实验依据．并探索了HPV感染及宫颈癌的新基因疗法．     

KDR靶向RNA干扰对MCF一7细胞凋亡的影响

目的：研究KDR靶向RNA干扰对MCF-7细胞凋亡的影响,探讨其可能的机制。方法：采用阳离子脂质体Lipofecta．mine2000TM作为转染试剂将人KDR基因的siRNA转染人类乳腺细胞株MCF-7,诱RNAi,采用Hoechst33258染色和半定量RT—PCR检测Caspase-3、survivin的mRNA表达及细胞凋亡变化;比色法检测Caspase．3的活性;利用免疫组织化学方法检测survivin的表达,并用图像分析仪分析蛋白表达强度。结果：靶向KDR的siRNA转染MCF-7后,Caspase-3的mRNA表达上调,survivin基因mRNA及蛋白表达水平下调（P〈0．05）。结论：KDRsiRNA通过减少乳腺癌细胞survivin的表达,增加Caspase．3表达来促进肿瘤细胞凋亡,发挥其抗肿瘤作用。     

siRNA表达载体对SW480细胞原癌基因Pokemon的抑制

观察siRNA表达载体对SW480细胞中Pokemon原癌基因的抑制效应,为进一步研究该基因的功能奠定基础。构建针对Pokemon基因的RNAi质粒表达载体,脂质体法转染人结直肠癌SW480细胞系,观察转染效率及细胞表型变化。稳定转染后,实时荧光定量PCR和Western blot检测SW480细胞中Pokemon mRNA及蛋白质的表达情况;MTT法检测siRNA对SW480细胞恶性增殖的影响;流式细胞仪分析细胞凋亡改变。镜下观察阳性转染率约36%,转染表达载体后细胞形态发生了显著变化;Pokemon mRNA及蛋白质的表达受到明显抑制：与阴性对照组相比,表达质粒产生的siRNA对Pokemon mRNA的抑制率在转染后24 h和48 h分别为34.2%和67.7%;对蛋白的抑制率在48 h和72 h分别为48.3%和73.6%。MTT法检测细胞生长曲线表明Pokemon抑制可使SW480细胞生长速度明显减慢;流式细胞仪分析显示转染Pokemon siRNA表达质粒后SW480细胞凋亡增加。构建的RNAi表达载体可以有效抑制SW480细胞中Pokemon基因的表达,并对SW480细胞的生长具有明显抑制及诱导凋亡作用。     

MAT2A基因小干扰RNA诱导人肝癌细胞凋亡的分子机制

为探讨甲硫氨酸腺苷转移酶2A(MAT2A)小干扰RNA对人肝癌细胞生长和细胞凋亡的影响及其机 制,采用脂质体转染法将MAT2A小干扰RNA质粒表达载体转染人肝癌细胞系Bel 7402细胞、HepG 2细胞和 HepG3B细胞.半定量RT PCR检测MAT2A mRNA表达,Western印迹检测MAT2A 蛋白质表达, M TT法观察MAT2A小干扰RNA对肝癌细胞生长的影响,流式细胞仪及DAPI染色检测siRNA对肝癌细 胞凋亡的影响.为探讨其作用机制, 进一步检测转染后肝癌细胞MAT的活性、MAT1A mRNA表 达及SAM、SAH含量.结果发现, MAT2A小干扰RNA特异性抑制人肝癌细胞MAT2A mRNA和蛋白质 的表达, 刺激MAT表达由MAT2A向MAT1A转变, 降低了肝癌细胞中MATⅡ活性（P<005） ,从而诱导肝癌细胞凋亡; MAT2A小干扰RNA诱导Bel－7402细胞、HepG 2细胞、 Hep 3B细胞凋亡 指数分别为19．3%±2．8%、22．8%±3．5%、21．8%±4．2%, 较对照组siRNA(凋亡指数为5 2%±19%)具有明显差异(P<005).DAPI染色显示, MAT2A小干扰RNA转染组可见多个细胞核 浓缩、碎裂成蓝色的小块状,染色质凝聚,形成典型的凋亡小体, 而对照siRNA转染组未发现典型的 凋亡小体.肝癌细胞的生长也受到抑制,MAT2A小干扰RNA转染Bel 7402细胞、HepG 2细胞 、HepG3B细胞72 h后,细胞生长抑制率达高峰,分别为39．62%、41．27%、38．84%.肝癌细胞 中SAM含量明显升高(P<001),而SAH含量改变不明显, SAM/SAH变化伴随SAM含量变化而改 变.提示靶向MAT2A基因的siRNA通过升高肝癌细胞中SAM含量,刺激MAT表达由MAT2A向MAT1A转变, 从而诱导肝癌细胞凋亡,抑制肝癌细胞生长.     

RNA干扰VEGF对体外JAR细胞生长的影响

利用pSUPER质粒作为载体,在人绒癌JAR细胞内成功的沉默了VEGF基因的表达,建立了稳定转染pSUPER—shVEGF1,pSUPER—shVEGF2干扰质粒的JAR细胞株．随后利用RT—PCR证实了在JAR细胞株中,VEGF基因的表达被抑制．显微观察及流式细胞学检测转染后细胞株克隆生长情况显示体外培养条件下VEGF基因受抑后JAR细胞生长周期无发生变化,提示VEGF在体外可能对JAR细胞增殖无直接作用．     

siRNA沉默Survivin基因对鼻咽癌CNE-2细胞凋亡的影响

合成Survivin小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列,用于转染人鼻咽癌细胞株CNE2,体外观察Survivin siRNA转染后CNE-2细胞Survivin mRNA、蛋白的表达、细胞增殖和凋亡情况。设计合成3段特异性Survivin siRNA,用siRNA转染鼻咽癌CNE-2细胞株,设置空白对照和阴性对照组,通过Real-time PCR检测CNE-2细胞的Survivin mRNA相对表达量,Western blotting检测Survivin蛋白的表达,流式细胞术及原位细胞凋亡检测转染后细胞凋亡情况。siRNA转染CNE-2细胞后,siRNA 1组和3组mRNA表达抑制率分别为(68.46±7.94)%、(49.44±3.78)%,siRNA 2组结果无显著差异(p0.05)。蛋白相对表达量只有siRNA 1组降低,表达抑制率为(30.61±2.47)%,流式细胞术和原位细胞凋亡检测转染后CNE-2细胞数量明显降低,细胞凋亡比例增高。siRNA干扰沉默Survivin基因能有效抑制CNE-2细胞的增殖和诱导细胞凋亡。本研究为Survivin基因可能作为治疗鼻咽癌的一个靶点,为Survivin基因沉默可能是治疗鼻咽癌高效的途径提供体外实验支持。     

siRNA抑制c-myc基因的表达对宫颈癌细胞增殖的影响

目的:利用siRNA(small interference RNA)技术研究c-myc基因的对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响.方法:依据Promega公司在网上提供的设计软件,设计针对c-myc基因的siRNA,合成DNA模板,体外转录合成siRNA.通过阳离子聚合物jet-SITM-ENDO将合成的siRNA转染入HeLa细胞,以未转染细胞以及错义序列siRNA-scr转染细胞为对照.用细胞计数法检测siRNA对HeLa细胞增殖的影响.流式细胞法检测细胞周期及蛋白表达的变化,RT-PCR法比较转染前后c-myc mRNA表达水平的变化.结果:细胞计数法结果显示,转染24h后c-myc基因siRNA明显抑制MCF-7细胞增殖,转染48h后,抑制效率稳定.c-myc基因siRNA转染后能有效地抑制HeLa细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期,siRNA转染组c-myc mRNA、蛋白的表达量明显低于空白对照组、错义序列组.结论:体外转录合成的siRNA可有效降低HeLa细胞c-myc基因的表达,抑制细胞增殖.