流行性乙型脑炎病毒E基因的克隆、表达及初步应用

参照GenBank中的日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)SA14-14株序列设计了一对特异性引物,用PCR方法从SA14-14扩增E基因全长,然后克隆到pMD18-T载体中,转化宿主菌DH5a,提取阳性克隆质粒进行双酶切鉴定,将目的片段定向克隆到pET32a( )中,转化入BL21(DE3),经IPTG诱导可表达分子量约73ka的蛋白,Western blotting试验呈阳性,表明E基因得到表达。以纯化的表达产物为核心抗原,猪抗JEV血清为一抗,HRP标记羊抗猪IgG抗体为二抗建立间接ELISA方法,并初步检测了一些血清样品,结果提示表达的蛋白具有很好的应用开发价值。     

流行性乙型脑炎病毒E基因的克隆、表达及初步应用

参照GenBank中的日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)SA14-14株序列设计了一对特异性引物,用PCR方法从SA14-14扩增E基因全长,然后克隆到pMD18-T载体中,转化宿主菌DH5a,提取阳性克隆质粒进行双酶切鉴定,将目的片段定向克隆到pET32a(+)中,转化入BL21(DE3),经IPTG诱导可表达分子量约73ka的蛋白,Western blottmg试验呈阳性,表明E基因得到表达.以纯化的表达产物为核心抗原,猪抗JEV血清为一抗,HRP标记羊抗猪IgG抗体为二抗建立间接ELISA方法,并初步检测了一些血清样品,结果提示表达的蛋白具有很好的应用开发价值.     

猪瘟病毒E2蛋白A3BCD主要抗原结构域的原核表达

目的：对猪瘟病毒E2蛋白A3BCD进行原核表达,以期获得具有抗原活性的表达产物。方法：利用反转录PCR（RT-PCR）和套式PCR（nPCR）技术从河南省近期流行猪瘟病毒野毒株中扩增得到E2基因,并将其克隆至pUCm-T载体,构建克隆载体pUCm-TE2;利用PCR方法扩增E2基因的主要抗原域A3BCD,克隆至pET-32a（＋）载体,构建表达载体pET-32aE2-2,转化到大肠杆菌Rosetta（DE3）中,用IPTG进行诱导表达,对诱导产物进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果：SDS-PAGE结果显示在相对分子质量约35000处出现预期条带,表达产物主要以包涵体形式存在;Western-blotting检测表明,表达产物能与猪瘟病毒阳性血清发生特异性反应,出现单一反应带;用8mol／L尿素（pH8.0）溶解包涵体,经Ni-NTA亲和层析法纯化,获得纯度较高的目的蛋白,ELISA检测表明能与猪瘟抗体阳性血清发生特异性反应。结论：重组质粒pET-32aE2-2转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,解除了由于稀有密码子造成的表达限制,表达量得到提高;表达产物为硫氧还蛋白和E2-2的融合蛋白,易于纯化,且具有活性,为研制猪瘟抗体ELISA检测试剂盒奠定了基础。     

日本脑炎病毒E蛋白在酵母双杂交系统中的表达及其对报告基因激活作用的检测

用日本脑炎病毒(JEV)E蛋白基因片段构建酵母双杂交诱饵载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。用RT—PCR从JEV感染的鼠脑中扩增出JEV E蛋白基因片段,克隆入pUCl9质粒,经测序正确后,再亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中。将重组质粒导入酵母菌AHl09,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。成功获得JEV E蛋白基因片段,表达的E蛋白对酵母菌AHl09无毒性,对报告基因亦无激活作用。为利用酵母双杂交GAL4系统3进行JEV细胞受体蛋白的研究奠定了基础。     

猪链球菌2型溶血素基因与38KDa蛋白基因克隆及联合表达

目的:研究有效的猪链球菌病疫苗。方法:以四川株猪链球菌2型基因组DNA为模板分别扩增溶血素基因和38KDa基因主要功能区基因;并经连接、克隆及酶切鉴定。分别构建原核表达载体pET32a-Sly、pET32a-38KDa,提取阳性克隆质粒分别进行双酶切并纯化,通过PCR串联两片断,将目的片断定向克隆到表达载体pET32a中,经测序正确后,重组质粒转化入大肠杆菌BL21 (DE3),用IPTG进行诱导表达。结果:重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量约为60Ku的重组蛋白,表达产物经纯化后,免疫印迹法(Western-blotting)证实该重组蛋白可以与SS2阳性血清发生特异性反应。结论:本研究为重组蛋白的免疫保护应用奠定基础。     

猪链球菌2型烯醇化酶的分子克隆与免疫学特性

对新近测定的猪链球菌2型(S. suis 2) 05ZYH33全基因序列进行生物信息学分析, 并与相关家族蛋白进行同源性比较, 设计合成引物, PCR法扩增出约1.3 kb的烯醇化酶编码基因 (enolase, eno), 将其克隆入pMD-18T载体中, 进一步亚克隆入表达载体pET32a。将重组表达质粒pET32a::eno转化E. coli BL21 (DE3), 经IPTG诱导表达后, SDS-PAGE初步检测到分子量约为75kD的蛋白带。通过His-Tag亲和层析纯化, 获得融合蛋白His-ENO。Western-blot表明该表达产物具有免疫原性。基于ELISA进行的细胞定位实验证实了Enolase可以部分存在S. suis 2 05ZYH33细菌的表面。这提示了Enolase作为一种新发现的抗原对于引发猪链球菌相关疾病可能发挥着重要的作用。     

猪瘟病毒E2基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

目的利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白,用于E2蛋白功能、开发CSF新型疫苗以及建立相关血清学诊断方法等研究。方法采用RT-PCR扩增CSFV E2基因,将PCR产物克隆到pGEM-T-Easy载体,将该基因插入到pFast-BacHT A载体中,构建重组转座载体后转化DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行Western-blot及免疫组化鉴定。结果成功克隆CSFVE2基因,其核苷酸序列为1119 bp。SDS-PAGE电泳结果显示表达E2蛋白相对分子质量约为43×103,Western-blot和免疫组化结果证实表达蛋白能够被CSFV标准阳性血清识别。结论在Bac-to-Bac杆状病毒系统中的成功表达了CSFV E2蛋白,与CSFV标准阳性血清具有较好的反应性。     

猪链球菌2型烯醇化酶的分子克隆与免疫学特性

对新近测定的猪链球菌2型(S.suis 2)05ZYH33全基因序列进行生物信息学分析,并与相关家族蛋白进行同源性比较,设计合成引物,PCR法扩增出约1.3 kb的烯醇化酶编码基因(enolase,eno),将其克隆入pMD-18T载体中,进一步亚克隆入表达载体pET32a.将重组表达质粒pET32a::eno转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE初步检测到分子量约为75kD的蛋白带.通过His-Tag亲和层析纯化,获得融合蛋白His-ENO.Western-blot表明该表达产物具有免疫原性.基于ELISA进行的细胞定位实验证实了Enolase可以部分存在S.suis 2 05ZYH33细菌的表面.这提示了Enolase作为一种新发现的抗原对于引发猪链球菌相关疾病可能发挥着重要的作用.     

山羊痘病毒p32基因的原核表达及生物信息分析

目的:构建表达山羊痘(GPV)P32蛋白的原核表达载体PTYB11-gpvp32,初步分析其在大肠杆菌(E.coli)BL21中的较佳表达条件。方法:首先用序列分析软件Blastp、MEGA5.1、SOSUI等对GPVP32进行生物信息学分析;Primer Primier5.0软件设计引物,在上游引物添加限制性酶切位点SpeⅠ、下游引物添加限制性酶切位点XhoⅠ,以pSK-gpvp32为模板,PCR扩增方法获得基因片段,克隆入PMD18-Simple-T,构建PMD18SimpleT-gpvp32载体,转化大肠杆菌(E.coli)Top10感受态细胞,经酶切筛选、测序确定插入序列的正确,然后将gpvp32克隆入原核表达载体PTYB11中的SpeⅠ、XhoⅠ酶切位点,构建原核表达质粒PTYB11-gpvp32;转化大肠杆菌(E.coli)BL21后,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定重组蛋白在不同诱导时间下的表达情况。结果:成功构建山羊痘病毒原核表达载体PTYB11-gpvp32并在大肠杆菌(E.coli)BL21中成功表达GPVP32,经检测重组蛋白表达量约为菌体总蛋白的28%,进化树结果表明山羊痘的亲缘关系与地理位置存在差异及在不同的羊群中进化的结果,经SOSUI等软件综合分析知GPVP32是山羊痘病毒跨膜蛋白的囊膜蛋白但不是信号肽。结论:山羊痘病毒p32基因在大肠杆菌中获得高效表达,为山羊痘病毒的流行性调查、分子生物学研究以及以后有效防治本病提供了物质基础。     

HCV包膜蛋白E2的克隆、表达与检测

构建丙型肝炎HCV包膜蛋白糖蛋白的E2基因原核表达载体,获得大量重组HCVE2蛋白,进行E2蛋白的抗原性及潜在保护作用研究。通过RT-PCR从HCVRNA阳性血清标本中扩增出975bp(383～708)E2基因片段,PCR产物经EcoR I和Sall I双酶切后连接到经同样酶切的PET-41a原核表达载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经Amp筛选,得到阳性重组质粒PET41a-HCVE2菌株,并以IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE鉴定,表达产物经固定化金属配体亲和层析纯化,用ELLSA方法检测生物学活性。结果表明,构建的HCVE2包膜蛋白基因片段原核表达质粒所表达产物主要以包涵体形式存在,表达的融合蛋白与HCV阳性血清具有较好的反应原性。以HCVE2融合蛋白检测患者阳性血清具有良好的抗原性,有望能提高HCV抗体检测试剂盒的检出率。     

片球菌素pediocin PA-1基因在大肠埃希菌中的融合表达

目的构建编码细菌素pediocin PA-1基因片段的原核表达载体,诱导表达,鉴定表达产物。方法重组DNA技术构建原核表达载体pET32-papA,IPTG诱导表达,用金属亲和层析纯化,并通过SDS-PAGE与Westernblot对表达的重组蛋白进行鉴定。结果双酶切和测序鉴定显示papA片段插入正确,诱导表达后获得分子量为19 kD的融合蛋白,表达量为25%,用金属亲和层析的方法获得纯化的片球菌素pediocin PA-1。结论papA基因片段编码的蛋白质能在原核细胞中正确表达,为下一步研究该功能域的生物活性奠定了基础。     

水稻cDNA c73片段在大肠杆菌中的表达及其产物的纯化

曾以水稻蜡质基因５’调控区内一段３１ ｂｐ 片段为探针,用酵母单杂交法从水稻ｃＤＮＡ 文库中筛选出若干个其编码的蛋白可能与此３１ ｂｐ 片段结合的ｃＤＮＡ克隆,现将其中的ｐＣ７３ 克隆中的插入片段ｃ７３ 连接到含Ｈｉｓ６ 的表达载体ｐＥＴ２８ｃ（ ＋ ） 上,在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３） 中进行诱导表达,并用ＮｉＮＴＡ 树脂纯化得到预期的融合表达产物。在合适的诱导表达条件下,融合表达产物主要以可溶形式存在于大肠杆菌细胞内;表达量占到大肠杆菌总蛋白的１０ ％ 左右;经ＮｉＮＴＡ 树脂亲和层析纯化得到的产物纯度达９５ ％ ,可供进一步研究之用。     

重组C8orf32蛋白的表达、纯化及抗体制备

C8orf32是一种功能未知基因,其mRNA含量在乳腺癌组织中显著高于正常乳腺组织。将其开放式阅读框插入pGEX-6P1原核表达载体T7启动子控制下的GST编码基因下游,构建了C8orf32蛋白表达质粒pGEX-6P-C8。表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,成功表达了GST- C8orf32融合蛋白。经带有GST标签的位点特异性蛋白酶切割除去GST-C8orf32融合蛋白的GST标签,获得了N端带有8个多余氨基酸残基的C8orf32蛋白,蛋白纯度为95%左右。N端氨基酸序列分析表明该蛋白N端氨基酸序列正确,质谱鉴定进一步证明所表达C8orf32蛋白的正确性。用制备的C8orf32蛋白免疫新西兰白兔,获得了能够正确识别C8orf32蛋白的抗血清。该蛋白及其抗体的成功制备,为进一步研究C8orf32蛋白的结构功能和体内分布打下了基础。     

肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段在大肠杆菌中的表达及应用研究

目的:克隆、表达和鉴定肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)P1蛋白羧基端基因序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法 在成功克隆肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段并测序的基础上,将基因序列克隆到表达载体pET32a(+)上,构建了重组表达质粒pET32a(+)/P1(3 520~4 563bp),转化大肠杆rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni^2＋亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用ELISA和Western blotting方法检测其抗原性。重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体。结果 重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,蛋白质纯度达95％以上。ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。并成功获得两株高效价单克隆抗体。结论:本研究成功克隆和表达了肺炎支原体P1蛋白羧基端基因序列,制备了抗肺炎支原体P1蛋白单克隆抗体,为肺炎支原体诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。     

肠三叶因子在大肠杆菌中的表达、纯化及其抗体制备

目的:获得肠三叶因子(ITF)的原核表达产物及抗rITF抗体,为深入研究ITF的作用机制及其受体研究奠定基础。方法:常规提取人小肠组织总RNA,用RT-PCR获得ITF编码基因片段,克隆至质粒pET32a获得原核表达栽体,双酶切和测序后转化至Origami B(DE3)用IPTG诱导表达,优化条件获得最大表达产量;用SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物,亲和层析纯化获得的重组蛋白rITF皮下多点注射家兔,制备多克隆抗体,并用此抗体进行大鼠肠组织免疫组化研究。结果:测序证实PCR扩增获得ITF全长基因序列与基因文库中的完全一致,将该基因片段正确插入表达载体pET32a中、优化表达条件后,重组蛋白的表达量达到50mg/L;Western blot证明重组蛋白具有良好的抗原性和特异性;通过Ni-NTA亲和层析、超滤离心后,得到90%纯度的蛋白;收集兔血清,纯化后获得特异性良好的ITF抗体,免疫组化染色肠组织显示ITF表达的部位定位于杯状细胞。结论:成功构建了表达载体pET32a-ITF,在大肠杆菌中表达并纯化获得纯度较高的rITF,并获得了生物活性较高的ITF抗体,ITF主要在肠道杯状细胞分泌表达。     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节蛋白HBVDNAPTP1的表达、纯化与初步鉴定

目的构建HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中表达,并对融合蛋白进行纯化。方法利用逆转录-PCR获得乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶(Polymerase)反式调节人类新基因HBVD-NAPTP1,测序正确后插入至原核表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(DE3)宿主菌进行诱导,并利用组氨酸亲和层析方法对融合蛋白进行纯化。结果 HBVDNAPTP1原核表达载体转化宿主菌后,经0.5 mmol/L IPTG、30℃诱导5 h获得了分子量约为31 kD的HBVDNAPTP1融合蛋白的优化表达,Western blotting证实融合蛋白的特异性。亲和层析纯化后得到较纯的HBVDNAPTP1融合蛋白,每升培养菌液中可获得2.24 mg的纯化蛋白。结论成功获得纯化的HBVDNAPTP1融合蛋白,为今后开展HBVDNAPTP1的生物学功能研究奠定了物质基础。     

马动脉炎病毒核蛋白基因的克隆与表达

马病毒性动脉炎是危害世界养马业的重要传染病之一,是由动脉炎病毒科动脉炎病毒属的马动脉炎病毒(Equinearteritisvirus,EAV)引起的一种以病马发热,步态僵直,躯干及眼周围水肿,并出现粘液脓性鼻炎、结膜炎,外生殖道水肿为特征的传染病,对妊马能引起流产,使易感怀孕母马的流产率     

APOBEC3G蛋白的原核表达及纯化

目的：原核表达重组APOBEC3G蛋白,为其功能及免疫原性研究奠定基础。方法：提取H9细胞全细胞基因组RNA,通过RT-PCR获得目的基因,经纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,并对表达条件和纯化条件进行优化;利用Western Blot分析鉴定目的蛋白。结果：构建了APOBEC3G蛋白的原核表达载体Apo-His-pET32a,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以可溶性蛋白形式存在;经Ni-NTA亲和层析柱一步纯化,获得了高纯度的重组APOBEC3G蛋白,蛋白浓度可达1．2mg／mL;Westem Blot显示获得了目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达、纯化了可溶性APOBEC3G蛋白,为进一步对其进行免疫原性和功能研究奠定了基础。