罗汉果甜苷V的合成生物学研究进展

罗汉果甜苷V是罗汉果甜苷中含量和甜度均较高的成分,具有止咳祛痰、抗癌、抗氧化、调节血糖等诸多药理活性,成为兼具治疗功能的天然非糖甜味剂,具有广阔的市场前景。然而目前有限的生物资源和较高的提取成本,限制了它的广泛应用。合成生物学的快速发展为植物天然产物的生产提供了一种新思路,通过构建罗汉果甜苷V的微生物细胞工厂,将实现其低成本、规模化生产。文中介绍了罗汉果甜苷V的结构及药理活性,重点综述了罗汉果甜苷V的合成生物学研究进展,并探讨了当前研究所面临的挑战,以期为罗汉果甜苷V生物合成的进一步研究提供参考。     

不同产地罗汉果总皂苷、甜苷V和硒含量及指纹图谱研究

对不同产地同一品种收获期罗汉果总皂苷、甜苷V和硒的含量进行比较,了解罗汉果的品质特点与产地的相关性,科学指导种植区域的生产规划,明确不同区域罗汉果的品质特点和开发等直接关系到罗汉果深加工产业的质量与发展。采用香草醛-浓硫酸试剂分光光度比色法分别测量各罗汉果果实样品中总皂苷的含量,采用高效液相色谱法测量甜苷V的含量,采用氢化物原子荧光光谱法测量其中硒的含量,并对各指标进行方差分析和差异显著性的多重比较。结果表明,各样品总皂苷含量在2.42%~3.34%之间,甜苷V含量在0.68%~1.41%之间,硒含量在5.634~41.462μg/kg之间;来源于不同产地的罗汉果样品,其总皂苷含量差异并不显著,但甜苷V和硒含量分别表现出显著差异;广西、湖南和四川,罗汉果果实总皂苷和甜苷V含量均可达到药典指标要求。因此,罗汉果具有较广的种植区域,但不同产地甜苷V含量差异相对显著,暗示果实甜苷V的转化效率或成熟度具有一定差异,宜根据产地及年度气候条件适当调整收获期,以满足不同加工利用的需要。     

甜苷V提取型罗汉果优良品种选育

为选育甜苷V提取型罗汉果优良品种,对19个罗汉果品种的甜苷Ⅴ含量、单株产量、果肉含量、水浸出物、总糖和总苷含量6个性状进行考察研究,综合打分评价。结果表明,F018、F014、F020综合指数较高,可作为甜苷V提取型罗汉果优良品种,为罗汉果新一代品种选育研究奠定基础。     

不同生长日龄罗汉果中糖基转苷蛋白凝胶电泳分析

采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对不同日龄罗汉果内的主要糖基转苷蛋白进行分析,寻找罗汉果生长过程中皂苷形成的关键蛋白,为生物转化法生产罗汉果甜苷提供科学依据。得到一较清晰的罗汉果糖基转苷蛋白电泳图谱。据电泳图谱分析,初步得出罗汉果糖基转苷蛋白的内在变化规律。结果表明:罗汉果中存在多种糖基转苷蛋白,不同生长日龄罗汉果的糖基转苷蛋白也不一致,在几个关键时期糖基转苷蛋白变化特别明显。     

遮荫处理对罗汉果果肉组织中罗汉果苷和糖分含量的影响

该研究以罗汉果品种“永青1号”为材料,在果实发育后期进行不同强度的遮荫处理,测定遮荫处理下果肉组织中罗汉果苷各组分含量、各种糖分的积累及其相关糖代谢酶活性、叶片光合特性的变化。结果表明：重度遮荫(70％遮荫)会导致果实中罗汉果甜苷Ⅴ含量显著提高,遮荫60 d(授粉后90 d),对照与70％遮荫处理果实中罗汉果甜苷Ⅴ含量分别为4.83％、5.79％,差异达极显著水平( P<0.01);70％遮荫处理下果实中葡萄糖、果糖含量也明显高于对照( P<0.05)。与罗汉果甜苷Ⅴ、葡萄糖、果糖含量的变化不同,遮荫60 d,70％遮荫处理下罗汉果果实中可溶性糖、蔗糖的含量分别显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)低于对照。另外,遮荫处理导致罗汉果叶片净光合速率下降,遮荫40 d,70％遮荫处理下叶片的净光合速率显著低于对照( P<0.05)。综上说明,重度遮荫处理可以引起罗汉果果实品质的改变;光合速率下降是遮荫处理下可溶性糖含量降低的主要原因;SPS、AI、SSC活性的改变则是遮荫导致蔗糖含量降低及葡萄糖、果糖含量上升的重要因素;重度遮荫条件下,荫棚中温度降低可能是罗汉果果实中甜苷Ⅴ含量增高的关键诱因。该研究结果为罗汉果的生产及品质调控提供了理论依据。     

不同遮荫处理罗汉果内在品质的变化研究

以罗汉果‘永青1号'品种为试验材料,在授粉30 d后,设置不遮荫、遮荫70%、遮荫95%三个处理,探讨遮荫对罗汉果总苷、总糖、维生素C等内在品质的影响。结果表明:在授粉30 d后,对罗汉果进行一定程度的遮荫处理,显著提高了罗汉果果实重要内含物总苷、甜苷Ⅴ、总糖和维生素C的含量,可有效改善罗汉果果实的内在品质。遮荫70%处理条件下较适宜罗汉果果实内含物的累积。     

K~+/Na~+浓度比对罗汉果悬浮细胞生长和甜苷V合成的影响

本文研究了不同K~+/Na~+浓度比对罗汉果悬浮细胞生长和甜苷V合成的影响。结果表明,合适的K~+/Na~+浓度比促进细胞生长和甜苷V生物合成。当K~+/Na~+最佳浓度比为15:1时,罗汉果悬浮细胞内K~+浓度、K~+/Na~+、S_((K,Na))值均为最大,此时细胞利用K~+效率最高,细胞生长速率最快。此外,胞外有机酸和胞内氨基酸的变化表明此浓度比例下,细胞可能通过降低TCA循环代谢强度,以及增强EMP途径和MVA途径代谢强度,从而促进萜类化合物前体乙酰Co A向罗汉果甜苷V合成。     

罗汉果全基因组Survey分析

罗汉果是广西特有药用及甜料植物,其主要成分之一甜苷V作为天然、非糖甜味剂,具有广阔的开发前景,但罗汉果目前完全来自于栽培,适生区狭窄,连作障碍严重,加之含量低导致甜苷V生产成本居高不下,严重限制了其应用。为了减少盲目性,在大规模全基因组深度测序之前,先做低覆盖度的基因组Survey测序,评价基因组的大小及复杂程度,以确定适合该植物全基因组的测序研究策略。该研究采用第二代高通量测序技术(Illumina Hiseq TM 2000)首次测定了罗汉果基因组大小,并利用生物信息学方法估计罗汉果杂合率、重复序列和GC含量等基因组信息。结果表明:(1)获得了18.1 Gb罗汉果基因组测序数据,基因组大小估计为344.95 Mb左右,测序深度为52×;(2)从K-mer分布曲线发现罗汉果基因组有明显的杂合峰,杂合率达1.5%,基因组高杂合导致组装的结果中Contig N50和Scaffold N50的长度比预期的要短很多,还造成GC平均深度及含量分布明显异常,存在一个低深度分布区域。基因组主峰后面有微弱的重复峰,说明罗汉果存在较多的重复序列;(3)由于罗汉果存在高杂合率和重复序列较多的特点,该基因组测序分析仅采用全基因组鸟枪法(WGS)策略不合适,为了更好地对全基因组进行序列拼接和组装,可尝试结合采用Fosmid-to-Fosmid或BAC-to-BAC策略。该研究结果对于揭示罗汉果产量、有效成分含量、发育及抗病虫的分子机制,以及通过分子育种来提高甜苷V含量和降低生产成本具有重要意义,为全基因组测序策略的选择提供了依据。     

无籽罗汉果选育的初步研究

采用多倍体诱导、不同倍性配子杂交和组织培养等技术方法,培育出三倍体无籽罗汉果新种质类型。通过与当前罗汉果主要品种的对比栽培实验和观测,表明无籽罗汉果优良株系花、叶等器官形体较大,植株长势健旺,现蕾开花较早,果实无籽或极少籽,甜苷Ⅴ含量比其母本提高36.28%。其生物学性状的变化,尤其是甜甙含量的提高和抗性的增强,表现出了重大的开发利用价值。就无籽罗汉果的生育周期、形态特征、生长发育规律以及果实品质进行初步报道。     

酶催化糖基转移反应在改善罗汉果苦味皂苷口味中的应用

罗汉果皂苷Ⅱ是罗汉果嫩果的主要皂苷成分,味道极苦,在罗汉果生产季节的末期大量滞长果(苦果)因为天气原因而产生,这些滞长果因体内的苦味皂苷尚未转化为甜味皂苷而被丢弃;另外,在罗汉果甜苷提取行业中,脱苦工艺同样会产生大量的苦味罗汉果皂苷Ⅱ。但在化学结构上,罗汉果苦味皂苷与甜味皂苷拥有完全相同的苷元部分,仅存在葡萄糖残基数目和位置的差别。该研究通过酶催化糖基转移反应将新的葡萄糖基团引入苦味的罗汉果皂苷Ⅱ中,可以延长其糖链,从而达到改善其口味的目的。该研究从原料选择、糖源选择以及反应温度等多方面考察了反应条件,最终确定的反应最佳条件为纯度在50%以上的罗汉果皂苷Ⅱ、2倍于皂苷重量的淀粉、60 U·g-1罗汉果苦味皂苷的酶、60~65℃反应24 h。经实际罗汉果苦果样品验证了方法的可行性,所获得的产品可以完全消除苦味,并且带有淡淡的甜味,经HPLC-MS确定了所获得的微甜产物为3~6个糖的皂苷混合物。该方法对于目前罗汉果生产中大量出现并被遗弃的嫩果、苦果以及脱苦工艺中产生的罗汉果皂苷Ⅱ而言,是一种潜在的实现废物利用的方法。     

罗汉果SgHMGR基因的克隆、分析及原核表达

罗汉果甜苷V是一种葫芦烷型四环三萜类物质,作为主要的活性成分和甜味成分存在于成熟果实中,3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)作为萜类化合物生物合成途径中的第一个限速酶,位于甲羟戊酸(MVA)途径中,是罗汉果甜苷V生物合成途径中的重要调控位点。为了深入了解罗汉果甜苷Ⅴ的生物合成途径,该研究从罗汉果转录组数据中获得一条编码HMGR的unigene,以授粉后3 d的幼果作为实验材料,通过RACE技术获得了1 926 bp的全长序列,经过生物信息学软件分析,发现该基因含有1 749 bp的开放阅读框,编码582氨基酸残基,含2段跨膜区,分别位于50~72 aa和93~115 aa,亚细胞定位预测位于质膜或内质网上,预测该蛋白没有信号肽,系统进化树分析显示与同科植物黄瓜和甜瓜中HMGR基因的同源性最高。该研究采取去掉N端跨膜区的方法,构建原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导在上清和沉淀中均有融合蛋白出现,尤其在25℃诱导过夜后上清中表达最明显。该文是首次对SgHMGR基因全长序列的克隆及原核表达的功能验证,为进一步深化SgHMGR基因在罗汉果甜苷V生物合成途径中的功能及分子调控研究打下基础。     

不同生长周期的罗汉果鲜果中甜甙V和总黄酮含量变化规律研究

通过使用HPLC法对不同生长周期的罗汉果鲜果中罗汉果甜甙V和总黄酮的含量进行测定,总结出罗汉果中罗汉果甜甙V和总黄酮含量的变化规律,并对二者进行比较研究,结果表明坐果50d后,罗汉果甜甙Ⅴ的增加比较快,80d后,罗汉果甜甙Ⅴ的含量趋于稳定;随着生长周期的增加,罗汉果总黄酮的含量增加,40～50d中增长最快,坐果约50d后达到最高值,从60d开始总黄酮的含量迅速下降到20d水平,然后趋于稳定。     

罗汉果主要性状遗传效应研究

罗汉果近交后代发生明显衰退,花和果变小甚至畸形,种子活力降低,品种间衰退速度不同;杂交F_1后代果实形状、大小、颜色、总苷含量、甜苷Ⅴ含量和雌花柱头生长方式产生严重分离变异,其中果实大小、总苷含量、甜苷Ⅴ含量表现出明显杂种优势;雄性败育系的花粉败育是由遗传决定的,其败育性可通过杂交传递给雌性系产生无籽果实;F17芽变枝条所得雌雄同花两性突变属于遗传变异。     

罗汉果微量元素的花粉直感效应研究

用ICP-OES法测定罗汉果中受花粉直感效应影响明显的微量元素含量。结果表明:两种不同授粉处理的罗汉果样品中Zn、Fe、Cr、Al四种微量元素含量差异显著,受花粉直感作用的影响较大,尤其是Zn元素;罗汉果样品铅含量超过罗汉果行标NY/T 694-2003的限量标准,但符合药用植物绿色行标WM/T 2-2004,研究认为,罗汉果行标Pb标准不太严格,有必要进一步研究和探讨;高甜苷Ⅴ授粉组合("青皮3号"×"红毛1号")果实中B元素含量较高,为硼微肥的利用提供科学依据;而低甜苷Ⅴ组合("青皮3号"×"红毛2号")果实中8种微量元素含量偏高,其中锰与提高呼吸速率有关。     

基于FTIR的三倍体罗汉果花粉直感效应研究

以四个品系的三倍体罗汉果雌株为材料,用五种不同的二倍体雄花分别对其授粉,利用傅里叶变换红外光谱法(FTIR)测定了其子代果实的红外光谱,并运用主成分分析和聚类分析研究了授粉雄花对子代果实化学成分的影响。结果表明:不同雄花授粉后,雌株F302、F323和F322各子代果实红外光谱中1 050 cm-1波数附近甜苷物质特征吸收峰的峰高有显著或极显著差异,雌株F311子代无籽果实的差异不显著;同时五种授粉雄花分别对雌株F302、F323、F322和F311子代果实在主成分二维投影图和聚类图中的排序也有明显的影响,但对不同品系雌株子代果实的排序影响不同,从而说明三倍体罗汉果的甜苷物质含量和整体成分含量均有较为明显的花粉直感效应,并且存在品种特异性。     

酶水解百分之五十罗汉果皂苷Ⅴ方法学研究

罗汉果是我国常用的一种中药,用于治疗干咳、口腔溃疡及便秘等,罗汉果皂苷是罗汉果果实中的主要药效物质,为一类葫芦烷三萜皂苷类化合物。由于个别罗汉果低糖皂苷在罗汉果中含量较低,因而难以对这些皂苷有效地进一步进行代谢或药理等研究。该研究采用RP-HPLC监测50%罗汉果皂苷V的水解过程,并对其水解条件进行正交实验优化其组合,建立了酶水解50%罗汉果皂苷V以获取罗汉果次级皂苷的方法。结果表明:酶水解50%罗汉果皂苷V获得罗汉果皂苷ⅢE、Ⅲ、ⅣE和赛门苷I等次级皂苷的最佳水解条件是p H值为5.6的乙酸-乙酸钠缓冲体系,反应温度为55℃,β-葡聚糖酶活性浓度为40万U·L-1,罗汉果皂苷V的反应浓度为0.2 g·L-1,水解时间为10 h。经多次验证,该水解条件重现性好,可用于从50%罗汉果皂苷V中水解制备罗汉果皂苷ⅢE、Ⅲ、ⅣE和赛门苷I等罗汉果皂苷。该研究结果为进一步水解其他罗汉果次级皂苷提供了依据。     

酶水解百分之五十罗汉果皂苷V方法学研究

罗汉果是我国常用的一种中药,用于治疗干咳、口腔溃疡及便秘等,罗汉果皂苷是罗汉果果实中的主要药效物质,为一类葫芦烷三萜皂苷类化合物。由于个别罗汉果低糖皂苷在罗汉果中含量较低,因而难以对这些皂苷有效地进一步进行代谢或药理等研究。该研究采用RP-HPLC监测50%罗汉果皂苷V的水解过程,并对其水解条件进行正交实验优化其组合,建立了酶水解50%罗汉果皂苷V以获取罗汉果次级皂苷的方法。结果表明:酶水解50%罗汉果皂苷V获得罗汉果皂苷IIIE、III、IVE和赛门苷I等次级皂苷的最佳水解条件是pH值为5.6的乙酸-乙酸钠缓冲体系,反应温度为55 ℃,β-葡聚糖酶活性浓度为40万U·L^-1,罗汉果皂苷V的反应浓度为0.2 g·L^-1,水解时间为10 h。经多次验证,该水解条件重现性好,可用于从50%罗汉果皂苷V中水解制备罗汉果皂苷IIIE、III、IVE和赛门苷I等罗汉果皂苷。该研究结果为进一步水解其他罗汉果次级皂苷提供了依据。     

HPLC法测定罗汉果中罗汉果苷ⅡE、苷Ⅲ的含量

采用ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-水(25:75)为流动相,流速1 mL/min,柱温25℃,二极管阵列检测器,检测波长为203 nm,以外标法测定了罗汉果中罗汉果苷ⅡE、苷Ⅲ的含量。罗汉果苷ⅡE在1.934~25.142μg,苷Ⅲ在2.070~26.910μg范围内呈线性关系,平均加样回收率为96.6%与97.9%。     

罗汉果祛痰作用谱效关系研究

为了研究罗汉果祛痰作用与活性成分的相关性,该研究首先测定了19批罗汉果提取物高效液相(HPLC)指纹图谱和小鼠气管酚红排泌量,找出了指纹图谱共有峰,采用灰色关联度法确定各共有峰对祛痰效果贡献度,利用偏最小二乘法(PLS)得出了各共有峰的正负相关及贡献度。结果表明:共有峰为14个,其中关联度在0.8以上的有12个峰(正相关峰为3、11、12、13号峰,负相关峰为1、2、4-10、14号峰);11、12号峰分别为氧化罗汉果苷Ⅴ和罗汉果苷Ⅴ。因此,罗汉果祛痰作用不是单一成分起作用,而是多种成分综合作用的结果。其中,氧化罗汉果苷Ⅴ和罗汉果苷Ⅴ有祛痰作用,贡献率较大。     

高效液相色谱法测定罗汉果根中两个降三萜配糖体

建立了高效液相色谱测定罗汉果根中两个结构新颖的降三萜糖苷,罗汉果酸苷乙Ⅱ(Siraitic acidⅡB)和罗汉果酸苷甲Ⅱ(Siraitic acidⅡA)含量的方法。色谱条件:色谱柱:ZORBAX SB-C18柱(4.6mm×150mm,5μm);柱温:25℃;流动相:乙腈-水(梯度洗脱:0→4min:35%乙腈;4→16min:35%→45%乙腈);流速:0.5mL/min;检测波长:230nm;进样量:10μL。结果表明,罗汉果酸苷乙Ⅱ在0.05～0.3mg/mL,罗汉果酸苷甲Ⅱ在0.05～0.25mg/mL之间线性关系良好。该方法稳定,精密度、重现性好,且样品处理简单,提取与检测时间短。