磁珠固定化结核分枝杆菌二氢叶酸还原酶及其表征

比较Ni~(2+)-NTA磁珠和羧基磁珠固定结核分枝杆菌二氢叶酸还原酶(Mycobacteriumtuberculosis dihydrofolate reductase,Mt DHFR),探索适合小分子配体混合物库筛选的Mt DHFR固定化方法。重组表达带6×His标签Mt DHFR,纯化后表征酶学性质,比较用Ni~(2+)-NTA磁珠和羧基磁珠固定化时相应固定化容量、保留活性、稳定性及对抑制剂响应。结果表明,Ni~(2+)-NTA磁珠对Mt DHFR固定化容量为(93±12)mg/g磁珠(n=3),但酶比活保留不超过32%,Ni~(2+)明显抑制酶活性,EDTA与Ni~(2+)呈协同抑制效应,Fe~(3+)无显著干扰。羧基磁珠活化固定Mt DHFR的容量(8.6±0.6) mg/g磁珠(n=3),固定化酶比活保留(87±4)%(n=3)。在含50 mmol/L KCl的100 mmol/L HEPES (pH 7.0)中,游离和固定化Mt DHFR在0℃保存16 h活性都无显著改变,但在25℃保存16 h,游离酶活性下降近60%而羧基磁珠固定化Mt DHFR活性下降仅35%。甲氨喋呤对游离Mt DHFR和固定化Mt DHFR的IC50无显著差异(P0.05)。综上,Ni~(2+)-NTA磁珠不适合固定化Mt DHFR;羧基磁珠固定化Mt DHFR能保留活性、热稳定性及对抑制剂的响应,该固定化方法有望用于快速筛选其配体混合物库。     

金樱子提取物中黄酮类物质的初步抗肿瘤活性研究

黄酮类有机物是药用植物金樱子含有的一种重要活性成分,这类有机物具有多种生物活性。本研究选用黔产金樱子,并将其制备为金粉末并进行分离纯化,最终提取出黄酮类活性成分芦丁与槲皮素;采用磺酰罗丹明染色法检测两种有机物对人类肝癌细胞BEL-7402及正常人类肝细胞HL-7702两类细胞增殖的影响并进行比较。发现金樱子提取物中所存在的两种黄酮类化合物对体外培养的人类肝癌细胞BEL-7402的增殖效应产生了一定的抑制作用,其中槲皮素的半数抑制浓度为(7.625±2.02)μmol/L,芦丁的半数抑制浓度为(29.91±3.05)μmol/L;且其对体外培养的正常人类肝细胞HL-7702的毒性较低,其中槲皮素的半数抑制浓度为(35.54±4.37)μmol/L、芦丁的半数抑制浓度为(29.91±3.05)μmol/L。初步提示了金樱子提取物中含有的黄酮类化合物具有一定的体外抗肿瘤活性,作为一种低毒性的天然提取物,具有广阔的抗肿瘤前景。     

羟基丹参酮ⅡA的合成及体外抗肿瘤作用

对丹参酮ⅡA进行结构修饰,合成了羟基丹参酮ⅡA。采用MTT法考察了羟基丹参酮ⅡA对人宫颈癌细胞株Hela细胞,人肝癌细胞株HepG-2细胞、人胃癌细胞株SGC-7901细胞的增殖抑制作用。结果表明:羟基丹参酮ⅡA对三种肿瘤细胞增殖都有很好的抑制作用,抑制作用呈剂量依赖性。羟基丹参酮ⅡA对SGC-7901细胞抑制作用最强,其IC_(50)为4.18μM;对HeLa细胞的抑制作用次之,其IC_(50)为6.08μM;对HepG-2细胞抑制作用较弱,其IC_(50)为10.20μM。而丹参酮ⅡA对SGC-7901细胞、HeLa细胞和HepG-2细胞的IC_(50)分别是17.15μM、27.28μM和46.34μM。羟基丹参酮ⅡA抑制肿瘤细胞增殖作用明显强于丹参酮ⅡA(P0.05)。     

磁珠固定化酶和LC-MS/MS筛选鉴定虎杖中的胰脂肪酶抑制剂

肥胖严重危害着人类的健康,各种减肥药物和替代疗法正在不断研发之中。本文首先结合单因素实验,利用响应面分析法,优化了羧基磁珠固定化胰脂肪酶合成条件,对其结构、稳定性、专一性及重复性进行了验证,然后通过该固定化酶筛选出了天然植物虎杖中的胰脂肪酶抑制剂,最后通过分子模拟对不同抑制类型抑制剂结合位置进行了预测。结果表明:缓冲液p H值7.48、PL浓度20.32 mg/m L、温度35.40℃为最佳合成条件,胰脂肪酶成功固定于羧基磁珠之上,且储存2周后酶活仍保持80%以上,可特异性筛选出阳性抑制剂,重复利用五次后酶活仍保持50%以上。从虎杖醇提水沉物中共筛选出6个胰脂肪酶抑制剂,经LC-MS/MS鉴定和混合标准品确认,共鉴定出4个胰脂肪酶抑制剂,其IC50值和抑制类型分别为大黄素(72.3±2.4μg/m L,非竞争性抑制)、白藜芦醇(195.5±3.6μg/m L,混合型抑制)、大黄素甲醚(168.8±3.4μg/m L,反竞争性抑制)和大黄素-8-O-β-D-葡萄糖(234.3±5.2μg/m L,非竞争性抑制),其中白藜芦醇、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖是新发现的胰脂肪酶抑制剂。分子模拟预测出不同抑制类型抑制剂分别结合于胰脂肪酶的两个位置。     

阿尔泰独尾草和异翅独尾草提取物PTP1B抑制作用及动力学研究

蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)在胰岛素信号通路中起负调控作用,PTP1B过表达使胰岛素受体蛋白酪氨酸去磷酸化而导致机体对胰岛素不敏感,继而产生2型糖尿病胰岛素抵抗。因此,PTP1B是筛选治疗糖尿病活性成分的重要靶点。本文通过体外人源PTP1B抑制剂筛选模型,以活性为导向对新疆两种特有独尾草进行抑制活性筛选。结果表明,两种独尾草属植物均具有良好的PTP1B抑制活性(IC_(50)分别为17.85和33.76μg/m L),在阿尔泰独尾草进一步分离得到化合物大黄酚-8-甲基乙酯,抑制活性为26.15±0.5μM,酶反应动力学研究表明其抑制类型为混合型抑制,抑制常数Ki值为39.12±8.56μM。本研究为异翅独尾草的进一步分离提供了理论依据。     

槐米药渣固体发酵法生产畜禽饲料工艺的研究

以发酵酶解液中总糖、芦丁、槲皮素含量为实验分析指标来确定槐米残渣固体发酵生产畜禽饲料生产工艺。实验结果表明:黑曲霉槐米残渣固体发酵的最佳工艺条件为接种量4%,发酵酶解p H 5.5,温度35℃,时间5 d。槐米残渣经发酵酶解的总糖量高于未经发酵酶解的总糖量60%以上,槲皮素含量高于65%以上。槐米残渣经黑曲霉发酵酶解可作为抗菌、消炎畜牧营养饲料。     

石韦不同极性萃取物体外降血糖活性研究北大核心CSCD

为进一步明确石韦对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制作用机制,该研究以石韦95%乙醇提取物的不同极性萃取物为试材,阿卡波糖为阳性对照,采用pNPG法(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,pNPG)、DNS法(3,5-dinitro salicylic acid,DNS)考察石韦不同极性萃取物的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性,并采用酶促动力学方法与Lineweaver-Burk曲线分析最强活性萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型,以期为石韦的进一步开发利用提供科学依据。结果表明:石韦水萃取物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用最强,其IC_(50)值分别为(4.71±0.72)μg·mL^(-1)、IC_(50)=(48.40±0.32)μg·mL^(-1),并显著强于其他萃取物(P<0.05),且对α-葡萄糖苷酶抑制作用比阿卡波糖强,对α-淀粉酶抑制作用弱于阿卡波糖。阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制作用的IC_(50)值分别为(2857.36±1.35)μg·mL^(-1)和(16.41±0.63)μg·mL^(-1)。酶促动力学显示水萃取物对α-葡萄糖苷酶为可逆性抑制,Lineweaver-Burk曲线显示为竞争性抑制。综上结果表明,石韦水萃取物具有较好的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性,是一种胃肠道副作用小、天然α-葡萄糖苷酶抑制剂来源。     

以环氧乙烷为活性基的多孔颗粒状固定化青霉素酰化酶的制备*

报道了用以环氧乙烷为活性基的多孔颗粒状载体 (Eupergit C)制备固定由巨大芽孢杆菌 (^{B .megaterium})产生的青霉素酰化酶的研究。用己二胺 ,赖氨酸对载体进行化学修饰后制备固定化酶 ,获得了较好的固定结果。用未修饰的载体制备固定化酶 ,经 2 4h固定反应 ,酶活力达 1 76.5IU/g (wet) ,酶活力总收率达 53.7%,酶蛋白的固定量为 197mg/g(dry) ,酶蛋白的固定效率达 87.5 %。游离酶的酶浓度对制备固定化酶的活力无显著影响。当加酶量从     

β-呋喃果糖苷酶的固定化及其在低聚乳果糖合成中的应用

【目的】探索适宜的树脂作为载体固定β-呋喃果糖苷酶,并研究该固定化酶催化合成低聚乳果糖。【方法】选择9种大孔吸附树脂和碱性离子交换树脂固定β-呋喃果糖苷酶,筛选固定化效果较好的树脂作为载体。用聚乙烯亚胺(PEI)修饰得到PEI-树脂,采用吸附法将酶固定于PEI-树脂上,并对固定化条件进行优化。考察固定化酶的重复使用稳定性及其催化合成低聚乳果糖的能力。【结果】通过筛选发现大孔阴离子交换树脂D311固定化效果较好,经过PEI修饰后,D311固定化效果显著提高。用PEI修饰的载体PEI-D311固定果糖苷酶,最优固定化条件为:PEI浓度2%,加酶量103 U/g,吸附温度25°C,吸附p H 6.0-8.0,吸附时间8 h。最优条件下固定化酶活达57 U/g,酶活回收率达55.3%。用固定化酶催化水解1 mol/L蔗糖,重复利用15批载体酶活没有明显降低。用固定化酶催化合成低聚乳果糖,8 h内低聚乳果糖产量最高达到137 g/L。【结论】PEI-D311固定的果糖苷酶具有较好的重复使用稳定性及较高的低聚乳果糖合成能力,这为固定化酶法生产低聚乳果糖研究奠定了基础。     

黄连提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用研究

利用体外α-葡萄糖苷酶抑制模型对黄连不同部位提取物进行活性评价,并与阳性对照Acarbose比较,发现黄连不同部位均有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性.其中,黄连根茎乙酸乙酯提取物的抑制活性最高(IC_(50)=20.72 μg/mL),黄连种子石油醚部位(IC_(50)=40.86 μg/mL)和黄连叶石油醚部位(IC_(50)=62.85 μg/mL)的活性次之.3个部位的提取物活性均远大于阳性对照Acarbose(IC_(50)=1081,27 μg/mL).不同部位比较,根茎对α-葡萄糖苷酶抑制活性最好,这3种提取物抑制活性均比阳性对照高;同一部位不同提取物比较,石油醚和甲醇提取物α-葡萄糖苷酶抑制活性一般要高于乙酸乙酯提取物.     

游离及固定化果糖基转移酶部分酶学性质的比较研究

 从诱变、筛选的米曲霉GX0 0 10菌株所产生的果糖基转移酶 ,经过纯化和固定化操作分别制备游离酶和固定化酶 ,对两者的酶学性质进行了比较研究 .结果表明 ,两者在蔗糖转化为蔗果低聚糖的酶促反应中 ,最适pH为 5 5,在pH5 0～ 7 5之间酶活性相对稳定 .游离酶和固定化酶的适宜温度范围分别是 4 5～ 52℃和 4 0～ 55℃ .在 55℃保温 60min ,酶活性保存率分别是 61 6%和 87 5% .固定化酶的热稳定性提高 .0 1mmol LHg2 +和 1mmol LAg+能完全抑制游离酶的活性 ,但只能部分抑制固定化酶的活性 ,1mmol L的Ti2 +能完全抑制两者的活性 .以蔗糖为底物时 ,游离酶的米氏常数Km=2 15mmol L ,而固定化酶Km =386mmol L .游离酶只能使用一次 ,固定化酶反复使用 54次后 ,剩余活力为 55 2 % .用 55% (W V)蔗糖溶液与固定化酶在pH5 0 ,4 6℃下作用 12h ,可获得61 5% (总低聚糖 总糖 )产物 ,其中蔗果五糖含量达到 7 2 % .     

磁性纳米颗粒固定化乙醇脱氢酶的研究

本研究采用3-丙氨基三乙氧基硅烷(APTES)和戊二醛修饰包裹有SiO2磁性Fe3O4纳米颗粒表面,将其作为固定化载体固定化乙醇脱氢酶,研究固定化条件对固定化效率的影响,并对固定化酶性质进行分析。研究发现,当Fe3O4@SiO2纳米颗粒修饰上氨基和醛基后依然具有良好的水分散性和胶体稳定性,适合作为固定化载体。通过单因素优化,发现当最适给酶量为11. 3U/100 mg,搅拌转速为150 r/min,固定化p H和固定化温度分别控制在6. 5和5℃～15℃,固定化时长为45 min时,具有较好的固定化效果,固定化率可达到60. 2%。在此条件下制备得到的固定化酶与游离酶相比,固定化酶具有良好的耐高温和耐碱性。所得固定化乙醇脱氢酶在连续使用8次后,固定化率仍保留在57%左右,表明该固定化酶具有较好的操作稳定性,可为连续生产NADH提供技术依据。     

离子液体修饰的SBA-16材料在猪胰脂肪酶固定化中的应用

合成了功能化的甲基咪唑类离子液体,并将功能化离子液体修饰介孔材料SBA-16。以三乙酸甘油酯的水解为探针反应,考察离子液体修饰的SBA-16固定化猪胰脂肪酶(PPL)的酶活、最适反应条件及重复稳定性等酶学性质。结果表明:固定化酶对温度的敏感度降低,酶活力及稳定性均显著提高,比酶活是原粉SBA-16固定化酶的1.75倍,重复使用6次后仍然保持最初活性的57%;与原粉SBA-16固定化酶保留的38%相比,有明显的提高。同时通过N2吸附-脱附、红外光谱和热重等方法分析了离子液体修饰对SBA-16结构的影响,结果发现,离子液体修饰后材料保持了原有的介孔结构,修饰后载体表面性质和结构性质导致了PPL酶学性质的变化。     

M.natoriense TNJL143-2菌的D-氨基酰化酶的固定化研究

D-氨基酰化酶可用于D-氨基酸的生产,本研究利用来源于Microbacterium natoriense TNJL143-2的D-氨基酰化酶,分别通过琼脂糖包埋、介孔二氧化硅MCM-41和SBA-15吸附,制备了三种固定化酶,并对三种固定化酶的固定化条件、酶学性质、活性保持时间、重复使用次数、米氏常数等参数进行了研究。结果表明,MCM-41载体固定化酶的蛋白固定率为91.6%,SBA-15载体固定化酶的蛋白固定率为88.0%,琼脂糖包埋法蛋白固定率为79.5%。MCM-41、SBA-15以及琼脂糖三种载体固定化酶最适反应pH均为7.0,最适反应温度范围均为37℃。在固定化酶的活性保持时间以及重复利用活性方面,SBA-15固定化酶同样优于其他两种固定化酶。以D型苯丙氨酸(D-Phe)为底物时,琼脂糖包埋固定化酶的Km为28.8 mol/L,SBA-15固定化酶的Km为25.9 mol/L,MCM-41固定化酶的Km为25.0 mol/L。同时本文还探索了三种固定化酶的pH使用范围及酸碱稳定性、温度使用范围及热稳定性,结果显示,SBA-15作为固定化载体均表现出较广的适用范围及较高的稳定性。在不同条件的反应体系中,SBA-15固定化酶的蛋白损失率始终小于其他两种固定化酶。     

金属框架结构材料MOF-199对漆酶的固定化及其性质

以金属框架结构材料MOF-199为载体对漆酶进行固定化,并对固定化酶的性质进行初步研究。首先,以3-氨基丙基三乙氧基硅烷对载体MOF-199进行表面氨基化修饰,再用戊二醛对载体进行活化,最后对漆酶进行固定化。固定化条件优化结果表明:在漆酶质量浓度0.3 g/L,戊二醛用量1%(体积分数),pH 4.8下固定7 h,制得固定化酶活性最高。对固定化酶的研究发现:最适反应温度为40℃,最适pH为5.2,在连续操作7次后,固定化酶的活力仍能保持在51%。固定化漆酶热稳定性,pH耐受性,贮存稳定性均明显高于游离漆酶。     

改性壳聚糖固定化脂肪酶的研究

以化学改性后的壳聚糖为载体固定假丝酵母99-125脂肪酶,研究了不同的活化剂对壳聚糖表面羟基基团的活化程度,及以活化后壳聚糖为载体采用不同固定化方法对假丝酵母脂肪酶固定效果的影响。结果表明1-乙基-3-(3-甲基氨基)丙基碳二亚胺可有效的活化壳聚糖表面羟基,活化后的壳聚糖表面氨基与戊二醛偶联后形成的壳聚糖为良好的脂肪酶固定化载体,其固定脂肪酶的水解活力可高达86.8U/g。此外,还对影响固定化进程中的各种因素进行了研究,确定最优条件,比较了固定化前后酶的热稳定性、有机溶剂稳定性及最适反应温度。并考察了该固定化脂肪酶催化合成棕榈酸十六酯的操作稳定性,结果表明,连续反应16批之后棕榈酸十六酯的转化率仍能达到85%以上。     

槲皮素-3-O-乙酸酯、槲皮素-3-O-丙酸酯的制备及抗血小板聚集活性

为改善槲皮素的水溶性而不降低其抗血小板聚集活性,本文以芦丁为原料,经"3'、4'、7位羟基苄基化-酸水解苷键-3位羟基酰化-加氢脱苄基"四步反应,合成出槲皮素-3-O-乙酸酯和槲皮素-3-O-丙酸酯。两种衍生物在水中的溶解度分别为243.27μg/m L和8.13μg/m L,均高于槲皮素的溶解度。两种衍生物均对二磷酸腺苷诱导的兔体外和大鼠体内血小板聚集有显著的抑制活性,体外IC50分别为94.1μmol/L和204.9μmol/L,均低于槲皮素值,体内抑聚率均高于槲皮素。实验结果表明,通过选择性酰化槲皮素的3位羟基,引入含2个或3个碳的短脂肪烃基链,能显著改善水溶性,提高抗血小板聚集活性。     

槲皮素-3-O-乙酸酯、槲皮素-3-O-丙酸酯的制备及抗血小板聚集活性北大核心CSCD

为改善槲皮素的水溶性而不降低其抗血小板聚集活性,本文以芦丁为原料,经"3'、4'、7位羟基苄基化-酸水解苷键-3位羟基酰化-加氢脱苄基"四步反应,合成出槲皮素-3-O-乙酸酯和槲皮素-3-O-丙酸酯。两种衍生物在水中的溶解度分别为243.27μg/m L和8.13μg/m L,均高于槲皮素的溶解度。两种衍生物均对二磷酸腺苷诱导的兔体外和大鼠体内血小板聚集有显著的抑制活性,体外IC50分别为94.1μmol/L和204.9μmol/L,均低于槲皮素值,体内抑聚率均高于槲皮素。实验结果表明,通过选择性酰化槲皮素的3位羟基,引入含2个或3个碳的短脂肪烃基链,能显著改善水溶性,提高抗血小板聚集活性。     

壳聚糖纳米磁性微球固定脂肪氧合酶的研究

实验采用溶胶凝胶法制备了纳米磁性Fe3O4,并用壳聚糖对颗粒2四川大学,生命科学学院,四川成都表面进行了表面修饰得到壳聚糖纳米磁性微球复合载体,再以戊二醛为交联剂将脂肪氧合酶固定在复合载体上,并测定了不同因素对游离酶和固定化酶活性的影响;实验表明,微粒在电镜观察下呈亮黑色球状,直径约为150nm,并具有良好的磁性,固定在载体上酶的含量约为7.6%,游离酶的最适温度为30℃,最适p H8.0,而固定化酶的最适温度为30℃,最适p H9.0,当H2O2浓度为12.0 g/L时,游离酶和固定化酶的活性最强;实验结果表明通过交联的方法成功将脂肪氧合酶固定在了纳米磁性四氧化三铁颗粒上,并表现出了较好的活性。     

单羽火筒树化学成分研究

采用色谱柱层析及半制备高效液相色谱的分离方法,以及质谱和核磁共振波谱的鉴定方法,从云南省德宏市民间利用的抗肿瘤药用植物单羽火筒树(九节狸)全株中分离、鉴定出了11个化合物,即山柰酚(1)、山萘酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(2)、槲皮素(3)、异槲皮苷(4)、槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(5)、杨梅素(6)、杨梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(7)、Europetin(8)、Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside(9)、(-)-儿茶素(10)和山楂酸(11)。采用MTS法测试了乙酸乙酯部位及11个化合物对5种肿瘤细胞株的体外细胞毒活性,结果表明单羽火筒树乙酸乙酯部位对人白血病HL-60细胞(IC_(50)=21.76μg/mL)、人肝癌SMMC-7721细胞(IC_(50)=17.04μg/mL)和人肺癌A-549细胞株(IC_(50)=18.00μg/mL)的生长有抑制活性,从乙酸乙酯部位分离出来的化合物1对肝癌细胞株(SMMC-7721)的生长有抑制活性(IC_(50)=27.61μg/mL)。