PCR-RFLP和多重PCR技术检测常见病原性丝状真菌的实验研究

目的建立检测常见丝状真菌感染病原菌的PCR-RFLP和多重PCR方法。方法建立以PCR技术为基础的限制片段长度多态性(RFLP)方法 ,首先用真菌通用引物扩增丝状真菌的ITS区,然后用限制性核酸内切酶对PCR产物进行酶切。用4种丝状真菌的特异性引物建立多重PCR体系,用该体系检测单模板、双模板和三模板的扩增情况,并测定该体系的特异性和敏感性。结果用PCR-RFLP技术能够鉴别5种常见丝状真菌,多重PCR能够根据扩增片段的不同鉴别菌种,在合适的反应条件下,对单模板、双模板和三模板均能扩增出目的片段。结论 PCR-RFLP和多重PCR技术能够快速鉴定丝状真菌感染病原菌,有临床应用的良好前景。     

应用多重PCR方法检测石蜡包埋组织标本中的分枝杆菌DNA

应用多重PCR方法检测并鉴别石蜡包埋组织中的结核分枝杆菌复合体与非结核分枝杆菌DNA扩增片段类型 ,为结核分枝杆菌复合体感染与非结核分枝杆菌感染的病理学诊断提供一种补充的鉴别诊断方法。应用三对具有特异性的寡核苷酸引物 ,进行多重PCR扩增。这三对引物分别对应于分枝杆菌 6 5kD表面抗原、结核分枝杆菌插入序列IS6 1 1 0及人类β 珠蛋白基因的部分序列 ,其扩增产物分别为 3 83bp、1 2 3bp和 2 6 8bp。此种多重PCR方法检测的灵敏度为 0 6pg。经多重PCR扩增后进行凝胶电泳 ,结核分枝杆菌复合体 (结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、BCG)均可见 3 83bp、1 2 3bp片段 ,而非结核分枝杆菌 (鸟、龟、瘰疬、蟾蜍、堪萨斯、胞内、耻垢分枝杆菌 )仅见 3 83bp片段 (猿猴分枝杆菌与结核分枝杆菌复合体相同 )。与上述相比 ,分枝杆菌感染的临床标本分别增加了一条 2 6 8bp片段。对 2 0 9例临床初步诊断为淋巴结结核病人的石蜡包埋组织标本进行了多重PCR检测 ,1 93例病理诊断为淋巴结结核、结核性肉芽组织、结核性肉芽肿性炎症病人的标本 ,检测结果符合结核分枝杆菌复合体感…     

华重楼

<正>华重楼Paris polyphylla var.chinensis(Franchet)Hara为百合科重楼属七叶一枝花的变种。株高30~180厘米。叶5~8枚轮生,通常7枚,倒卵状披针形、矩圆状披针形或倒披针形,基部通常楔形。内轮花被片狭条形,通常中部以上变宽,长为外轮的1/3至近等长或稍超过。在福建省华重楼花期4—7月,果期8—11月。华重楼及其同属近缘种在福建省光泽县、武夷山、邵武市、泰宁县、拓荣县、政和县、建瓯市、建宁市、龙岩市和福州市等地均     

贵州桐梓何首乌rDNA ITS序列分析

以改进的CTAB法对何首乌总基因组DNA进行提取,采用通用引物对不同来源的何首乌rDNA ITS序列进行PCR扩增、测序和序列分析.结果表明,何首乌rDNA完全序列片段长度共约652 bp,其中ITS1的长度为202 bp,5.8S的长度为161 bp,ITS2长度为232 bp,与其近缘种ITS序列间存在明显差异.其rDNA ITS序列在分子水平上为鉴别何首乌提供了参考依据.     

检测PCV2、PPV、PRV疫苗株与野毒株的多重PCR方法

本文建立了一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、细小病毒(PPV)、及伪狂犬病毒(PRV)疫苗株与野毒株的多重PCR方法.根据GenBank上发表的PCV2、PPV和PRV gB、gE基因序列,针对各自保守区各设计一对特异性引物,用这四对引物对同一样品中的PCV2、PPV和PRV gB、gE进行检测,结果可同时扩增出269bp(PCV2)、581bp(PPV)、372bP(PRV gB)及147bp(PRV gE)四条特异性片段.对JEV、PRRSRV、大肠杆菌和双蒸水的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR能检出10pg PCV2、PPV和PRV gB、gE检测敏感度分别为10-6.2、10-3.8、10-5.8TCID50的模板.该方法的建立对临床上进行这三种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测具有重要意义.     

基于双探针杂交的AIV、NDV和FAV-4三重环介导PCR鉴别检测方法的建立及应用

本研究目的是建立禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)和禽腺病毒4型(FAV-4)三重环介导PCR检测方法,用于3种病毒混合感染的鉴别诊断。根据GenBank数据库中AIV的HA基因、NDV的F基因和FAV-4的Hexon基因序列保守性,分别设计两条序列相邻的特异性探针,标记于不同大小的拟南芥TOC1基因片段两端,作为报告基因,用于环介导PCR检测,成功建立了AIV、NDV和FAV-4三重环介导PCR鉴别诊断方法,扩增片段大小分别为200bp、270bp和360bp。特异性试验结果表明,环介导PCR对含有AIV、NDV和FAV-4核酸的样品可扩增出特异性目的片段,而含有IBDV、IVB、FPV和MDV核酸的样品则未见明显扩增,特异性良好;灵敏性试验结果表明,环介导PCR对AIV、NDV和FAV-4的最低极限浓度分别为25pg/μL、12.5pg/μL和12.5pg/μL的核酸样品,检测灵敏度高;多病原同时检测不影响环介导PCR检测特异性和灵敏性。利用该方法对117份临床样本进行检测,结果显示,环介导PCR对AIV、NDV和FAV-4阳性检出率分别为15.4%,27.4%和34.2%,分别高于常规PCR 12.8%,23.9%和32.5%,接近于SybrGreen实时PCR 15.4%,28.2%和35%;kappa一致性检验显示,环介导PCR、SybrGreen实时PCR两种方法对AIV、NDV和FAV-4检测结果高度符合,Kappa值分别为κ=0.93、κ=0.89和κ=0.94。本研究成功建立了AIV、NDV和FAV-4三重环介导PCR检测方法,适用于临床上3种病原的快速鉴别诊断。     

PCR-mtDNA技术鉴别检测不同动物肌肉组织和饲料中鸭源性成分

以鸭肌肉组织DNA为模板,利用PCR-mtDNA技术成功克隆出了鸭mtDNA COIII基因(GenBank Accession No.DQ655706).对所克隆的序列分析表明.其序列包括鸭细胞色素C氧化酶III(COIII)基因全序列784 bp,通过同源性分析可知,动物的线粒体DNA COIII基因是相对保守的,利用此特性设计PCR-mtDNA方法鉴别检测鸭源性成分的特异性引物;以各种动物肌肉组织及饲料DNA为模板进行PCR扩增、经反复验证筛选出只能扩增出鸭DNA的目的片段,而不能扩增出其他动物DNA片段的特异性强、稳定性好的引物P3、P4;利用此引物PCR扩增鸭DNA的特异性片段为226 bp,对PCR产物进行测序分析可知与已克隆的鸭mtDNA COIII基因同源性达到100%,证明了所筛选引物的准确性.通过对不同含量的DNA模板溶液进行PCR扩增的方法,对筛选出的特异性引物P3、P4进行灵敏度试验,结果分析表明灵敏度约为0.001%,证明该PCR方法具有特异性强、灵敏度高的特点,完全可作为鉴别不同动物肌肉组织和饲料中鸭源性成分的方法.     

环介导间接PCR鉴别高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒方法的建立

建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)环介导间接PCR检测方法,用于该病毒的感染检测和高致病性毒株与低致病性毒株的鉴别诊断。根据GenBank数据库中PRRSV中国流行株ORF7和ORF1a基因序列的保守性,设计2对特异性探针,分别标记于大豆Lectin基因两端,作为报告基因,经过一步链置换反应后,采用反向PCR扩增报告基因,建立PRRSV环介导间接PCR检测方法,该方法扩增HP-PRRSV可得大小为193bp和355bp的特异片段,扩增LP-PRRSV可得大小为193bp和442bp的特异片段。试验结果表明,该方法能成功鉴别HP/LP-PRRSV,可检测出5.6TCID50/mL LP-PRRSV和18TCID50/mL HP-PRRSV的病毒RNA,HP/LP-PRRSV混合感染不影响检测灵敏度,与CSFV、PPV、PRV、PCV2、ETEC和Haemophilus parasui等常见猪源性病原的检测无明显交叉反应;对20份临床样本进行比较检测,环介导间接PCR检测出14份PRRSV阳性样本,其中4份LP-PRRSV、9份HP-PRRSV和1份LP/HP-PRRSV,与常规PCR检测结果一致。环介导间接PCR是一种简便快速、灵敏、特异的病原学诊断工具,适合PRRSV感染的快速检测和HP/LP-PRRSV鉴别诊断,尤其适合HP/LP-PRRSV混合感染的鉴别。     

基于种特异性SS-COⅠ技术快速鉴定瘤胫实蝇

[目的]瘤胫实蝇为我国进境植物检疫性有害生物。寄主范围广、危害大,形态与其同属近缘种相似,传统鉴定方法是将果蔬上的各虫态饲养至成虫后进行分类鉴定,鉴定周期较长,影响口岸进境果蔬快速通关,而采用分子鉴定不仅快速且不受虫态影响。[方法]选用瘤胫实蝇为鉴定靶标,番石榴实蝇、锈红果实蝇等19种实蝇作阴性对照,应用种特异性技术,基于mtDNA COⅠ线粒体基因序列,研究筛选并设计一对种特异性引物(SS-COⅠ) LJF400和LJR564,进行PCR扩增并将PCR产物进行电泳检测。[结果]种特异性引物仅对靶标种瘤胫实蝇的COⅠ基因有扩增能力,能扩增出一条单一的长度约165 bp清晰的条带,而对其余阴性对照种均不具有扩增效果,未出现任何条带。[结论]设计的种特异性引物具高特异性,能够快速准确鉴定瘤胫实蝇,适用于各种虫态,对瘤胫实蝇的检疫鉴定和进境果蔬的快速通关具有重要意义。     

大鼠冠状病毒和仙台病毒的双重PCR检测方法的建立与应用

目的建立快速检测实验大鼠冠状病毒和仙台病毒的双重PCR方法。方法根据大鼠冠状病毒N基因、仙台病毒L基因设计特异性引物;经过双重PCR优化,特异性和敏感性的检测,建立双重PCR体系。应用该PCR体系检测人工感染仙台病毒组织DNA样本和实验动物组织样本,并与ELISA方法比对。结果双重PCR扩增出大鼠冠状病毒(168 bp)和仙台病毒(262 bp)目的条带,PCR扩增产物测序结果利用核酸BLAST功能进行同源序列对比,仙台病毒和大鼠冠状病毒同源性分别为100%和99%。仙台病毒和大鼠冠状病毒的检测下限为1.56×10~2 copies/μL。特异性检测对小鼠肝炎病毒扩增,产生片段大小近似大鼠冠状病毒产物。应用建立的双重PCR体系检测人工感染仙台病毒组织DNA样本,30份DNA标本均被检出;检测94份实验动物肺组织样本,结果均阴性。结论建立的双重PCR方法操作简单、快速、特异性强、灵敏度高,能够实现对实验动物仙台病毒和大鼠冠状病毒病原体的快速检测。     

多叶重楼遗传多样性的RAPD分析

应用RAPD技术检测了多叶重楼(Paris polyphyfzo)2个变种4个居群的遗传多样性,并与1个凌云重楼(P．cronquistii)居群进行了比较。选择的16个随机引物在5个居群中共检测到246个多态位点。在居群水平上,滇重楼2个居群的多态位点百分比(PP鳓分别为57．43％和54．67%,Shannon指数分别为0．3080和0．2830;七叶一枝花2个居群的PPB分别为56．33％和57．75%,Shannon指数分别为0、3080和0．3293。在变种水平上,滇重楼的PPB为75．14％,Shannon指数为0．3922,遗传分化系数(Gst)为0．3085;七叶一枝花的PPB为80．31％,Shannon指数为0．3992,遗传分化系数(Gst)为0．3726;在种的水平PPB达92．05%,遗传分化系数Gst达0．5151。聚类分析显示滇重楼和七叶一枝花有较近的亲缘关系,而与凌云重楼遗传距离较远。此结果从分子水平上支持了过去将滇重楼和七叶一枝花划分为1个种下2个变种的形态分类观点。     

西部马脑炎病毒基因组序列的半套式RT-PCR检测

为进一步提高RT－PCR检测西部马脑炎病毒（WEE）病毒基因组方法的敏感性,采用半套式PCR扩增病毒基因组特异序列,首先采用逆转录法将病毒基因组RNA逆转录为cDNA,然后以此cDNA为模板,进行扩增。对扩增后电泳检查无可见DNA条带的产物进行半套式PCR;与此同时对扩增的循环数、Mg^ 浓度和退火温度等条件进行了优化,以进一步提高扩增的特异性。结果第一轮PCR未扩出特异笥片段的WEE病毒稀释度,其半套式扩增出特定大小的DNA产物;同时优化的条件提高了扩增产物的特异性。扩增产物约为190bp的单一DNA片段,其大小与预期的相一致,结果表明采用半套式RT－PCR方法检测WEE病毒的基因组序列的敏感性可提高100倍以上。     

动物遗传工程

951070利用PCR扩增的ZFX/ZFY位点的限制性片段多形性鉴别牛胚胎性别[英]/Pollevick,G.D.…,Bio/Technology.一1992,10(7).-805~'807[译自DBA,1992,11(17),92-09812] 克隆了雄z~ZFX和ZFY位点的PCR扩增片段并进行了测序。447bp扩增片段的检测显示若千多形性。检测出31个点突变,其中部分包括限僚5性内切酶位点。证实存在已介绍过的多形性Pstl位点(用于鉴别雌雄性),检测出2个更替性限制性片段长度多形性(RFLP)。FokI位点存在于ZFX位点中,而不存在于ZFY中,NsiI位点只存在于ZFY中。用牛ZFX和ZFY位点序列设计一套寡核苷酸,以提…     

一条卡瓦胡椒特异RAPD 带转化成SCAR 标记的研究

采用27 份不同来源的胡椒属( Piper) 材料和1 份不同属的草胡椒( Peperomia pellucida) 材料用引物OPQ-03 扩增得到一条约400 碱基对( bp) 卡瓦胡椒特异片段。对该片段进行了克隆和序列分析, 并根据序列分析结果将上述RAPD 分子标记转化为重复性和特异性更好的SCAR ( sequence characterized amplified regions, 序列特征化扩增区) 分子标记。本研究设计出了1 对卡瓦胡椒特异SCAR 引物P7. 1 ( 5′-GGT CAC CTC ACC GCA GCA GGA TGA ACG-3′) 和P7 . 2 (5′-GGT CAC CTC AAT GAC ATG GGA TGA ATC-3′) , 用这对特异引物对本次试验的28 份材料进行PCR 扩增, 结果只有不同属的草胡椒材料无任何扩增, 其它材料均扩增出了预期大小440 bp 的特异带。     

一条卡瓦胡椒特异RAPD带转化成SCAR标记的研究

采用27份不同来源的胡椒属(Piper)材料和1份不同属的草胡椒(Peperomia pellucida)材料用引物OPQ-03扩增得到一条约400碱基对(bp)卡瓦胡椒特异片段。对该片段进行了克隆和序列分析,并根据序列分析结果将上述RAPD分子标记转化为重复性和特异性更好的SCAR(sequence characterized amplifiedre-gions,序列特征化扩增区)分子标记。本研究设计出了1对卡瓦胡椒特异SCAR引物P7.1(5′-GGT CAC CTC ACC GCA GCA GGA TGA ACG-3′)和P7.2(5′-GGT CAC CTC AAT GAC ATG GGA TGA ATC-3′),用这对特异引物对本次试验的28份材料进行PCR扩增,结果只有不同属的草胡椒材料无任何扩增,其它材料均扩增出了预期大小440bp的特异带。     

套式RT-PCR检测猪繁殖和呼吸综合征病毒的研究

参照ATCC VR-2332株及LV株保守区段设计了3条引物,以此建立了检测猪繁殖和呼吸综合征病毒的套式RT-PCR方法。利用其分别对ATCC VR-2332株、LV株及B13株进行套式RT-PCR,结果从3个不同地区分离的毒株中均能特异性的扩增出相应的片段,大小分别约为430bp(预期片段为430bp)、410bp(预期片段为413bp)及410bp(预期片段为413bP),而3个非PRRSV的病毒(猪瘟病毒、细小病毒及伪狂犬病毒)均未扩增出相应的片段。其敏感性可达到10^-2TCI     

三叶草斑潜蝇和美洲斑潜蝇的分子鉴定

以三叶草斑潜蝇Liriomyzatrifolii(Burgess)与美洲斑潜蝇LiriomyzasativaeBlanchand为材料,通过特异引物18SP1和5.8SP2,分别扩增出它们的rDNA非编码区ITS1的片段,根据序列分析和比较结果,重新设计出2条新的特异性引物Fly3和Flyus,并筛选到2个特异性内切酶,通过PCR和PCR产物的酶切分析,即可将这2种近缘昆虫区分开来。     

检测PCV2、PPV、PRV疫苗株与野毒株的多重PCR方法

本文建立了一种同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）、细小病毒（PPV）、及伪狂犬病毒（PRV）疫苗株与野毒株的多重PCR方法.根据GenBank上发表的PCV2、PPV和PRV gB、gE基因序列,针对各自保守区各设计一对特异性引物,用这四对引物对同一样品中的PCV2、PPV和PRV gB、gE进行检测,结果可同时扩增出269bp（PCV2）、581bp（PPV）、372bP（PRV gB）及147bp（PRV gE）四条特异性片段.对JEV、PRRSRV、大肠杆菌和双蒸水的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR能检出10pg PCV2、PPV和PRV gB、gE检测敏感度分别为10^-6.2、10^-3.8、10^-5.8TCID50的模板.该方法的建立对临床上进行这三种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测具有重要意义.     

基于线粒体COⅠ基因鉴别云斑尖塘鳢和线纹尖塘鳢的分子标记

云斑尖塘鱼鳢(Qxyleotris marmoratus)原产于泰国、越南等东南亚国家线纹尖塘鳢(Oxyeletris lineolatus)原产于澳大利亚,目前两者已成为中国的养殖品种。由于其同属塘鳢属(Oxyeleotris)形态相似,特别是在幼苗阶段难以识别,在苗种市场上常出现混淆,因此本研究研发了一种分子鉴定技术。通过对mtDNA中COⅠ(cytochrome C oxidase subunitⅠ)基因特异性位点比对和分析,设计并筛选出一对特异性引物(XW1)。特异性引物XW1可在线纹尖塘鳢中扩增获得170 by的单一产物,而在云斑尖塘鳢中无产物。通过PCR扩增产物的有无,可以区分两个物种。并在随机选择的30个样本中得到验证。本研究提供一种可以快速且不需要测序的方法来鉴别云斑尖塘鳢和线纹尖塘鳢。     

中药乌头及其近缘种的rDNA—ITS序列分析

运用PCR扩增产物直接测序的方法对云南、安徽的乌头及其近缘种植物的ITS区碱基序列测定。表明核糖体DNA中ITS区的完整序列（包括ITS1,ITS2和5．8s）,4种乌头属植物的ITS1序列长度为249bp,云南鸟头和安徽乌头及黄山鸟头ITS2序列长度为189bp,赣皖乌头ITS2序列长度为217bp。运用Mega2软件进行系统分析得到系统进化树。ITS序列特征是乌头鉴别的有效分子标记。