适合水稻悬浮培养细胞蛋白质组分析的双向电泳技术

水稻是研究植物蛋白质组学的一个重要试材,从蛋白质的提取,裂解缓冲液的成份和浓度,第一向聚焦的条件,蛋白上样量和二向胶的选择方面,对水稻悬浮培养细胞的双向电泳条件进行了比较和优化。结果表明,采用甲醇/氯仿沉淀蛋白,裂解缓冲液中加入0.5%的两性电解质、并加入盐桥,17cm的胶条、850μg的上样量可达到较好的等电聚焦效果;8%-16%梯度胶分离蛋白较为适宜。     

黄瓜子叶节的蛋白质组双向电泳条件的优化

对黄瓜离体子叶节的蛋白质双向电泳的条件进行优化的结果表明:黄瓜子叶节蛋白质主要分布在pH4～7范围,用酚抽提法制备蛋白质干粉,第一向等电聚焦固相pH梯度胶条(24 cm)的最适蛋白上样量为1 2001μg,第二向SDS-PAGE采用11.5%的分离胶,可以得到1100多个蛋白点.     

中枢神经蛋白质组分析中双向电泳技术的建立

建立和优化了中枢神经组织蛋白质组分析所需的双向电泳及相关技术.由于中枢神经组织结构的特殊性,样品处理非常困难.对样品液组成、样品处理、上样方式、上样量、IPG胶条和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法和保存等相关技术进行了比较研究和条件优化后,以固相pH梯度等电聚焦为第一向和SDS均一胶（T=12.5%）的水平电泳为第二向,成功地得到了神经组织双向电泳图谱.     

适用于水稻叶片蛋白质组分析的双向电泳技术

针对水稻叶片中含有大量色素和酚等干扰物质的现象,通过对水稻叶片蛋白提取方法、上样量和聚丙烯酰胺凝胶浓度等方面做了必要改进,建立了一套适用于水稻叶片蛋白质组分析的双向电泳（2-DE）方法。     

衫木叶片蛋白质组的双向电泳技术优化

为建立适用于杉木(Cunninghaimia lanceolata)叶片蛋白质组研究的双向电泳技术,对杉木叶片蛋白质的溶解方法、上样量、IEF及SDS-PAGE电泳等关键步骤进行了优化。结果表明,杉木叶片蛋白质主要分布在pH4-7范围;裂解液中含有硫脲(2mmol/L)才能较充分地溶解蛋白,DTT浓度为60mmol/L、上样量1.5mg时得到的图谱分辨率较好且蛋白斑点分布均匀、清晰,拖尾现象明显减少,平衡液Ⅱ中碘代乙酰胺浓度为450mg(15ml)-1时能提高图谱分辨率;采用与质谱兼容的考马斯亮兰进行染色,得到近700个蛋白点。     

蛋白质双向电泳图像分析

随着人类基因组计划的接近完成,蛋白质组（proteome）研究成为新的热点.其中高分辨率的双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）技术使对组织或细胞的整个蛋白质组的综合分析成为可能.近年来这一技术有了很大的改进和提高,特别是图像分析系统,算法更为先进,功能日益强大,操作也更简便,为大规模研究提供了良好的工具.使用新一代的2D图像分析系统,对离体培养的雪旺氏细胞的蛋白质样品双向电泳结果进行了初步分析,探讨了在图像扫描、点检测、背景消除、匹配、结果报告和数据分析各步中的技术问题,并报告了进行2D图像分析的体会.     

蛋白质双向电泳图像分析

随着人类基因组计划的接近完成,蛋白质组（proteome）研究成为新的热点.其中高分辨率的双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis,2-DE）技术使对组织或细胞的整个蛋白质组的综合分析成为可能.近年来这一技术有了很大的改进和提高,特别是图像分析系统,算法更为先进,功能日益强大,操作也更简便,为大规模研究提供了良好的工具.使用新一代的2D图像分析系统,对离体培养的雪旺氏细胞的蛋白质样品双向电泳结果进行了初步分析,探讨了在图像扫描、点检测、背景消除、匹配、结果报告和数据分析各步中的技术问题,并报告了进行2D图像分析的体会.     

枸杞花药蛋白质组双向电泳体系的建立及应用

采用改良TCA丙酮沉淀结合Tris-HCl法提取枸杞花药蛋白质,对蛋白质裂解液成分、IPG胶条的pH范围、上样量及染色方法进行了探索.结果表明:(1)采用17 cm胶条、400 μg的上样量、含有2 mol/L硫脲的裂解液,硝酸银染色,可得到重复性好、质量高的枸杞花药蛋白2-DE图谱,枸杞花药蛋白主要集中在pH 4～7范围.(2)采用该体系分析了‘宁杞1号’和‘宁杞5号’四分体时期花药蛋白,并利用PDQuest 8.0软件在pH 4～7的2DE图谱上检测到500多个蛋白点,其中差异表达量大于2倍的蛋白有25个.     

汾酒大曲宏蛋白质组的制备与双向电泳技术的建立

采用TCA-丙酮沉淀法、丙酮沉淀、硫酸铵等沉淀法制备汾酒大曲的宏蛋白组样品,并用双向电泳来检测制备效果,结果表明：TCA-丙酮沉淀法制备的样品经电泳分离后,减轻了杂质干扰,其2-DE图谱中竖条纹干扰较少,且获得的蛋白点形状规则、清晰且无明显重叠现象,优于其它两种方法;经过两次水化液溶解的蛋白样品在等电聚焦时能保持4000 V较高电压;上样量为300μg左右的粗蛋白溶于二次水化液能得到点数更多、分辨率高的电泳图谱。建立了汾酒大曲宏蛋白质组的双向电泳体系,为汾酒品质研究奠定基础。     

发菜蛋白质组双向电泳技术的建立及优化

为建立适用于发菜(Nostoc flagelliforme)蛋白质组研究的双向电泳技术,对发菜蛋白质的提取、裂解、上样量、IEF及SDS-PAGE电泳等关键步骤进行了优化,结果显示:发菜蛋白质主要分布在pH 4～7范围内,采用改良TCA法可提高提取液中蛋白质的含量和双向电泳图谱的分辨率,裂解液含60 mmol/L DTT,24 cm IPG胶条上样量1.5 mg时不仅提高了蛋白质的溶解性,而且改善了双向电泳的分离效果,得到近800个蛋白点,且蛋白点清晰,图谱分辨率较好.采用优化后的双向电泳体系提高了发菜蛋白质双向电泳的分辨率和重复性,建立起一套适用于发菜蛋白质组分析的双向电泳方法.     

红色红曲菌蛋白质组双向凝胶电泳体系的建立

红曲菌是一种具有较高食用和药用价值的丝状真菌,能够产生红曲色素、莫纳可林K等多种生理活性物质。通过分析比较培养基、蛋白质裂解液组成以及水化上样条件对双向电泳结果的影响,建立了红色红曲菌蛋白质组的双向凝胶电泳体系,为从蛋白质水平研究红曲菌及其次级代谢产物的生物合成提供依据。结果表明：用YES培养基培养红色红曲菌6 d,TCA 丙酮法提取菌体总蛋白质,蛋白质裂解液组分为8mol/L尿素,2mol/L硫脲,4 % CHAPS,1 % DTT和2 % Bio-lyte,可获得蛋白质样点数量多,清晰度高的双向电泳图像,为进一步研究红曲菌蛋白质组奠定了基础。     

适用于双向电泳分析的水稻悬浮细胞外分泌蛋白提取方法

目的:建立适用于双向电泳分析的水稻悬浮细胞外分泌蛋白提取方法。方法:采用酚抽提结合甲醇醋酸铵沉淀法、三氯乙酸-丙酮沉淀法和硫酸铵沉淀等3种方法制备水稻悬浮细胞外分泌蛋白,并进行双向电泳分析;利用Western印迹对候选方法提取的外分泌蛋白进行纯度检测。另外,还利用质谱技术对从双向电泳胶上随机挑选的9个蛋白点进行测定,并用SignalP 3.0 Server对测定的蛋白点进行信号肽预测。结果:酚抽提结合甲醇醋酸铵沉淀法提取的外分泌蛋白得率最高,且双向电泳图谱清晰,并能检测到最多的蛋白点;Western印迹表明利用该法所提取的外分泌蛋白未被细胞内蛋白质污染。利用质谱技术鉴定了随机挑选的9个蛋白点,SignalP 3.0 Server分析表明其中6个蛋白含有信号肽。结论:酚抽提结合甲醇醋酸铵沉淀法是一种适用于双向电泳分析的水稻悬浮细胞外分泌蛋白提取方法。     

水稻根质膜蛋白质组双向电泳水化液的优化

以水稻(Oryza sativa L.)苗期幼嫩根尖作为材料,利用葡聚糖-聚乙二醇两相分配法纯化得到纯度达90%的质膜组分,使用4种不同的水化液溶解质膜蛋白,进行IEF/SDS-PAGE双向电泳和MALDI-TOF/TOF质谱分析.结果显示,4种水化液中,以7 mol/L Urea2、mol/L Thiourea、4%CHAPS、20 mmol/L DTE、1%ASB14的条件对膜蛋白的溶解效果和双向电泳分离效果最好;16个被鉴定蛋白中有9个为质膜相关蛋白,5个为未知蛋白,来自其它细胞器的蛋白仅有2个.研究表明,在常用水化液中添加磺基甘氨酸三甲内盐ASB14有利于植物细胞质膜蛋白质组的分析,并且该优化条件下的双向电泳适合分离水稻质膜中亲水性相对较高的膜附着蛋白.     

蝴蝶兰叶片蛋白质双向电泳方法初探

针对蝴蝶兰叶片蛋白质含量少且含有大量色素和酚等干扰物质的特点,通过对总蛋白提取方法、银染方法的改进,以及双向电泳实验条件的比较选择,初步建立一套适用于蝴蝶兰叶片蛋白质组分析的双向电泳技术。     

灰木相思蛋白质组双向电泳条件的优化

针对灰木相思(Acacia implexa Benth.)蛋白质提取过程中含有大量色素和酚等干扰物质的现象,进行了实验条件的优化,结果显示:选择含较少次生物质量的组培苗为实验材料更易得到清晰的双向电泳图谱,在裂解液中添加硫脲更有利于提高蛋白溶解度,第一向等电聚焦固相pH梯度胶条(24 cm)的最适蛋白上样量为1000μg,表明采用优化后的双向电泳体系提高了灰木相思总蛋白双向电泳的分辨率和重复性,建立起一套适用于灰木相思总蛋白质组分析的双向电泳(2-DE)方法.     

应激心肌细胞蛋白质组双向凝胶电泳分析

采用双向凝胶电泳技术和计算机辅助的图像分析方法 ,对去甲肾上腺素诱导的应激心肌细胞与正常心肌细胞蛋白质进行分离和比较分析 .正常心肌细胞可分离 12 32± 5 6个蛋白点 ,蛋白点匹配率为 83 3%± 1 0 %.有 11种蛋白质在NE应激后发生了明显和稳定的质和量的改变 (P <0 0 5 ) ,其中 6种 (Mr pI :4 9 7kD 7 8,38 3kD 5 9,37 1kD 6 6 ,2 9 3kD 7 4 ,18 7kD 6 1,18 5kD 7 7)在应激后表达降低 ,4种 (Mr pI:4 7 6kD 5 5 ,31 9kD 4 4 ,2 6 6kD 4 6 ,33 2kD 8 1)在应激后表达增高 ,1种 (Mr pI:19 4kD 6 9)只在应激后发生表达 .这些差异表达的蛋白质可能参与了心血管应激反应乃至应激损伤发生的过程 .     

黄瓜叶片胞间隙蛋白质双向电泳体系的建立

以黄瓜种质‘PI088’幼苗为材料,提取胞间隙液,制备蛋白样品,通过对不同IPG胶条、等电聚焦条件、分离胶浓度、上样量等条件的探索,建立适合黄瓜叶片胞间隙蛋白质组的双向电泳体系.结果显示:(1)用pH 3～10的非线性IPG胶条,等电聚焦时间为70 000 Vh,分离胶浓度为10％,上样量为800 μg时,能够得到较好的2-DE图谱.(2)利用所建立的双向电泳体系找到了对照及接种霜霉菌后2d的黄瓜叶片胞间隙差异蛋白,其中的12个上调表达点和10个下调表达点的表达量变化在1.5倍以上.并选取一个差异点成功进行了质谱分析.(3)质谱分析结果显示,所找的差异点为一种酸性的几丁质酶,等电点为4.27.可见,采用所建立的双向电泳体系可获得分辨率高、重复性好的2-DE图谱并能很好地用于质谱分析.     

蛋白质组学研究中的双向电泳技术

蛋白质组学研究已经成为后基因组时代的研究热点,其两大支柱是双向凝胶电泳技术和生物质谱技术。尽管双向电泳技术近几年已经取得了突破性进展,是当前蛋白质分离的最常用技术,但其本身还有一些难以克服的问题。随着质谱技术的快速发展,双向电泳逐渐成为蛋白质组学研究的瓶颈。本综述双向电泳主要技术步骤的现状、存在问题及其改进方向。     

多子房小麦蛋白质双向电泳体系的建立及优化

为建立适用于显性多子房小麦细胞质效应的蛋白质双向电泳体系,以显性多子房小麦材料DUOII与特异细胞质材料TeZhiI杂交的F1幼穗为材料,采用TCA-丙酮法提取蛋白质,并在IPG胶条长度和pH范围、SDS-PAGE凝胶浓度及蛋白质上样量等方面,对多子房小麦幼穗蛋白质双向电泳体系进行了探究与优化.结果表明,本文采用的蛋白质定量方法准确度高(R²=0.9999),确立了17 cm, pH4～7的IPG胶条, 12% SDS-PAGE分离胶,上样量为900 μg的双向电泳方法体系,获得了最适合本研究蛋白质组分析的双向电泳图谱. 经PDQuest 2DE 8.0.1软件分析,2-DE图谱上可分辨出1.444±14个清晰蛋白质点,且重复性较高(95%), 相关系数为0.960. 建立了一套适用于显性多子房小麦细胞质效应研究的蛋白质双向电泳体系.