加兰他敏在忽地笑营养器官中的定位(简报)

石蒜属植物为具有地下鳞茎的多年生草本植物．有重要的药用价值,全属植物约有20余种。我国有石蒜属植物约15种,集中分布于长江中下游地区,野生资源比较丰富。忽地笑（Lycorisaurea Herb．）是石蒜属植物在我国分布较广泛的一种。加兰他敏（Galanthamine）等生物碱是石蒜属植物中主要的药用成分。[第一段]     

南京地区两种石蒜不同生长时期中石蒜碱、加兰他敏和力可拉敏含量的比较

本试验采用薄层层析分离和分光光度法测定南京地区黄花石蒜和红花石蒜不同生长时期中三种生物碱的含量,黄花石蒜鳞茎中石蒜碱的含量:叶子出土期>开花初期>生长旺盛期>叶子变黄期。加兰他敏和力可拉敏的含量:开花初期>叶子出土期,生长旺盛期>叶子变黄期。开花初期的红花石蒜鳞茎中石蒜碱的含量多于黄花石蒜,而加兰他敏和力可拉敏则相反。黄花石蒜叶子变黄期的叶子中加兰他敏和力可拉敏的含量多于生长旺盛期,而在这两个时期的叶子中加兰他敏均多于力可拉敏。试验结果表明,南京地区两种石蒜在12月叶子出土期和8月开花初期的石蒜碱、加兰他敏和力可拉敏含量较高。此段期间采集药材似较适宜。黄花石蒜(Lycoris aurea Herb)和红花石蒜(Lycoris radiata Herb)均属于石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜属,为多年生草本植物。上尾等曾系统地从红花石蒜中先后分出石蒜碱(Lycorine)、多花水仙碱(Tazettine)、伪石蒜碱(Pseudolycorien)、加兰他敏(Galanthamine)和力可拉敏(Lycoramine)等十多种生物碱。Boit等从黄花石蒜中分出石蒜碱和加兰他敏。中国科学院上海药物研究所洪山海等从紫花石蒜(Lycoris squamigera Maxim)鳞茎中分得19种结晶性生物碱。从石蒜属分出的多种生物碱,其中已知可供药用的有石蒜碱、加兰他敏和力可拉敏等。在一系列的药理研究中,已经证实,石蒜碱具有抗炎,解热和催吐等作用。加兰他敏和力可拉敏对胆碱酯酶具有抑制作用,力可拉敏季铵化后对外周胆碱能效应器的作用增强。石蒜碱、加兰他敏和力可拉敏在国内已进行生产,据有关单位称,得率不稳。本文的目的是分析南京地区两种石蒜不同生长时期中不同部位的石蒜碱、加兰他敏和力可拉敏的含量,这将为药材采集提供有益的资料。     

超声波法提取野生石蒜中加兰他敏

石蒜是我国丰富的野生资源之一,其鳞茎富含重要药用成分加兰他敏。为了获得石蒜中加兰他敏的超声波提取方法,以野生石蒜为原料,用乙醇作提取剂,探讨了超声波提取加兰他敏的工艺条件,并与常规溶剂法进行了比较。分析了料液比、超声波功率、提取温度、提取时间、提取次数等因素对加兰他敏提取效果的影响,运用正交实验L9(34)确定了最佳提取工艺条件。结果显示,超声波提取加兰他敏的最佳工艺条件为:料液比1:6,超声波功率250 W,提取温度60℃,提取时间1.5 h,提取2次;加兰他敏的提取率为94.6%,产率为0.0543%;提取物中加兰他敏含量为15.53%。与常规溶剂法相比,超声波法具有用时少、提取率高、提取次数少等优点,整体效果优于常规溶剂法。     

石蒜科生物碱的研究 Ⅵ.加兰他敏和力可拉敏的薄层层析及纸层析鉴别法

加兰他敏(galanthamine)为一种胆碱酯酶抑制剂,临床应用于治疗小儿麻痹症后遗期和重症肌无力等有较好的疗效。1964年我们报道了利用国产石蒜为原料进行加兰他敏工业生产的研究已获成功,并推广于生产。但是,由于加兰他敏及其类似结构的力可拉敏(lycoramine)常常并存于国产石蒜中。虽然力可拉敏经我所唐希灿等研究,证明也具有胆碱酯酶抑制剂的药理特性,但两者的作用强度和毒性均不相同。因此两者的鉴别     

干旱胁迫下外源氯化钙、水杨酸和一氧化氮对石蒜抗旱性的影响

通过盆栽试验,研究了外源氯化钙（CaCl2）、水杨酸（SA）和NO供体硝普钠（SNP）处理对干旱胁迫下石蒜抗旱性的影响。结果表明,较低浓度的CaCl2对石蒜抗旱性的影响不显著,而随着CaCl2预处理浓度的提高,石蒜的抗旱效果显著增强。较低浓度SA和sNP可显著提高石蒜的抗旱性,而高浓度则会发生毒害作用。利用模糊隶属函数法综合评价渗透调节物质、膜系统和抗氧化酶活性多项指标可以得出,喷施10mmol·L—CaCl2、2mmol-L。SA和0．5mmol·L-1 SNP对石蒜抗旱性的提高具有显著效果。     

忽地笑LaABCG3转运蛋白基因的克隆与表达分析

石蒜科植物体内的生物碱具有重要的药用价值,尽管部分生物碱的生物合成途径已被发现,但与其相关的转运机制尚未报道。本研究在忽地笑(Lycoris aurea)经茉莉酸甲酯(MeJA)处理后的差异转录组测序数据的基础上,发现了一个ABC转运蛋白基因,并命名为ABCG3。采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了该基因的编码区全长2157bp,编码719个氨基酸,包含6个跨膜结构域。LaABCG3的组织分布与生物碱积累组织相重合。此外,在MeJA处理下,LaABCG3的表达量和石蒜科生物碱,包括加兰他敏、石蒜碱、水仙环素的含量均受到显著诱导。本研究为探索忽地笑中石蒜科生物碱的转运和积累机制打下了基础。     

基于叶绿体DNA atpB-rbcL区序列探讨石蒜属种间系统发育关系

摘要：为了探讨石蒜属（Lycoris Herb.）的种间系统发育关系,对石蒜属95个材料包括15种、4变种及2个人工杂种的叶绿体 DNA atpB-rbcL间隔区进行了测序,结合花部形态和核型特征,探讨了石蒜属种间系统关系及其可能的杂交起源,结果表明：在系统发育树上亲缘关系近的材料聚在一起,其中矮小石蒜（L. radiata var. pumila）和换锦花（L. sprengeri）与2个人工杂交种（Hybrid 1、Hybrid 2）、麦秆石蒜（L. straminea）、江苏石蒜（L. houdyshelii）、短蕊石蒜（L. caldwellii）和乳白石蒜（L. albiflora）具有密切的亲缘关系。atpB-rbcL序列揭示的石蒜属种间关系与染色体核型的分类结果部分一致,主要表现在具有近端部着丝粒(A)染色体的种与具有中部(M)和端部(T)着丝粒染色体的种各成一支,与形态和染色体分类结果一致;不同之处在于具有中部、端部和近端部着丝粒染色体的种分散在两个主要分支内,进一步验证了具有中部、端部和近端部3种着丝粒类型染色体组的石蒜如麦秆石蒜、江苏石蒜、短蕊石蒜和乳白石蒜等是杂交起源的假设,结合2个人工杂交种分析,揭示了短蕊石蒜和乳白石蒜的近端部着丝粒染色体来源于换锦花;麦秆石蒜和江苏石蒜近端部着丝粒染色体来源于矮小石蒜。     

石蒜生长对杂草群落组成及物种多样性的影响

通过野外调查,研究了石蒜（Lycoris radiata）对群落杂草组成和物种多样性的影响。结果表明：石蒜的生长能减少群落中物种的种类,降低群落中杂草的密度,并减少商陆（Phytolacca aeinosa）、蹄盖蕨（Athyrium fricellia）及禾本科（Granmeae）几个物种的数量,群落的物种多样性指数降低,群落均匀度提高。群落相似度与没有石蒜分布的群落相比显著降低。说明石蒜改变了杂草的群落结构,有利于限制杂草的发生危害。     

利用SRAP标记分析中国野生石蒜的遗传多样性

采用SRAP（Sequence-related amplified polymorphism,序列相关扩增多态性）标记对中国13个省24份野生石蒜（Lycoris radiata）资源94个样品进行了检测。10个引物组合共扩增出218条带,其中173条为多态性条带,多态性百分比达79.36%。石蒜的观测等位基因数（na）、有效等位基因数（ne）、基因多样性指数（h）、Shannon信息指数（I）分别为1.7936、1.4131、0.2415和0.3664。石蒜不同种源间的遗传分化系数（Gst）达0.9547、基因流（Nm）仅0.0136,表明种源间遗传分化显著,遗传变异主要存在于种源间。根据Nei′s遗传距离对24份种源进行UPGMA聚类,所有石蒜种源聚成两大类,第I大类由7份种源组成,除江苏连云港的石蒜（JS3）外,均来自我国西南或西北地区;其余的17份种源构成第II大类,它们遍及华南、华中和华东地区;各大类中的分支结果与野生石蒜外部形态及生长发育习性有一定联系。将石蒜种源的遗传多样性与其所处的经度、纬度、海拔、年均降雨量、年均温等进行相关性分析,结果显示它们之间的相关性均不显著,即石蒜对环境依赖性小,能分布在各种生境中。根据以上结果,我们认为野生石蒜具有较丰富的遗传多样性,而种源间遗传分化显著的原因主要是基因流的隔离。研究结果对我国的野生石蒜资源的开发利用与保护有重要意义。     

忽地笑愈伤组织培养条件对加兰他敏合成的影响

研究了忽地笑次生代谢产物加兰他敏的合成以及各种理化因子对加兰他敏合成的影响。结果表明,蔗糖是忽地笑愈伤组织培养的最佳碳源,而且在90 g/L浓度培养下加兰他敏含量最高,达到0.068%;附加500 mg/L苯丙氨酸前体物也可提高加兰他敏产量。酪氨酸和水杨酸不利于加兰他敏的积累。此外,2,4-D和浓度高于0.5 mg/L的NAA、IBA抑制加兰他敏的合成,但高浓度的6-BA却对加兰他敏的合成起促进作用。     

小鼠Kupffer细胞分离及细胞培养

目的 采用在体胶原酶灌注、不连续密度梯度离心、选择性贴壁3步法分离Kupffer细胞（Kupffer cells,KCs）,探讨其在分离小鼠KCs的应用及其对KCs生物活性的影响.方法 根据原位灌注和梯度离心方法不同随机分为4组：无胶原酶原位灌注＋3层梯度离心组（A）、无胶原酶原位灌注＋双层梯度离心组（B）、胶原酶原位灌注＋3层梯度离心组（C）和胶原酶原位灌注＋双层梯度离心组（D）.采用F4/80（BM8）免疫染色及吞墨实验判断细胞纯度和功能、台盼蓝拒染实验判断细胞的活力,探讨不同方法KCs分离的效果及细胞活性.结果 刚分离的KCs细胞近似圆形,接种l h后收获细胞纯度较高,但细胞得率相对较低.培养4 h后KCs得率相对较高,培养28 d仍能存活.免疫荧光可显示分离的为KCs,台盼蓝染色显示各组细胞的活力均在90 %左右,在体胶原酶灌注和双层梯度离心可以增加KCs的得率,双层梯度离心法可以增加分离KCs的纯度.结论 在体胶原酶灌注对提高KCs得率较为重要,在体胶原酶灌注、不连续密度梯度离心、选择性贴壁3步法分离小鼠KCs的的方法简便、高效、稳定,培养的KCs具有良好的细胞生物学性状.     

小麦小花高纯度线粒体的分离及其蛋白质双向电泳体系建立

应用差速离心和Percoll不连续密度梯度法分离纯化小麦三核期小花线粒体. 在裂解液选择、IPG胶条pH值范围、SDS-PAGE胶浓度及蛋白质上样量等方面对线粒体蛋白质双向电泳体系进行探索和优化,确立了一套适用于小麦小花高纯度完整线粒体的分离方法及其蛋白质双向电泳的技术体系. 结果表明,采用20%、24%和40% Percoll密度梯度和28% Percoll自形成密度高速离心体系,获得了有活性、高纯度且较完整的线粒体;经TCA-丙酮法提取蛋白,以7 mol/L尿素,2 mol/L硫脲,4% CHAPS(W/V),65 mmol/L DTT,0.5% IPG缓冲液(V/V),0.001% 溴酚蓝(W/V)裂解液溶解蛋白,采用17 cm,pH 4～7 IPG胶条和11% SDS-PAGE分离胶,上样量为160 μg,硝酸银染色法,更适合小麦小花线粒体蛋白质组双向电泳分离. 经PDQuest 2DE 8.0.1软件包统计分析,在2-DE图谱上分辨出约150个蛋白点,蛋白点清晰呈圆形,无横条纹干扰,这为利用双向电泳技术在亚细胞水平对线粒体进行蛋白质组学研究与分析奠定了基础,更为进一步分析研究线粒体与雄性不育的关系提供了理论与技术支撑.     

超声波提取加拿大蓬总黄酮的研究

目的:研究加拿大蓬中总黄酮提取方法及最佳工艺.方法:采用超声提取法,通过单因素试验和正交试验筛选最佳工艺条件.结果:最佳提取条件为60%乙醇、料液比1:20、60 kW下超声45 min.得率为31.076 mg/g.结论:该方法提取提取总黄酮快速、简便,可适用于生产中加拿大蓬总黄酮类物质的检测.该方法是提取加拿大蓬总...     

柞蚕微孢子虫孢子分离纯化方法

柞蚕微粒子病是柞蚕Antheraea pernyi(Guérin-Méneville)的主要胚胎传染性病害,病原为柞蚕微孢子虫Nosema pernyi(Wenet Ding),其病原分离提纯技术研究对于柞蚕微粒子病的防治具有重要意义。本文利用差速离心和Percoll密度梯度离心法研究了柞蚕微孢子虫孢子的分离纯化方法,结果表明,采用不连续密度梯度分离纯化柞蚕微孢子虫孢子的效果比单一浓度的效果好,以浓度为25%、50%、75%、100%不连续梯度,15000r/min离心30min分离纯化得到的柞蚕微孢子虫孢子纯净度高。     

提取航天诱变向日葵种子总RNA的一种有效方法

目的:从航天诱变向日葵种子中提取高质量的总RNA.方法:采用改进的SDS法,提取缓冲液与氯仿同时作用液氮研磨材料后,用酸酚-氯仿抽提一次,经LiCl过夜沉淀、DNase I处理、1/2体积的无水乙醇沉淀多糖,最后加入1/10体积的醋酸钠和2倍体积的无水乙醇沉淀总RNA,用琼脂糖凝胶电泳与紫外分光光度法测定产量与纯度,用...     

琯溪蜜柚汁胞RNA提取方法的比较

比较了3种从琯溪蜜柚汁胞中提取RNA的方法,通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测,对提取所得RNA的完整性、纯度及浓度进行分析。试验结果表明,Trizol法适合琯溪蜜柚汁胞RNA的提取,能有效获得纯度高、完整性好的RNA样品,而且Trizol法步骤简单,RNA得率与质量均较高。通过RT-PCR检验表明该RNA适于后续分子生物学操作。     

一种快速、经济提取外周凝血基因组DNA方法的建立

目的：建立一种经济、快速且高质量提取人体外周凝血DNA的方法。方法：摸索最佳的匀浆条件,对外周凝血块进行匀浆,采用Ⅺ法对匀浆液进行基因组DNA的提取,通过凝胶电泳、单重PCR和多重PCR检测凝血基因组DNA的提取产量和质量。并分别与常规的凝血基因组DNA提取方法,即蛋白酶K消化法,以及提取抗凝血基因组DNA的Ⅺ法进行比较分析。结果：最佳的匀浆条件为：39000map,15秒。在此条件下提取的基因组DNA完整性好,纯度和产量与蛋白酶K消化法提取凝血DNA和KI法提取抗凝血DNA的结果相比,没有统计学差异。单重PCR和多重PCR也获得了理想的扩增结果。结论：与常规的外周凝血提取方法相比（蛋白酶K消化法）,本方法节省了时间和成本,能快速、经济、有效地提取外周凝血基因组DNA,可用于后续的科研和临床诊断需要,解决了部分科研机构血液基因组DNA的样本来源问题。     

一种改良的大豆线粒体DNA提取方法

以大豆(Glycine max (L.) Merrill)黄化苗为材料,通过优化提取线粒体DNA(mtDNA)时差速离心过程中的离心力和离心时间,以及纯化过程中设置不同的蔗糖密度梯度和裂解液浓度,结合高盐法去除蛋白质,改良大豆mtDNA的提取方法。结果表明,该方法提取的mtDNA浓度和纯度较高,无叶绿体和核基因组DNA的污染,可用于后续大豆线粒体基因组的相关研究。     

人外周血单核细胞的分离和电穿孔法转染

目的:建立分离纯化人外周血单核细胞及转染的有效方法。方法:应用基于HISTOPAQUE的密度梯度离心及抗体标记纯化的方法分离单核细胞,并以电穿孔技术转染绿色荧光蛋白(GFP)表达质粒、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)小干扰RNA。结果:基于外周血单核细胞的表面标志分子CD14的流式细胞分析表明得到了高纯度(89.95%)的外周血单核细胞;GFP荧光照片显示GFP表达质粒的转染效率为60%～70%;免疫印迹显示TRAF6的表达抑制(90%)下调了脂多糖(LPS)对JNK的激活,说明通过电穿孔技术有效递送了TRAF6小干扰RNA,表明单核细胞若缺少TRAF6将抑制LPS-TLR4信号通路的激活。结论:建立了一种高效的从人外周血中分离原代单核细胞的方法,且应用基于NucleoFectorⅡ的电穿孔技术实现了对此原代单核细胞的高效转染,为进一步外周血单核细胞的相关功能研究奠定了方法学基础。     

石蒜Mg^2＋转运体基因LrMGT的克隆与分析

从石蒜〔Lycoris radiata（L’Hér.）Herb.〕叶片全长cDNA文库中克隆获得Mg^2＋转运体（MGT）基因LrMGT。序列分析结果显示：LrMGT基因的cDNA序列全长1 726 bp,其中开放阅读框（ORF）长度921 bp,编码306个氨基酸。石蒜LrMGT基因编码的氨基酸序列的理论相对分子质量为33 635,理论等电点为pI 5.14,为疏水性膜蛋白,不具有信号肽。序列比对结果表明：石蒜LrMGT基因编码的氨基酸序列与小米〔Setaria italica（Linn.）Beauv.〕、水稻（Oryza sativa Linn.）和拟南芥〔Arabidopsis thaliana（Linn.）Heynh.〕等植物的MGT基因编码的氨基酸序列的相似性较高,相似度达到72%~76%;石蒜LrMGT基因与其他植物MGT基因编码的氨基酸序列的保守区域较大,均具有较高的保守性。在NJ系统树上石蒜LrMGT基因编码的氨基酸序列与禾本科（Gramineae）植物二穗短柄草〔Brachypodium distachyum（Linn.）Beauv.〕、水稻、高粱〔Sorghum bicolor（Linn.）Moench〕和小米MGT基因编码的氨基酸序列聚为同一个分支,表明它们可能具有较近的进化关系。实时荧光定量PCR结果表明：石蒜LrMGT基因在根和鳞茎中的相对表达量较高,在叶片和花中的相对表达量较低,具有明显的组织特异性。