超高静压在琥珀酸生产菌株选育中的应用

采用超高静压对一株产琥珀酸放线杆菌A3进行诱变育种,进一步提高其生产性能.考察了压力、变压速度、生长期对菌株致死率的影响.在压力为200 MPa,50 MPa/min变压速度的诱变条件下对稳定期菌株进行诱变,筛选到一株突变菌株产琥珀酸放线杆菌B19,琥珀酸产量达到32.2 g/L,比出发菌株A3提高了17.9%,代谢副产物乙酸的产量降低了11.5%,经过6次传代表明突变菌株具有稳定的遗传特性.     

产琥珀酸放线杆菌发酵生产琥珀酸的研究进展

近年来,因瘤胃微生物产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes具有高的琥珀酸产量,并能够利用多种碳源进行发酵等优点,在利用发酵法生产琥珀酸领域具有广泛的应用前景和商业化价值,因而其代谢途径和发酵工艺等基础研究成为国内外研发的热点。近年来,人们在产琥珀酸放线杆菌的代谢途径、琥珀酸发酵动力学模型、新型经济培养基以及高产菌株选育等方面的研究取得了很大进展,对研发琥珀酸发酵工艺、降低生产成本和节能减耗等具有重要的理论意义。     

琥珀酸放线杆菌的耐高浓度钠离子菌株选育

以琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593为出发菌,经过紫外线和甲基磺酸乙酯(EMS)诱变处理,选育出一株耐高浓度钠离子菌株SE-6.该菌株在5 L发酵罐中进行分批发酵,单独使用Na2CO3控制发酵过程pH,发酵48 h琥珀酸产量达到35.8g/L,较出发菌(26.0 g/L)提高了37.7%;若采用MgCO3和Na2CO3共同调控发酵过程pH,发酵48 h琥珀酸产量达到45.0 g/L,较出发菌(37.4g/L)提高了20.4%.     

琥珀酸发酵菌种研究进展

琥珀酸作为一种重要的化学中间体的潜力已经为人们所认识,而发酵法生产琥珀酸是使这一潜力变为经济上可行的最好方法之一。菌种在发酵法中占有非常重要的地位,是决定整个过程的关键。系统介绍了关于发酵法生产琥珀酸的菌种研究进展,并对各种菌株的发酵特点和问题做了分析,最后展望了菌种的发展方向。     

基因组改组技术选育耐酸性琥珀酸放线杆菌

以琥珀酸产生菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593为出发菌,分别经过紫外线-甲基磺酸乙酯(UV-EMS)和紫外线-硫酸二乙酯(UV-DES)诱变处理,得到7株耐酸性有所提高的突变株.以此作为候选菌库,经3轮原生质体递进融合,筛选获得4株可以在pH 5.6下生长的改组菌株.其中改组菌株F3-21在pH 5.6的完全液体培养基中生长的OD值是原始菌的7倍,在pH 5.2条件下仍能生长;其摇瓶发酵48h琥珀酸产量较原始菌株提高48%.在5L发酵罐中进行分批发酵,当控制pH在较低值(5.6～6.0)时,F3-21厌氧发酵48h积累琥珀酸38.1g/L,较出发菌株提高了45%;当控制pH在6.5～7.0时,F3-21厌氧发酵32h积累琥珀酸40.7g/L.F3-21在5L发酵罐中进行补料分批发酵,厌氧发酵72h,产琥珀酸达67.4g/L.结果说明基因组改组技术能够改进琥珀酸放线菌的耐酸性能及其琥珀酸的产量.     

琥珀酸发酵高产菌株的选育

以富马酸钠为唯一碳源的选择性平板,从牛的瘤胃中筛选出一株产琥珀酸的菌株Actinobacillus succinogenes CGMCC1593。以该菌株为出发菌株进行NTG诱变,挑选在含有50~100 mmol/L氟乙酸平板生长较快的菌落,经过初筛和复筛,发现SF-9菌株产琥珀酸能力强且积累的乙酸较少。以50 g/L的葡萄糖为碳源,在培养瓶厌氧发酵条件下其琥珀酸产量(35.09 g/L)比出发菌株(28.91 g/L)提高了21.4%,琥珀酸/乙酸比率(w/w)从3.3∶1提高到7.5∶1。用SF-9菌株在5 L发酵罐上进行分批发酵,发酵36 h时琥珀酸积累量达到40.51 g/L,对葡萄糖的转化率为0.81(w/w),琥珀酸/乙酸比率为9∶1,副产物乙酸量比出发菌株降低了约50%。     

产琥珀酸放线杆菌的原生质体制备与再生

基因组重组技术是一项重要的菌种改造技术,原生质体制备和再生是进行基因组重组的前提和基础。目前少有关于产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC2650原生质体研究的报道。为了优化该菌的原生质体制备和再生条件,及利用基因组重组技术构建优良菌种提供参考,研究了甘氨酸预处理,菌龄,酶浓度,作用时间,温度对产琥珀酸放线杆菌原生质体制备和再生的影响,并考察了不同渗透压稳定剂对其再生的影响。结果表明,菌体在添加了0.6mg/ml甘氨酸的TSB培养基中培养5h后收集,用SMM稀释到OD660=1.0,用0.025mg/ml溶菌酶在37℃下酶解45min制备原生质体,将原生质体涂布于含0.3mol/L蔗糖的再生培养基中,再生率最大,达到40.9%。确定了产琥珀酸放线杆菌原生质体制备和再生的最佳条件,所用的原生质体制备的方法对琥珀酸的产生没有影响,这为进一步开展该菌的原生质体诱变及基因组重组等研究奠定了基础。     

耐铵型产琥珀酸放线杆菌的选育及铵离子对其生长代谢的影响

经硫酸二乙酯(DES)诱变,在含61～242mmol/LNH4+梯度平板中,筛选到一株耐铵型突变株YZ25,该菌株在含121mmol/LNH4+发酵培养基中,琥珀酸产量达32.68g/L,转化率为65.4%,比出发菌提高了180.5%。进一步考察了不同形态铵盐对YZ25生长的影响,结果表明添加少量铵盐能够提高突变菌的生长速率,但当超过一定量后菌株生长受到抑制,不同铵盐对菌株的抑制程度不同,硫酸铵、碳酸氢铵、氯化铵和硝酸铵对突变株YZ25的半抑制浓度分别为:215mmol/L、265mmol/L、235mmol/L、210mmol/L。为了考察铵离子对YZ25发酵产琥珀酸的影响过程,在3.0L发酵罐以氨水作为pH的调控剂发酵,结果表明在稳定期前菌株生长基本不受铵离子抑制,生物量能够达到正常水平,但是进入稳定期后铵离子抑制作用越来越明显,导致菌株生长提前结束,耗糖不完全,产酸受阻。最后结合产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes代谢途径分析了铵离子对菌株抑制作用的机理。     

产琥珀酸放线杆菌的分离鉴定及其对瘤胃微生物发酵的影响

采用厌氧分离技术从奶牛瘤胃中分离出1株细菌,通过对其形态、培养特性、生化特性、16S rRNA基因序列测定与同源性分析的研究,确定分离菌株为产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）,体外发酵实验表明,发酵液中挥发性脂肪酸浓度（VFA）明显升高,乳酸浓度明显降低,对反刍动物的能量代谢和酸中毒具有一定的调节作用。     

响应面优化产琥珀酸放线杆菌生产丁二酸

丁二酸是一种重要的C4化合物平台,可以合成一系列重要化合物。文中对产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes GXAS137发酵生产丁二酸培养基成分进行优化。通过单因素和Plackett-Burman试验设计筛选出影响丁二酸发酵的重要参数,采用最陡爬坡实验逼近最大丁二酸生产区域后,利用Box-Behnken设计确定重要参数的最佳水平。筛选结果表明,影响丁二酸产量的重要参数是葡萄糖、酵母提取物和碱式碳酸镁浓度。最佳条件为(g/L)：葡萄糖70.00,酵母提取物9.20,碱式碳酸镁58.10。优化后丁二酸产量达到47.64 g/L。与初始条件 (36.89 g/L) 相比,丁二酸浓度提高了30 %。在最佳工艺条件下得到的试验结果与模型预测值很吻合,说明建立的模型是有效的。     

一株丁二酸高产菌株的筛选鉴定及初步发酵研究

以牛胃内容物为菌源,利用富马酸钠为唯一碳源并加入高浓度丁二酸钠的选择培养基筛选到一株丁二酸产量较高,副产物较少的菌株。经形态学、生理生化鉴定和16S rDNA序列的系统发育分析,该菌株为巴斯德菌科的产琥珀酸放线杆菌,与琥珀酸放线杆菌S.JST序列相似性最高为98.98%,命名为琥珀酸放线杆菌GXAS137,保藏号为M2011399。利用正交试验对发酵条件进行了初步优化,该菌可发酵55 g/L葡萄糖产38.96 g/L丁二酸,具有较好的丁二酸生产潜力。     

一株琥珀酸产生菌的筛选及鉴定

从牛的瘤胃中筛选获得一株能发酵生产琥珀酸的兼性厌氧菌。对其进行生理生化特性鉴定及16S rRNA基因分析。该菌株短杆状,无鞭毛,革兰氏染色阴性,V-P反应阴性,能发酵多种糖类产酸;其16S rRNA基因与琥珀酸放线杆菌的同源性高达99．8%,认为属于琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes),并将其命名为琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)SW0580,保藏号CGMCC 1593。初步发酵试验表明该菌能发酵60g/L葡萄糖产生25．8g/L的丁二酸。     

环境因素对琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593发酵生产丁二酸的影响

琥珀酸放线杆菌是发酵生产有应用前景的生物基原料-丁二酸的微生物。本研究室从牛瘤胃中筛选获得一株琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593, 分析了环境气体、pH、氧化还原电位(ORP)环境因素对琥珀酸放线杆菌A. succinogenes CGMCC 1593发酵生产丁二酸的影响。结果表明: CO2不仅提供了A. succinogenes CGMCC 1593发酵生产丁二酸的最佳气体环境, 也是发酵生产丁二酸的底物之一; MgCO3是A. succinogenes CGMCC 1593发酵过程较好的pH调节剂, 发酵过程维持pH7.1~6.2, 可满足菌体生长与产酸的要求; 发酵液初始ORP过低, 不利于菌体生长, ORP在-270 mV时对丁二酸产生有利。在菌体对数生长期结束时, 通过Na2S·9H2O降低发酵液ORP到-270 mV, 发酵48 h时可产丁二酸37 g/L, 摩尔产率达到129%。这对深入研究A. succinogenes CGMCC 1593发酵生产丁二酸具有参考价值。     

环境因素对琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593发酵生产丁二酸的影响

琥珀酸放线杆菌是发酵生产有应用前景的生物基原料-丁二酸的微生物。本研究室从牛瘤胃中筛选获得一株琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593, 分析了环境气体、pH、氧化还原电位(ORP)环境因素对琥珀酸放线杆菌A. succinogenes CGMCC 1593发酵生产丁二酸的影响。结果表明: CO2不仅提供了A. succinogenes CGMCC 1593发酵生产丁二酸的最佳气体环境, 也是发酵生产丁二酸的底物之一; MgCO3是A. succinogenes CGMCC 1593发酵过程较好的pH调节剂, 发酵过程维持pH7.1~6.2, 可满足菌体生长与产酸的要求; 发酵液初始ORP过低, 不利于菌体生长, ORP在-270 mV时对丁二酸产生有利。在菌体对数生长期结束时, 通过Na2S·9H2O降低发酵液ORP到-270 mV, 发酵48 h时可产丁二酸37 g/L, 摩尔产率达到129%。这对深入研究A. succinogenes CGMCC 1593发酵生产丁二酸具有参考价值。     

HPLC法测定九节菖蒲中琥珀酸含量

目的:建立九节菖蒲中琥珀酸含量的HPLC测定法。方法:采用Kromasil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm);甲醇-0.02mol/L KH2PO4缓冲液(7:93)(pH 2.5)为流动相;流速0.5 mL/min;柱温为30℃;检测波长为214 nm。结果:琥珀酸在4～48μg范围内具有良好的线性关系,平均加样回收率为99.15%。九节菖蒲样品中的琥珀酸含量,以干燥品计为0.200%～0.318%。结论:该方法可行,重复性好,可用于九节菖蒲中琥珀酸含量的测定。     

超高静压协同中温对凝结芽孢杆菌芽孢灭活动力学规律的研究

研究了超高静压协同中温对凝结芽孢杆菌芽孢在磷酸缓冲液和牛奶(经超高温灭菌)中灭活的动力学规律,并对超高静压的升压过程及相应的灭活效果进行了研究.结果表明,升压过程对凝结芽孢杆菌芽孢灭活的影响不能忽略,且随压力增加这种效果越强,最高使其下降1.77个数量级;凝结芽孢杆菌芽孢在牛奶中比在磷酸缓冲液中有更高的抗性;在3种拟合模型(线性、Weibull和Log-logistic模型)中,线性模型不适合模拟这些存活曲线,而Log-logistic模型能更好地模拟这些存活曲线,其次是Weibull模型.     

超高静压协同中温对凝结芽孢杆菌芽孢灭活动力学规律的研究

研究了超高静压协同中温对凝结芽孢杆菌芽孢在磷酸缓冲液和牛奶(经超高温灭菌)中灭活的动力学规律, 并对超高静压的升压过程及相应的灭活效果进行了研究。结果表明, 升压过程对凝结芽孢杆菌芽孢灭活的影响不能忽略, 且随压力增加这种效果越强, 最高使其下降1.77个数量级; 凝结芽孢杆菌芽孢在牛奶中比在磷酸缓冲液中有更高的抗性; 在3种拟合模型(线性、Weibull和Log-logistic模型)中, 线性模型不适合模拟这些存活曲线, 而Log-logistic模型能更好地模拟这些存活曲线, 其次是Weibull模型。