绿色荧光蛋白标记的葡萄糖转运蛋白4稳定表达细胞系的建立

目的:建立稳定表达EGFP标记的葡萄糖转运蛋白4的CHO细胞系,为研究GLUT4在CHO细胞中的转运调节机制奠定基础。方法:采用分子克隆方法构建GLUT4-EGFP的融合蛋白,在FLP-in的CHO细胞系中表达,潮霉素筛选后得到稳定的细胞系。结果:通过共聚焦显微镜的检测,证明了此稳定细胞系的阳性率达到了99%。定位研究表明大部分GLUT4以囊泡形式分布在CHO细胞胞浆内,但是质膜上也有少量的GLUT4。结论:建立了一个稳定表达GLUT4-EGFP的CHO细胞系,为进一步研究GLUT4的转运提供了一个很好的细胞模型。     

葡萄糖转运的胰岛素敏感性以及forskolin, dipyridamole和pentobarbital对三种L6 骨骼肌细胞葡萄糖转运的抑制作用

用稳定过表达并带有myc表位的葡萄糖转运子1(glucose transporter 1, GLUT1)或葡萄糖转运子4(glucose transporter 4, GLUT4)的L6骨骼肌细胞株定征GLUT1和GLUT4对胰岛素的响应. 所筛选的L6-GLUT1myc细胞克隆分化前后的葡萄糖摄取量均在线性范围. 100 nmol/L胰岛素使L6-GLUT1myc和L6-GLUT4myc肌原细胞膜上GLUT1或GLUT4的量分别达到基础组的(1.58±0.01)倍和(1.96±0.11)倍, 2-脱氧葡萄糖摄取量分别达到了(1.53±0.09)倍和(1.86±0.17)倍, 此作用可被渥曼青霉素(wortmannin)抑制. 胰岛素刺激了此2种细胞中的Akt磷酸化. L6-GLUT1myc肌原细胞的葡萄糖摄取量对胰岛素浓度呈剂量依赖性, 但与野生型细胞相比, 其对胰岛素的敏感性和最大响应没有改变. 但L6-GLUT4myc肌原细胞的葡萄糖摄取量对胰岛素的敏感性和最大响应均增加. 以前的研究提示毛喉素(forskolin)可能影响胰岛素刺激的GLUT4转位. 本研究表明, 在L6-GLUT4myc细胞中, 毛喉素使胰岛素刺激的葡萄糖摄取减少了65%, 此作用是由它对GLUT4的直接抑制而不是由其对GLUT4转位的影响造成的. 毛喉素和dipyridamole对GLUT4比对GLUT1有更强的抑制作用, 而戊巴比妥(pentobarbital)对GLUT1的抑制作用强于GLUT4. 应用这些抑制剂的结果表明、L6肌原细胞中基础状态下和胰岛素刺激状态下的葡萄糖主要由过表达的GLUT1或GLUT4转运. 因此, L6-GLUT1myc和L6-GLUT4myc细胞株为筛查对肌肉细胞GLUT1或GLUT4的活性或转位有不同作用的化合物提供了一个平台.     

核桃多肽对高糖诱导HepG2胰岛素抵抗模型的影响

摘 要：目的：探究核桃多肽在细胞水平上的降糖作用机制,为核桃资源开发利用提供科学依据。方法：在实验室提取的HT多肽,分离纯化HT-1、HT-2的基础上,通过GLUT4转膜活性筛选,L6肌管细胞葡萄糖摄取活性筛选以及高糖诱导HepG2细胞模型胰岛素抵抗实验,探究核桃多肽的降糖生物活性及降糖作用机制。结果：HT多肽、HT-1、HT-2均有一定的促GLUT4转膜活性,其中量效曲线趋势分布较好的为HT-2,15min开始响应,30min达峰值,在25min细胞膜上GLUT4增加1倍;葡萄糖摄取活性都较好,摄取率分别为1.16、1.06和1.36;IRβ、IRS-1蛋白、GLUT2蛋白的表达水平与HT-2呈浓度依赖性增加,表明HT-2通过胰岛素信号传导途径改善葡萄糖代谢。结论：HT多肽、HT-1、HT-2的降糖活性都较好,其中HT-2效果明显,且是通过胰岛素信号传导途径改善葡萄糖代谢。     

葡萄糖转运蛋白4的转运调控研究进展

GLUT4在胰岛素作用下的转运上膜是血糖调控的一个关键途径.其中包含了两个重要的过程-胰岛素信号转导以及GLUT4转运途径.在这两个过程中新的特异分子的发现以及它们功能特点的研究是发展有效的药物治疗糖尿病的关键因素.本文主要从GLUT4在胞内的循环途径,胰岛素调节的GLUT4的转运以及转运中的调控蛋白三个方面着手,综述了GLUT4的转运调控研究进展.     

HMGB1对小鼠系膜细胞细胞周期及细胞周期相关蛋白表达的影响

该实验以小鼠系膜细胞MMC为研究对象,以重组HMGB1为刺激物,通过检测细胞周期的变化及细胞PCNA、CyclinD1、CDK4和p16的表达水平,初步探讨HMGB1对系膜细胞的细胞周期及其相关调控因子的影响。选取小鼠系膜细胞MMC为研究对象,随机分为对照组及0.05mg/LHMGB1刺激组,经流式细胞术检测发现HMGB1能够上调小鼠系膜细胞中S期细胞所占比例;免疫细胞化学检测显示,PCNA蛋白在小鼠系膜细胞中的表达上调;通过RT-PCR技术及Western blot技术检测到小鼠系膜细胞中CyclinD1 mRNA和蛋白以及CDK4蛋白的高表达情况,而p16蛋白的表达呈时间依赖性降低。由此可见,HMGB1可能是通过上调CyclinD1/CDK4的表达,并下调p16的表达,促进细胞从G_0/G_1期进入S期,介导了小鼠系膜细胞的异常增殖,可能是HMGB1参与狼疮性肾炎发病的可能机制之一。     

原位杂交检测组织金属蛋白酶抑制因子—1 mRNA在IgA肾病肾脏中的表达

为探讨组织蛋白酶抑制因子在IgA肾病肾小球硬化中的作用。本文用原位杂交法研究组织金属蛋白酶抑制因子－1（TIMP－1）mRNA在3种类型IgA肾病（轻度系膜增生型、中度系膜增生型及局灶型）肾组织中的表达。结果表明：TIMP－1 mRNA原位杂匀的阳性信号主要分布于部分肾小管上皮细胞内。在肾小球系膜细胞也可检测到TIMP－1 mRNA阳性信号,但较肾小管弱,中度系膜增生型的TIMP－1 mRNA阳笥信号明显地较其他两型IgA肾病为强。以上结果表明：由肾小管上皮细胞及系膜细胞合成的TIMP－1通过抑制基质金属酶的活性,可导致细胞外基质（ECM）在肾小管间质及肾小球内过度沉积,从而对肾小球硬化有促进作用。     

原位杂交检测组织金属蛋白酶抑制因子-1mRNA在IgA肾病肾脏中的表达

为探讨组织蛋白酶抑制因子在 Ig A肾病肾小球硬化中的作用 ,本文用原位杂交法研究组织金属蛋白酶抑制因子 -1(TIMP- 1) m RNA在 3种类型 Ig A肾病 (轻度系膜增生型、中度系膜增生型及局灶型 )肾组织中的表达。结果表明 :TIMP-1m RNA原位杂交的阳性信号主要分布于部分肾小管上皮细胞内。在肾小球系膜细胞也可检测到 TIMP- 1m RNA阳性信号 ,但较肾小管弱。中度系膜增生型的 TIMP- 1m RNA阳性信号明显地较其他两型 Ig A肾病为强。以上结果表明 :由肾小管上皮细胞及系膜细胞合成的 TIMP- 1通过抑制基质金属蛋白酶的活性 ,可导致细胞外基质 (ECM)在肾小管间质及肾小球内过度沉积 ,从而对肾小球硬化有促进作用。     

量子点标记活细胞内GLUT4 蛋白的研究

目的:研究量子点标记活细胞内GLUT4蛋白的方法,用于长时程观察活细胞内GLUT4的转运过程。方法:使用在GLUT4蛋白膜外区构建了myc位点的L6-GLUT4myc细胞系,用胰岛素刺激L6细胞内的GLUT4myc转运到细胞膜上,通过抗体抗原反应先后将一抗9E10和偶联二抗IgG的量子点与特异性位点结合。结果:通过量子点标记固定细胞内GLUT4的实验,证明了标记方法的特异性和灵敏性。量子点能够标记细胞膜表面的GLUT4蛋白并伴随GLUT4的胞吞进入细胞。适当调整实验温度,用量子点标记细胞膜上的GLUT4并且在实验过程结束后将标记了量子点的GLUT4保持在细胞膜表面,能够观察活细胞内GLUT4蛋白内化和胞内循环的过程。结论:发展了量子点标记活细胞内GLUT4的方法,为进一步研究活细胞内GLUT4的转运过程打下了基础。     

Ⅱ型糖尿病患者红细胞膜葡萄糖运输特性研究

红细胞膜葡萄糖运输的温度依赖性研究结果表明,Ⅱ型糖尿病患者的葡萄糖输入的活化能比正常增大约30%,这和患者葡萄糖输入速率减小的结果相一致.但葡萄糖跨膜输出的活化能没有显著变化.对在红细胞葡萄糖转运蛋白(GLUT1)内侧特异结合的细胞松弛素B(CB)的抑制效应研究结果表明,糖尿病人的CB抑制常数无明显变化.结合以前我们用根皮素抑制剂的实验,表明Ⅱ型糖尿病患者红细胞膜上GLUT1很可能发生了结构的变化,发生变异的位点在在此膜蛋白的膜外侧区域.     

葡萄糖转运子4 转位信号转导通路的研究进展

葡萄糖是大部分细胞主要能量来源,它进入细胞的过程在生命的维持中无疑成为一个重要的步骤。而葡萄糖进入细胞是依赖于这些细胞上的葡萄糖转运子和相应的对其进行调节的因子。葡萄糖转运子4（GLUT4）在糖进入细胞维持血糖平衡中起了重要的作用。近年有关GLUT4的研究文献很多,但却总给人不系统的感觉。本文对GLUT4转位的胰岛素依赖和非胰岛素依赖的信号途径以及其远端过程及机制作一综述,同时分析了GLUT4转位的信号途径的研究中存在的问题和将来研究的方向。