指纹法在水产品育种中的应用

法国Montepellier大学与法国水产品开发研究所(IFREMER)联合开发鉴定出牡蛎的12个遗传标记和尖吻鲈的7个遗传标记。 这些遗传标记是属于小卫星序列,即重复DNA短序列,用之可利于相同品种(具不同数量的单位重     

分子标记及其在海洋动物遗传研究中的应用

分子遗传标记在农业动植物育种和生产上得到了广泛的应用,且取得了可喜的成果,但在水生生物上的应用还处于初始阶段。本文简要介绍了限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）、小卫星DNA和微卫星DNA（或称简单序列重复,SSR）等分子标记的概念、基本原理及其特点,重点介绍了第三代分子标记单核苷酸多态性（SNP）技术。综述了这些分子标记在海洋动物遗传结构分析、亲缘关系鉴定、遗传图谱的构建和标记辅助育种等方面的应用。     

柑桔BES SSR标记开发及连锁图延伸和加密

为了系统性地开发和拓展柑桔SSR标记,通过对公布的柑桔BAC文库末端序列(BAC-End sequence,BES)进行SSR分析,选择1500个SSR位点设计合成并检测323对引物。结果表明:(1)从总长度为28.1 Mb的46 339条序列中共检测出22 403个SSR位点,约每2条序列就会出现一个SSR位点,发生频率为48%,相当于平均1.25kb的序列中就会出现1个SSR,频率约为柑桔EST的2倍,且不同核心重复序列的SSR发生特点与EST也不同。(2)所合成的323对引物中,有效扩增316对,扩增率约98%,173对表现多态性,总多态性比率约55%,多态性引物中单核苷酸重复类型15对,双核苷酸重复类型100对,三核苷酸及以上重复类型58对,表明柑桔BES中具有较为丰富的多态性SSR标记。(3)结合已发表的遗传作图数据,对总计349个多态性位点进行遗传连锁分析,获得的新遗传连锁图谱共含有9个连锁群、334个SSR标记、总长844.2cM、平均图距2.53cM,延长和加密了先前的图谱。该研究开发的新SSR标记为开展柑桔遗传鉴定分析和遗传图谱构建提供了新的标记来源,加密的遗传图谱为柑桔的基因定位、图位克隆和标记辅助育种等奠定了基础,SSR分析结果也为其他物种SSR标记的开发提供了参考。     

草莓DNA分子标记及其应用

综述了限制性长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单重复序列(SSR)等不同类型分子标记在草莓指纹图谱构建、品种鉴别、遗传多样性、进化、遗传作图以及相关性状的标记等方面的应用,分析了草莓分子标记研究中的关键问题,提出了今后研究方向。     

遗传标记及其在作物品种鉴定中的应用

本文评述了用于作物品种鉴定的形态标记（morphological markers）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（biochemical markers）、分子标记（molecular markers）的优缺点。重点评述了分子标记在作物品种鉴定中的应用。文中除对蛋白质电泳指纹图谱——同工酶和贮藏蛋白（包括醇溶性蛋白、清蛋白、谷蛋白、球蛋白等）电泳产生的指纹图谱的应用外,较详细地介绍了近年来DNA指纹图谱技术;包括限制片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,简称RFLP）、随机扩增多态性DNA (random amplified po lymorphic DNA,简称RAPD)、小卫星DNA（minisatellite DNA）、微卫星DNA（microsatellite DNA）,简单重复序列间扩增（intersimple sequence repeats,简称ISSR）,扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism,简称AFLP）以及CAPS (cleaved amplified polymorphic sequences)和SNPS (single nucleotide polymorphisms)对作物品种鉴定和新品种登记,品种纯度和真实性的检验以及品种间亲缘关系的探讨和在分类研究中的贡献等。     

改良DNA指纹图谱的新技术

DNA指纹技术发明者Alec Jeffreys研究小组开发了一种DNA分类的新方法。由此排除了旧方法的许多局限性。旧方法利用衔接重复小卫星或可变量衔接重复子(VNTR)位点(其重复拷贝数显示高度等位变异),由此,当用限制性酶切时产生可变量DNA片段长度。随着PCR的出现,现已可对极短小的衔接重复小卫星进行扩增,从而提高了该技术的灵敏度。采用PCR法还可以从降解的DNA样本获得指纹的图谱。     

DNA指纹图谱法在哺乳动物和鸟类遗传研究中的应用

DNA指纹图谱法(DNA fingerprinting)是1980年中期发展起来的一种新的实验方法。短暂的几年,该方法得到迅速发展和完善,并在鸟类、人类和其它哺乳动物的遗传研究中得到广泛应用。 在人类染色体中,含有许多分散的具有串联重复单位的微小卫星区(minisatellite)。在这些区域中,由于重复单位的数目和重复拷贝数的等位性不同,所以许多卫星区表现出高度多态性(high polymorphism)。1985年,Jeffreys等人发现,这些区域可通过一种10—15碱基对的核心序列来检测。他们从人肌红蛋白基因的卫星区分离出单一重复单位,该重     

草鱼Ⅰ型微卫星标记的发掘及其多态性检测

表达序列标签(EST)是发掘Ⅰ型微卫星标记的重要资源。研究运用生物信息学方法,从草鱼头肾组织3027条EST序列中搜索到322个微卫星位点,占整个EST数据库的10.6%。其中,二核苷酸重复位点151个(46.9%),三核苷酸重复位点137个(42.5%),四、五、六核苷酸重复位点较少;在二核苷酸重复位点中,AC/GT重复位点最为丰富,占二核苷酸重复位点总数的50.3%,AG/CT重复次之,占二核苷酸重复位点总数的40.4%,AT和GC重复较少。10个微卫星位点的多态性检测结果显示,4个位点在草鱼测试群体中呈多态性,多态性位点的平均多态信息含量(PIC)和平均遗传杂合度(H)分别为0.5236和0.5441,其中,2个多态性位点的PIC值大于0.5,呈现高度多态性特征。Ⅰ型微卫星标记将为草鱼遗传连锁图谱构建和QTL分析提供有效的基因分子标记。       

大麻性别的RAPD和SCAR分子标记

利用随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技术获得与大麻性别连锁的分子标记.将10株雄性大麻或10株雌性大麻的单个DNA样品等量混合分别组成雄性或雌性DNA池(DNApool),以提供具有相同遗传背景的雌、雄性DNA样品.每个随机引物分别用三个不同的循环程序进行PCR扩增.在30个随机引物中,用引物401扩增得到一条约2.5kb雄性多态性片段.对该片段进行了克隆和序列分析,并根据序列分析结果将上述RAPD分子标记转化为重复性和特异性更好的SCAR(sequencecharacterizedamplifiedregions)分子标记.     

纵纹腹小鸮DNA指纹谱探针的筛选和初步应用

以人工合成的微卫星序列 (GTG) 5,(GT) 8,(CAC) 5和人源小卫星 33 1 5作引物 ,扩增纵纹腹小的基因组DNA ,产生多态性DNA片段 ,回收了 8个表现个体特异性的片段。当用小的基因组总DNA探针与它们杂交时 ,其中 2个表现阳性 ,说明PCR方法扩增出的高变异产物含有重复序列。用含重复序列的个体特异性PCR产物作探针 ,与无关个体小基因组DNA的HaeⅢ酶切产物进行DNA印迹 ,获得了变异性较高的DNA指纹图谱。且通过对京白鸡家系分析表明 ,用小基因组DNA的PCR产物分离制备的探针所获得的DNA指纹图带能够稳定的遗传。因此 ,高变异的PCR产物可以有效地用作DNA指纹探针。     

苜蓿遗传多样性的取样数目——RAPD和SSR群体标记法

紫花苜蓿为异花授粉植物,其DNA多态性研究的取样策略与遗传多样性分析直接相关.选取了4个苜蓿品种陇东(地方品种)、中兰1号(育成品种)、牧歌(Graze)和金皇后(Queen)(引进品种),设置了取样数目分别为10、20、40和60个单株进行DNA混合,利用RAPD(random amplification polymorphic DNA,随机扩增长度多态性DNA)和SSR(simple sequence repeat,简单重复序列)标记分别进行了遗传多样性分析,结果发现40和60个单株DNA混合样的聚类结果一致,表明10和20个单株组成的群体太小,随着苜蓿群体取样数目的增加,遗传多样性分析的准确性也随之增加,但是分析成本也相应提高.鉴于此,利用RAPD和SSR标记分析苜蓿遗传多样性时采用40个单株的DNA混合样是较适宜的群体大小.     

分子标记技术的发展及应用

介绍了几种应用前景较广的分子标记,如基于DNA杂交技术的分子标记:限制性片段长度多态性(RFLP)和DNA可变串联重复数标记(VNRT);基于PCR技术的分子标记:随机扩增多态性 DNA(RAPD)、酶切扩增多态性(CAPS)、扩增片段长度多态性(AFLP)、微卫星DNA(SSR)和DNA单链构象多态性(SSCP);以及新兴的第3代分子标记,即基于DNA芯片技术的分子标记:单核苷酸多态性(SNP)等。分别阐述了它们的原理、方法步骤与优缺点、应用注意事项和适用范围,同时概述了它们在生物学研究中的应用和进展。     

利用DNA指纹图谱检测体克隆变异

新斯科夏半岛Dalhousie大学和新斯科夏半岛农学院的M.Nelke和J.Nowak等报道,他们利用DNA指纹图谱技术从再生自组培物的红车轴草植株中检测体克隆变异。 这些研究人员利用商品化多位点DNA指纹图谱探针从可再生性红车轴草变异体(由非再生性基因型离体培养而成)基因组中检测小卫星样序列突变。分散及高多形性重复DNA序列类群——小卫星,在真核生物基因组中随机性分布。     

分子生物学教材中的真核生物基因组重复序列

现行的高校分子生物学教材中主要以重复频率为依据对重复序列进行分类,对于小卫星DNA及微卫星DNA是属于高度或是中度重复序列存在不同见解。提出依据重复频率及空间结构分布两个方面对重复序列进行分类,并建议按照重复频率将小卫星DNA及微卫星DNA归属于中度重复序列。     

采用高通量技术开发花鲈二碱基重复微卫星标记

花鲈是中国重要的捕捞和养殖对象之一。本研究利用高通量测序法开发花鲈微卫星标记,共获得60632个二至六碱基重复微卫星序列,从52747个二碱基重复序列中随机挑选150个位点进行引物合成及多态性检测,最终开发出27个具有多态性的微卫星标记。群体遗传学检测结果显示,27个微卫星标记的等位基因数为6~22(均值12.667),观测杂合度(Ho)为0.323~1.000(均值0.614),期望杂合度(He)为0.723~0.934(均值0.861),多态信息含量(PIC)为0.665~0.915(均值0.830),各位点PIC值均大于0.500,表明所开发的二碱基重复微卫星标记均具有较高的多态性。哈迪-温伯格平衡(HWE)检测结果显示,14个标记符合HWE,其中LM2-11与LM2-2、LM2-16之间存在连锁不平衡(p<0.050),其他符合HWE的标记间不存在连锁不平衡。Wilcoxon检验结果显示,花鲈群体并未偏离L-shaped分布,表明其经历过近期的遗传瓶颈效应。本研究开发的27个微卫星位点可为花鲈的分子标记辅助育种、增殖放流遗传效应评估、群体遗传学等研究提供有效的分子标记。     

大麻性别的RAPD和SCAR分子标记

利用随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA,RAPD)技术获得与大麻性别连锁的分子标记,将10株雄性大麻或10株雌性麻的单个DNA样品等量混合分别组成雄性或雌性DNA池（DNApool),以提供具有相同遗传背景的雄,雄性DNA样品。每个随机引物分别用三个不同的循环程序进行PCR扩增,在30个随机引物中,用引物S401扩增得到一条约2．5kb雄性多态性片段,对该片段进行了克隆和序列分析 ,并根据序列分析结果将上述RAPD分子标记转化为重复性和特异性更好的SCAR（Sequence characterized amplified regions)分子标记。     

磁珠富集法开发北柴胡多态性简单序列重复标记

目的:利用磁珠富集法分离北柴胡微卫星序列,以开发北柴胡微卫星引物,获得有多态性的简单序列重复(SSR)标记。方法:用生物素标记的混合探针(AC)15、(AG)15、(MAB)12和两端连接已知序列人工接头的北柴胡基因组DNA酶切片段混和后与磁珠杂交,构建微卫星序列富集的小片段插入文库;利用接头引物分别与生物素探针引物Biotin-(AC)15、Biotin-(AG)15、Biontin-(MAB)12形成3个组合,用PCR方法对文库进行初步筛选;对可能的阳性克隆子进行测序复筛,选取微卫星侧翼序列足够长的序列设计引物,用荧光标记的基因分型技术以栽培柴胡种质为材料分析其多态性。结果:开发了5对多态性SSR标记,它们在5份柴胡栽培种质中共扩增出30.70个多态性等位基因,平均每条引物可以扩增出6.14个多态性等位基因;观察等位基因数最多13个,最少3个;有效等位基因数最多11.4个,最少1.6个。同时分析了4对EST-SSR引物,比较了2种SSR标记扩增结果。结论:磁珠富集法是开发柴胡多态性SSR标记的有效方法。     

中国明对虾基因组小卫星重复序列分析

通过对中国明对虾基因组随机DNA片断的测序 ,我们获得了总长度约 6 4 10 0 0个碱基的基因组DNA序列 ,从中共找到 172 0个重复序列。其中 ,小卫星序列的数目为 398个 ,占重复序列总数目的 2 3 14 %。这些小卫星序列的重复单位长度为 7- 16 5个碱基 ,集中分布于 7- 2 1个碱基范围内 ,其中以重复单位长度为 12个碱基的重复序列数目最多 ,为 5 8个 ,占小卫星重复序列总数目的 14 5 7%。不同拷贝数目所对应的重复序列的数目情况为 :拷贝数目为 2的重复单位所组成的重复序列数目最多 ,为 137个 ;其次是拷贝数目为 3的重复序列 ,为12 2个 ,且随着拷贝数目的增加 ,由其所组成的重复序列的数目呈递减的趋势。其中一部分序列见GeneBank数据库 ,登录号为AY6 990 72 -AY6 990 76。 398个重复序列分别由 398种重复单位所组成 ,因而小卫星重复序列的类型很多 ,我们初步分成三类 :两种碱基组成类别、三种碱基组成类别和四种碱基组成类别 ,并进一步根据各个重复序列中所含有的碱基种类的数量从大到小排列这些碱基而分成若干小类。从这些分类中可以看出 ,中国明对虾基因组中的小卫星整体上是富含A T的重复序列 ,并具有一定的“等级制度” ,揭示了其与微卫星重复序列之间的关系 ,即一部分小卫星重复序列可能起源于微卫星     

利用RAPD标记和单株树大配子体构建马尾松的分子标记连锁图谱

利用300个随机的寡核苷酸引物和马尾松(Pinus massoniana Lamb.)种子的胚乳(大配子体)产生的随机扩增多态性DNA(RAPD)分子标记,进行马尾松标记连锁图谱的构建。经筛选共获得64个稳定的RAPD标记,利用多点连锁分析,其中的48个标记分属于13个不同的连锁群(连锁对),该图谱覆盖的基因组总长度约为692.5cM(centimorgan),标记间平均距离约为14.7cM,它为马尾松连锁图谱的构建提供了一个连锁框架。     

假眼小绿叶蝉微卫星位点的生物信息学分析

【目的】为开发假眼小绿叶蝉Empoasca vitis分子标记,采用高通量测序技术对假眼小绿叶蝉DNA进行了测序与分析。【方法】本研究基于Illumina Hi Seq测序技术,构建了PE文库(~400bp),对获得的测序数据利用生物信息学分析手段完成全基因组扫描,并进一步使用MISA分析鉴定基因组序列中出现的微卫星序列(SSR)。针对微卫星序列共设计10对引物,并使用3步法进行引物多态性筛选。【结果】共计检测Scaffold数量为183 194条,其中包含SSR的Scaffold共计1 545条,共计筛选出1 569个SSR位点。在假眼小绿叶蝉的微卫星中,共包括87种重复基元类型,二核苷酸与三核苷酸重复序列为主要重复类型,分别占SSRs总数的70.26%和27.84%;二核苷酸重复基元CA/TG和三核苷酸重复基元AAT/ATT是优势重复基元,分别占SSRs总数的33.96%和5.86%。在设计的10对引物中,5对具有多态性,在8个假眼小绿叶蝉个体中共发现16个等位基因。【结论】结果说明假眼小绿叶蝉SSR位点在多态性方面具有极大的可开发性,具有多态性的SSR位点可对假眼小绿叶蝉种群间的分化,种群间的扩散机理和途径及影响因素等问题提供分子视角。