肺内调节肽对兔支气管上皮细胞分泌白介素的影响

为探讨肺内调节肽对气管上皮细胞（brochial epithelial cells,BECs）分泌功能的影响,实验观察了兔BECs在未受应激与臭氧应激两种条件下白细胞介素（interleukin,ILs）的分泌。结果发现：血管活性肠肽（vasoac-tive intestinal peptide,VIP）以未受应激BECs存在抑制作用,并使用臭氧应激BECs分泌ILs下降;表皮生长因子（epi-dermal growth factor,EGF）使未受应激BECs IL-1、IL-8分泌增加,使臭氧应激的BECs ILs分泌降低;内皮素-1（endothelin-1,ET-1）、降钙素基因相关肽(calctionin gene-related peptide,CGRP）可使未受应激的BECs分泌ILs增加,CGRP还可使臭氧应激的BECs ILs分泌增加。结果提示：肺内调节肽可调控BECs ILs的分泌,在调控气道炎症损伤信号传递方面具有一定的作用。     

血管活性肠肽对嗜酸性粒细胞释放和粘附功能的影响及机理

目的和方法：为探讨血管活性肠肽（ＶＩＰ）对嗜酸性粒细胞功能的调节,采用密度梯度离心法分离健康志愿者外周血嗜酸性粒细胞（Ｅｏｓ）,培养人脐带静脉血管内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）,然后分别与ＶＩＰ和ＩＬ－１β共育,再以血小板激活因子（ＰＡＦ）活化Ｅｏｓ,用嗜酸性过氧化物酶（ＥＰＯ）活性评估Ｅｏｓ的过氧化反应和脱颗粒反应,以白细胞单层粘附试验测定Ｅｏｓ和ＥＣ之间的粘附作用。结果：ＶＩＰ能抑制ＰＡＦ致Ｅｏｓ的Ｅ     

肺内调节肽对人支气管上皮细胞HLA-DR、CD80、CD86表达的影响

为了探讨肺内调节肽对人支气管上皮细胞（human bronchial epithelial cells,HBECs）人类白细胞抗原DR（human leukocyte antigen DR,HLA—DR）、CD80和CD86表达的影响,采用免疫细胞化学技术和流式细胞术检测HBECs在非应激和臭氧应激两种状态下HLA-DR、CD80、CD86的表达。结果显示,HBECs表达HLA—DR,臭氧应激状态下HBECs HLA-DR表达降低（P〈0．05）;VIP、P3513和CGRP使非应激和臭氧应激两种状态下的HBECs HLA—DR表达增高（均P〈0．05）。HBECs表达协同刺激分子CD80,臭氧应激状态下CD80表达降低（P〈0．05）,VIP对非应激的HBECs的CD80表达无影响,使臭氧应激状态下CD80表达增高（P〈0．05）;CGRP使非应激状态下的HBECs的CD80表达降低（P〈0．05）,使臭氧应激状态下CD80表达增高（P〈0．05）;P3513使非应激状态下CD80表达增高（P〈0．05）,可使臭氧应激状态下CD80表达降低（P〈0．05）。在HBECs没有检测到CD86表达,臭氧攻击也不能刺激其表达。上述结果提示,HBECs具备成为抗原递呈细胞的必要条件,肺内调节肽可通过调节HLA—DR和协同刺激分子的表达调节HBECs的抗原递呈作用。     

肺内调节肽对支气管上皮细胞ICAM-1表达及NF-κB活性的调控

细胞间粘附分子—1(ICAM—1)是介导细胞与细胞之间粘附的重要生物分子;核因子—κB(NF—κB)是体内普遍存在、能迅速对刺激产生反应的重要核转录因子。越来越多的证据显示,ICAM—1表达与NF—κB激活是炎症反应的重要步骤。我们应用免疫组化、RT—PCR、凝胶阻滞电泳(EMSA)等多种实验方法,观察了肺内调节肽对支气管上皮细胞ICAM—1表达及NF—κB活性的影响,以及NF—κB抑制剂MG—132对ICAM—1表达的影响。实验结果发现,VIP、EGF可使臭氧应激BECS的ICAM—1表达降低;ET—1、CGRP可使未受应激BECs的ICAM—1表达增加。NF—κB抑制剂MG—132可阻断O3、ET—1、CGRP引起的ICAM—1表达,提示NF—κB在调控ICAM—1表达中起重要作用。EMSA结果显示,BECs中NF—κB在臭氧应激下反复激活,CGRP与ET—1可促进NF—κB的激活;VIP与EGF可抑制臭氧应激的BECs中NF—κB的激活。以上结果说明,VIP、EGF可通过下调ICAM—1转录及NF—κB激活减轻炎症反应,而ET—1、CGRP可通过上调ICAM—1转录及NF—κB激活、加大炎症反应。ICAM—1与NF—κB的持续表达和反复激活是炎症持续加重发展的重要因素。     

血管活性肠肽对支气管上皮细胞趋化迁移的影响及机制

为探讨肺内神经肽在气道损伤修复中的作用 ,采用blind wellBoydenchamber测定原代培养的支气管上皮细胞 (bronchialepithelialcells,BEC)趋化性 ,观察血管活性肠肽 (vasoactiveintestinalpeptide ,VIP)对BEC趋化迁移的影响及其机制 ,并测定经热应激后BEC分泌VIP及表达VIP受体 (vasoactiveintestinalpeptidereceptor,VIPR)的变化。结果显示 :(1)以胰岛素作为趋化因子所建立的BEC趋化性测定方法稳定 ,重现性好 (r =0 970 3,P <0 0 1) ;(2 )VIP (0 0 0 1～ 1μmol/L)均显示剂量依赖性地增强BEC的趋化迁移 ,其效应可被钙调蛋白阻断剂及蛋白激酶C阻断剂有效地抑制 (P <0 0 1) ;(3) 4 2℃、30min热应激后BEC分泌VIP (P <0 0 1)及表达VIPR明显增加 (P <0 0 5 )。实验表明 :肺内神经肽VIP可增强BEC的趋化迁移 ,其细胞内信号转导途径与钙调蛋白及蛋白激酶C有关。而热应激时VIP及VIPR的高表达进一步提示局部微环境的VIP可能是气道上皮损伤修复网络中的重要分子     

外周血嗜酸性粒细胞比率及血小板参数与支气管哮喘相关性研究

摘要 目的：探索外周血嗜酸性粒细胞比率、血小板平均体积（MPV）、血小板平均宽度（PDW）、大型血小板比率（P-LCT）与重度哮喘患者肺功能及哮喘发作的关系。方法：回顾2017年1月至2018年12月于我院就诊,首次经肺功能检查,诊断为支气管哮喘患者 122例,其中重度患者(SAG) 56例;轻中度患者(n-SAG) 66例。选择同期在我院行健康体检志愿者(CP)的 37名,作为对照组。通过医院HIS系统调取研究对象的年龄、性别,BMI指数等一般资料,调取WBC、EOS%、PLT、PDW、MPV、P-LCT等血液结果,调取FVC ^pre 、FEV1 ^pre 、FVC%、FEV1%、FVC ^post 、FEV1 ^post 等肺功能检查结果。采用单因素方差分析、Pearson相关分析、Logistic 回归分析等方法对相关指标进行统计分析。结果：正常组的PDW、MPV、P-LCT水平均低于重症哮喘组,具有统计学意义（均P <0.05）, 正常组的EOS%水平明显低于重症哮喘组,具有显著统计学意义（P <0.01）,重症哮喘患者FVC ^pre 、FEV1 ^pre 、FVC%、FEV1%、FVC ^post 、FEV1 ^post 均显著低于非重症患者及观察组,具有显著统计学意义（均P <0.01）。Pearson相关性分析显示,EOS%与FEV1改善量具有相关性（r=0.233,P=0.003）。PDW、MPV、P-LCT与FVC改善量均具有显著相关性（均P<0.01）, PDW、MPV、P-LCT与FVC变异率、FEV1变异率具有相关性(均P<0.05)。嗜酸性粒细胞与血小板比率（EPR）与FEV1改善量具有相关性（r=0.159,P=0.048）logistic回归分析显示：EOS（Exp（B）=1.203）、P-LCT（Exp（B）=1.086）与哮喘发作密切相关。结论：外周血EOS%、PDW、MPV和P-LCT水平与哮喘肺功能具有密切相关性,在判断哮喘发作风险及哮喘发作严重程度反面具有一定参考作用。     

血管活性肠肽对兔支气管上皮细胞抗臭氧损伤的保护作用

用支气管刷洗法收集新西兰兔支气管上皮细胞（ＢＥＣ）,以臭氧（Ｏ３）攻击培养的ＢＥＣ,建立细胞损伤模型。测定ＢＥＣ的３Ｈ释放率计算Ｏ３的细胞毒指数（ＣＩ）、测定细胞内丙二醛（ＭＤＡ）的含量反映细胞氧化性损伤的程度,测定细胞内过氧化氢酶（ＣＡＴ）活性及还原型和氧化型谷胱甘肽（ＧＳＨ和ＧＳＳＧ）的含量反映细胞抗氧化能力。观察血管活性肠肽（ＶＩＰ）预处理对ＢＥＣ的细胞保护作用并初步探讨其保护机制。观察到：ＢＥＣ的３Ｈ释放率与Ｏ３暴露时间成正比;Ｏ３暴露２ｈ使ＭＤＡ含量和ＧＳＳＧ含量明显增加,ＧＳＨ减少;ＶＩＰ预处理呈剂量依赖性降低Ｏ３暴露的ＣＩ值、降低ＭＤＡ和ＧＳＳＧ含量、增加ＧＳＨ及ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比值、增加ＣＡＴ活性,显示出细胞保护效应;ＶＩＰ的保护效应可被放线菌素Ｄ（Ａ－Ｄ）或蛋白激酶Ｃ阻断剂Ｈ７部分取消。结果表明：Ｏ３暴露会导致ＢＥＣ损伤,ＶＩＰ可通过增强ＢＥＣ的抗氧化能力而保护ＢＥＣ,ＶＩＰ的信号在细胞内的转导途径与基因转录及依赖ＰＫＣ的酶蛋白磷酸化有关。     

支气管哮喘患儿血清硫化氢、嗜酸性粒细胞趋化因子水平与炎症因子及肺功能的关系研究

摘要 目的：探讨支气管哮喘患儿血清硫化氢（H2S）、嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxin）水平与炎症因子及肺功能的关系。方法：选取我院收治的95例支气管哮喘患儿,按照《儿童支气管哮喘诊断及防治指南(2016年版)》将支气管哮喘患儿分为急性发作期组43例和缓解期组52例。检测血清中H2S 水平;检测Eotaxin、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,白介素6（IL-6）和白介素13（IL-13）的水平;对患儿进行肺功能测定,采用Pearson检验分析血清H₂S、Eotaxin水平与血清炎症因子及肺功能之间的相关性。ROC曲线分析血清H2S、Eotaxin对支气管哮喘患儿病情的预测价值。结果：急性发作期组患儿血清H₂S水平、第一秒用力呼气容积占预计值百分比（FEV₁%pred）、最大呼气流量占预计值百分比（PEF%pred）和FEV₁/用力肺活量（FVC）低于缓解期组患儿,Eotaxin、TNF-α、IL-6和IL-13水平高于缓解期组患儿（P<0.05）;支气管哮喘患儿血清H₂S水平与TNF-α、IL-6和IL-13水平均呈负相关（P<0.05）,与FEV₁%pred、FEV₁/FVC和PEF%pred均呈正相关（P<0.05）;支气管哮喘患儿血清Eotaxin水平与TNF-α、IL-6和IL-13水平均呈正相关（P<0.05）,与FEV₁%pred、FEV₁/FVC和PEF%pred均呈负相关（P<0.05）。血清H₂S预测支气管哮喘患儿病情的曲线下面积为0.854,灵敏度和特异度分别为77.89%和81.05%,Youden指数为0.5894;血清Eotaxin预测支气管哮喘患儿病情的曲线下面积为0.924,灵敏度和特异度分别为92.71%和84.38%,Youden指数为0.7709。结论：支气管哮喘急性发作期患儿与缓解期患儿相比,其血清H2S水平较低,Eotaxin水平较高,血清H₂S和Eotaxin水平与机体炎症反应及肺功能密切相关,有助于辅助评估支气管哮喘患儿的病情。     

降钙素基因相关肽对人支气管上皮细胞E-钙粘素表达的影响

目的:探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对臭氧(O3)应激后人支气管上皮细胞(HBECs)中E-钙粘素(E-cd)表达的影响及机制。方法:采用RT-PCR检测E-cd mRNA的表达,免疫细胞化学染色法检测E-cd蛋白的表达。结果:CGRP呈剂量依赖性增加正常以及O3应激后HBECs胞膜上E-cd的表达,而对胞浆内E-cd的表达无明显影响;CGRP对HBECs胞膜上E-cd表达的上调作用可分别被H-89(PKA抑制剂)、H-7(PKC抑制剂)及W-7(CaM抑制剂)部分逆转。结论:CGRP可剂量依赖性增加正常和O3应激后HBECs胞膜E-cd的表达,而对胞浆内E-cd的表达无影响。     

感觉神经肽与支气管对肺动脉缺氧反应的影响

豚鼠离体肺动脉用辣椒素（Ｃａｐｓａｉｃｉｎ）耗竭感觉神经肽（ＳＮＰ）后,缺氧性收缩反应（ＨＰＶ）显著增高（Ｐ＜０．０１）。套有带完整上皮支气管的肺动脉的ＨＰＶ显著弱于不套或套有去上皮支气管肺动脉的ＨＰＶ（Ｐ＜０．０５）;支气管与肺动脉同时用Ｃａｐ处理后,此差异消失;只有外套的支气管先用Ｃａｐ预处理时,肺动脉ＨＰＶ仍显著强于溶剂预处理的对照组（Ｐ＜０．０５）;套有去上皮支气管的肺动脉缺氧反应显著强于不套支气管的肺动脉。结果提示：肺动脉Ｃ－感觉神经所释放的ＳＮＰ在肺动脉缺氧反应中具调节作用;支气管上皮层可释放舒血管物质调节ＨＰＶ,此物质与ＳＮＰ密切相关;支气管还可能释放缩血管物质,介导ＨＰＶ。     

纤维连接蛋白上调兔支气管上皮细胞过氧化氢酶表达

为从基因转录水平阐明纤维连接蛋白(fibronectin,Fn)与整合素(integrins)结合反应对支气管上皮细胞(bronchial epithelialCells,BECs)的抗氧化保护机制,本文在先前的工作基础上用臭氧(ozone,O_3)攻击原代培养的免BEC,RT-PCR扩增过氧化氢酶(catalase,CAT)的cDNA,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统进行灰度分析,反映CAT mRNA的原始表达丰度,观察Fn处理的影响及蛋白酪氨酸激酶抑制剂genistein和钙调素抑制剂W_7的作用。同时,将电泳展开的PCR产物电转移至尼龙膜上,用CAT特异性寡核苷酸探针杂交,证实PCR扩增产物为特异性目的基因的转录产物。结果证实:Fn(10μg/ml)处理可提高CAT表达(P<0.01),蛋白酪氨酸激酶抑制剂genistein可阻断Fn对CAT mRNA表达的增强效应(P<0.01);钙调素抑制剂W_7对Fn处理后CAT mRNA表达增强也有抑制作用。提示:Fn可提高BEC细胞内CAT编码基因的转录水平,其上游信号途径与整合素介导的酪氨酸磷酸化或Ca~(2+)-钙调素通路有关。     

纤维连接蛋白对支气管上皮细胞抗氧化损伤保护作用的研究

目的和方法：为验证整合素分子激活对支气管上皮细胞（BEC）的抗氧化性保护作用,本实验用臭氧（O3）攻击培养的兔BEC,测定细胞的^3H释放率、乳酸脱氢酶（LDH）释放活性及脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量,反映细胞损伤程度;观察纤维连接蛋白（Fn）及人工合成的精－甘－天冬氨酸片段（RGD肽）的保护效应。结果：①臭氧攻击使BEC的^3H释放率增高,Fn处理可减少臭氧所致的^3H释放,钙调素抑制剂W7能抑制Fn的这一作用,RGD可减轻臭氧所致的^3H释放;②臭氧攻击后细胞上清液中LDH释放增多,Fn或RGD处理均能降低LDH释放,W7阻断Fn的这一效奕;③臭氧作用后明显提高细胞内MDA含量,Fn或RGD可降低MDA含量;④臭氧攻击使细胞内GSH含量下降,Fn或RGD可增加BEC内GSH的含量;⑤Fn可增强BEC内过氧化氢酶（CAT）活性,但可被W7阻断,RGD则显示有剂量依赖性促进作用。结论：Fn及其特异识别片段与BEC的整合素分子结合后,可减轻臭氧对BEC细胞的损伤,其机理与经钙调素途径上调BEC抗氧化能力有关。     

Wound repair and proliferation of bronchial epithelial cells regulated by CTNNAL1

Adhesion molecules play vital roles in airway hyperresponsiveness (AHR) or airway inflammation. Our previous study indicated that adhesion molecule catenin alpha-like 1 (CTNNAL1) is relevant closely to asthma susceptibility, but its biological function or significance is still unclear. In the present study, we observed the temporal and spatial distribution of CTNNAL1 expression in mouse lung tissue with the OVA-sensitized asthma model and found that the level of CTNNAL1 mRNA showed a prominent negative correlation with pulmonary resistance (R(L)). To study the function of CTNNAL1 in airway, effects of CTNNAL1 on proliferation and wound repair activity of human bronchial epithelial cells (HBEC) was investigated with antisense oligonucleotide (ASO) technique. The results showed that: (1) CTNNAL1 ASO could decelerate the repairing velocity and proliferation of HBEC; (2) CTNNAL1 expression was increased on the edge cells of mechanic wounded area in culture; (3) extracellular matrix component fibronectin (Fn) obviously promoted wound repair activity and proliferation of HBEC, which could be blocked by CTNNAL1 ASO; (4) Western blot showed that Fn could promote FAK phosphorylation, which also be inhibited by CTNNAL1 ASO. In conclusion, the level of CTNNAL1 mRNA expression is highly correlated to airway resistance; CTNNAL1 may contribute to the wound repair and proliferation of HBEC. Furthermore, it may serve to Fn mediated cell-extracellular adhesion and its signal transduction.     

支气管上皮细胞在气道高反应中的作用

气道高反应的发病机制目前仍然不清楚,但人多数人认同是气道的一种慢性炎症。近十年来,上皮缺陷学说逐渐成为解释气道高反应机制的主流观点。气道上皮不再被仅仅看作为单纯的机械屏障,而是机体内环境与外部环境相互作用的界面。气道上皮具有广泛的生理作用,包括抗氧化、内分泌和外分泌、黏液运输、生物代谢、结构性黏附、损伤修复、应激或炎症信号传递、抗原递呈作用等。借助这些生理作用,支气管上皮细胞在气道局部微环境稳态维持中发挥重要作用。有理由相信,气道上皮的结构完整性缺陷或功能紊乱是哮喘和慢性阻塞性肺疾病等气道高反应性疾病的启动环节。