北京棒状杆菌AS1.299的营养缺陷型变异株生产赖氨酸的研究*

北京棒状杆菌AS1.299(Corynebacterium pekinense AS1.299)经硫酸二乙酯处理,得到的8株产赖氨酸的营养缺陷型中,要求高丝亮氨酸的4株,要求苏氨酸的2株,要求亮氨酸的1株,同时要求苏氨酸和蛋氨酸的1株。产赖氨酸能力最高者为4株要求高丝氨酸的菌株,其次是要求亮氨酸的和一株要求苏氨酸的菌株,而另一株要求苏氨酸和同时要求苏氨酸及蛋氨酸的菌株仅产少量赖氨酸。我们选取了一株赖氨酸较高的,要求高丝氨酸的变异株AS1.563,进行了摇瓶发酵条件的研究,这一菌株在含糖10%     

一些有尾噬菌体的形态和结构

以不同菌株(卡那霉素链霉菌、金色链霉菌、水稻白叶枯病菌、钝齿棒状杆菌、多粘芽孢杆菌和苏芸金杆菌)为寄主分离、选择不同类型有尾噬菌体,在电镜下观察它们的尾部和头部结构。根据负染色造成反差的强弱,结合空壳的构型,利用几何图形作图,可以正确识别噬菌体头部形态,并进行了讨论。此外,还发现苏芸金杆菌上一种尾部末端特殊结构的噬菌体。     

北京棒状杆菌AS1.299谷氨酰胺合成酶的提纯和性质

用热变性、硫酸铵分段沉淀和DEAE纤维素柱层析部分纯化了北京棒状杆菌AS1.299(Corynebacterium pekinense)谷氨酰胺合成酶,并用垂直平板电泳对酶进一步精制。酶对谷氨酰胺的Km值为16.4mM,对羟胺的Km值为43.5mM;酶的沉降系数为21S,SDS凝胶电泳测得酶的亚基分子量为56,000。化学修饰表明,该酶活力与硫氢基、色氨酸、精氨酸残基无关;酪氨酸修饰剂的作用引起酶活力下降,初步证明,组氨酸残基是该酶活力的必需基因。     

钝齿棒状杆菌噬菌体的鉴定及其核酸的分离和测定

对生产中广泛使用的钝齿棒状杆菌的噬菌体,进行了血清学分型,区分为两种血清型,并按代表株B 271和B 275的编号分别定名。这两株噬菌体的寄主范围十分严格,仅限于钝齿棒状杆菌及其相近的菌株。60℃处理后基本上失活。 B275噬菌体对pH值的稳定性较B 271噬菌体稍强,但二者对柠檬酸钠的反应截然不同,在试验浓度范围内,前者表现稳定,而后者不稳定。一级生长曲线试验表明B271和B 275的潜伏期分别为,8和65分钟,裂解量分别为44和54。B 271和B 275的DNA G-C%分别为57.80和64.87。此外,进行了电镜下的形态观察。     

北京棒状杆菌AS1.299谷氨酰胺合成酶活力调节的研究

北京棒状杆菌(Corynebacterium pekinense AS1.299)谷氨酰胺合成酶的转移酶活性依赖于Mn~(++),酶的生物合成酶活性依赖于Mg~(++),其他二价金属离子只能部分代替Mn~(++)和Mg~(++)的作用。Mn~(++)对ATP或ADP的克分子比对酶活力起调节作用。ATP、CTP,丙氨酸和甘氨酸对谷氨酰胺合成酶有较强的抑制作用;丝氨酸、谷氨酸和6-磷酸葡萄糖胺对酶活力的抑制作用分别是24,15和21％。效应物混合物对酶的作用被证明是累积性的抑制作用。     

L-脯氨酸发酵研究

本文报道北京棒状杆菌(Corynebacterium pekinense) AS 1.299鸟氨酸缺陷型突变株 AS1.727发酵产生L-脯氨酸的研究结果。培养基中需亚适量的精氢酸、80-100μg／l的生物素和高浓度的铵离子。氮源以氯化铵最优,硫酸铵次之．实验表明氯离子有利于产生L-脯氨酸,镁离子也有促进作用。在本实验所 使用的培养基中,30℃培养5天,产L-脯氨要达25mg／ml以上。用生成特殊的、难溶于水的五氯酚脯氨酸复合物,结合离子交换法和溶媒抽提法等分离技术,提取产品。经熔点、元素分析、比旋光度、红外光谱分析及纸上色谱分析,证明产物确是L-脯氨酸。     

北京棒状杆菌AS1.299的营养缺陷型变异株生产赖氨酸的研究

北京棒状杆菌AS1.299(Corynebacterium pekinenseAS1.299)经硫酸二乙酯处理,得到的8株产赖氨酸的营养缺陷型中,要求高丝亮氨酸的4株,要求苏氨酸的2株,要求亮氨酸的1株,同时要求苏氨酸和蛋氨酸的1株。产赖氨酸能力最高者为4株要求高丝氨酸的菌株,其次是要求亮氨酸的和一株要求苏氨酸的菌株,而另一株要求苏氨酸和同时要求苏氨酸及蛋氨酸的菌株仅产少量赖氨酸。我们选取了一株产赖氨酸较高的,要求高丝氨酸的变异株AS1.563,进行了摇瓶发酵条件的研究,这一菌株在含糖10%的培养基中赖氨酸产率达25.44毫克/毫升,糖转化率25%左右。经500立升罐扩大培养的初步试验,赖氨酸产率可达26.0毫克/毫升。     

环化腺苷酸对细菌生长的影响

用大肠杆菌(Escherichia coli AS 1.797)、北京棒状杆菌(Corynebacterium pekinense AS1.299)和巨大芽孢杆菌(Bacills megatertum AS 1.217)研究了细胞内环化腺苷酸(cAMP)浓度和外源cAMP对细胞生长的影响。结果表明,大肠杆菌在不同碳源中生长时,细胞的生长量随细胞内cAMF’浓度升高而降低。在以葡萄糖作碳源时,细胞内cAMP浓度低,外源cAMP。对生长有抑制作用,而cAMP的类似物5'-AMP则无抑制作用。在以乳糖、麦芽糖和甘油分别作碳源时,细胞内cAMP浓度高,外源cAMP对生长无影响。北京捧状杆菌以葡萄糖作碳源时,细胞生长也受外源cAMP的抑制,但cAMP的抑制作用不是专一的,它的作用可用类似物5’-AMP来代替。自身不合cAMP的巨大芽孢杆菌在不同碳原(包括葡萄糖)中生长时,生长不受外源cAMP抑制,也不受5’-Amt’的影响。因此认为,cAMP不是细菌生长的必需物,而是生长调节物,但这种调节物对巨大芽孢杆菌无效。     

产L-色氨酸菌株的诱变选育

本文报道了利用细菌直接发酵糖质原料生物合成L-色氢酸的研究结果。以谷氨酸产生菌北京棒状杆菌AS1.299为出发菌株,采用亚硝基胍多次诱变获得了几株产生L-色氨酸的菌株,其中。CG5突变株属于精氨酸和尿嘧啶缺陷型并具有对5MT,6FT,4FP的抗药性。在以葡萄糖为碳源,硫酸铵为氮源而不需添加任何前体物的培养基中,直接发酵五天,产酸能达8g／l。发酵终了用离子交换树脂提取发酵液,所得纯品经红外光谱,比旋光度,生物测定及纸上层析鉴定为L-色氨酸     

北京棒杆菌邻氨基苯甲酸合成酶基因的克隆、序列分析及表达

以北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)野生株AS1.299和突变株PD-67的基因组为模板,用PCR方法扩增了邻氨基苯甲酸合成酶(AS)基因(trpEG)片段和前端控制序列。核酸序列分析结果表明,该片段全长3374bp,包含3个ORF,推测分别为前导肽基因trpL、AS componentⅠ基因trpE和AS componentⅡ基因trpG。C.pekinense野生株AS1.299与突变株PD-67相比较,trpL基因完全一样;trpE基因有6个碱基的突变,导致了5个氨基酸残基的改变;trpG基因有1个碱基的突变,导致了1个氨基酸残基的改变;同时它们在-35序列处还有一个A→G的突变。通过同源性比较发现,C.pekinense AS1.299与Corynebacterium glutamicum ATCC13032和Brevibacterium lactofermentum的亲缘关系是很近的。trpL基因上游存在启动子区域,并能被Escherichiacoli的RNA聚合酶所识别,实现异源互补。野生型和突变型AS基因在C.pekinense AS1.299和PD-67中都得到表达,并且重组菌相对于宿主菌的酶活都有了很大提高。摇瓶发酵实验结果表明,带有突变型AS基因的PD-67重组菌生长比较慢,稳定期比PD-67推迟24h,但产生的L-色氨酸比PD-67高22.39%。     

L-赖氨酸发酵的研究钝齿棒状杆菌PI-3-2的L-赖氨酸发酵中间生产试验

1978年我们完成了北京棒状杆菌AS 1.563发酵生产L-赖氨酸研究的扩大试验。为进一步提高L-赖氨酸产率和糖原料的转化率,采用钝齿棒状杆菌(Corynebacterium crenatum)PI-3-2进行了L-赖氨酸发酵中间生产的研究,现报道如下。     

噬菌体浓缩方法的比较

目的：对不同噬菌体浓缩方法进行比较。方法：采用PEG沉淀、PEG反透析、阴阳离子结合树脂、超滤等5种方法对T4、T7、N4等3类噬菌体进行浓缩对比试验;在此基础上,用浓缩效果较好的方法对土壤和河道污水样本中的噬菌体进行浓缩,观察浓缩效果。结果：上述5种方法对3类噬菌体均有浓缩效果;超滤的浓缩效果最好,其次是PEG反透析,PEG沉淀没有很好的浓缩效果;河水样本中噬菌体的回收率比土壤样本高。结论：可通过PEG反透析、超滤或两者相结合的方法,得到高浓度的有活性的噬菌体。     

多耐药鲍曼不动杆菌噬茵体IME—AB6的分离、生物特性及保存方法研究

目的：分离并鉴定一株多耐药鲍曼不动杆菌噬菌体,对其生物特性进行研究,为治疗多耐药鲍曼不动杆菌感染提供新的方法和实验依据。方法：以一株多耐药不动杆菌AB6为宿主菌,从医院废水中分离出噬菌体;用聚乙二醇6000对噬菌体进行浓缩和纯化,并就噬菌体的形态、一步生长曲线、裂解特性和不同保存条件对噬菌体活性的影响进行初步研究。结果：分离出一株噬菌体IME-AB6,电镜显示为肌尾噬菌体,其潜伏期为10 min,爆发期为40 min,爆发量160 pfu/cell;IME-AB6能迅速使菌液变清晰,温度灵敏性强,并且发现在4℃保存是一种方便高效的方法。结论：噬菌体IME-AB6是一株新的有独特特点的噬菌体,用聚乙二醇能很好地提高滴度,其潜伏期和爆发期短且杀菌效能强,性能稳定易保存,这对于噬菌体制剂的开发和耐药性鲍曼不动杆菌的防治具有潜在应用价值。     

快速从医院废水中大规模分离铜绿假单胞杆菌噬菌体

目的:从医院废水中快速分离多株不同的铜绿假单胞杆菌噬菌体,研究其生物学特性,为建立铜绿假单胞杆菌噬菌体库做准备。方法:利用噬菌斑法从未经处理的医院污水中分离和鉴定铜绿假单胞杆菌噬菌体,根据感染谱的不同确定它们为不同的铜绿假单胞杆菌噬菌体;重点研究其中一株宿主谱较广的噬菌体的生物学特性,采用负染法电镜观察噬菌体的形态和大小,提取该噬菌体的基因组并进行酶切电泳分析,测定噬菌体感染复数并观察其一步生长曲线。结果:通过噬菌斑法分离出90株铜绿假单胞杆菌噬菌体。电镜观察显示,噬菌体Pa27P1头部呈立体对称,有一长尾;酶切结果显示,噬菌体Pa27P1的基因组为双链DNA;生长曲线表明噬菌体Pa27P1感染宿主菌的潜伏期为25 min,爆发时间为25 min,裂解量为514。结论:90株铜绿假单胞杆菌噬菌体中有5株具有较广的噬菌谱,其组合能裂解所有18株铜绿假单胞杆菌,为深入研究铜绿假单胞杆菌噬菌体的生物学特性及其功能提供了依据。     

鲍曼不动杆菌裂解性噬菌体LZ35的 分离及全基因组分析

摘要：目的 通过分离鉴定鲍曼不动杆菌噬菌体并进行遗传信息分析,为今后噬菌体用于治疗鲍曼不动杆菌引起的感染提供依据。方法 以鲍曼不动杆菌临床分离株为宿主菌,从医院污水中分离鲍曼不动杆菌噬菌体并进行纯化、电镜观察形态特征、提取噬菌体DNA,进行全基因组测序,分析全基因组的结构特征,比较基因组分析其进化关系。结果 分离到鲍曼不动杆菌裂解性噬菌体LZ35,电镜观察显示,该噬菌体属于有尾噬菌体目肌尾病毒科。基因组全长44 885 bp,G＋C含量为37.95%,含有83个开放阅读框,其中22个编码序列可预测其功能,61个编码序列为未知基因。噬菌体LZ35的基因组与鲍曼不动杆菌噬菌体IME-AB2和YMC-13-01-C62具有很高的同源性（分别为97%和99%）,与鲍曼不动杆菌噬菌体YMC11/12/R1215的进化关系最近。结论 以鲍曼不动杆菌临床分离株为宿主菌,分离到鲍曼不动杆菌裂解性噬菌体LZ35,明确了其形态和基因组特征,为防治噬菌体疗法奠定基础。     

一些芽孢杆菌噬菌体的形态和结构

通过电镜观察描述了生产中三株芽孢杆菌(B.subilis BF7658,B.subsilis AS 1.398和B licheniformis 2709)的噬菌体的形态和结构。它们的形态和大小多种多样。根据修正的Ackermaun和Eisenstark的形态分类法,它们包括了噬菌体分类中3个科(肌尾噬菌体科、长尾噬菌体科和短尾噬菌体科)以及9种有尾噬菌体中的4种形态型(即A1,B1,B2和c2型),并对其形态进行了讨论。     

芽孢杆菌质粒的研究II．几种芽孢杆菌质粒的分离与鉴定

侧孢芽孢杆菌AS 1.864,多粘芽孢杆菌AS 1.794,球形芽孢杆菌AS 1.560是带有质粒的菌株,通过琼脂糖凝胶电泳图谱分析,回收质粒DNA,并经电镜观察证明质粒DNA分子的存在。首次发现AS 1．864菌株的培养液及其无菌过滤液对蚊幼虫有显著的致死作用。     

北京棒状杆菌噬菌体脱氧核糖核酸的分离及其性质的研究

利用酚法除强白提取北京樟状杆菌的三株不同挑大梁清型的噬蓖体A2、A3 和 A133的核酸,对核酸的硷基组份进行了分析,含有四种通常的硷基,根据脱氧核糖核酸的解链温度,计算噬菌体脱氧核糖核酸的G+c克分子百分数分别依次为61．2、65．6和67．5％,所有噬菌体脱氧核糖核酸均联结有葡萄糖基。利用a-纤维素酶制备获得北京棒状杆菌的原生质体,所提取的三种噬菌体脱氧核糖核酸对此可以转染成功。     

维生素、氨基酸及重金属离子对北京棒状杆菌AS1.299产L-谷氨酸的影响

在实验室条件下,我们研究了维生素、氨基酸及重金属对北京棒状杆菌(Corynebacterium pekinense)AS 1.299产L-谷氨酸的影响。研究结果表明该菌为产谷氨酸较高的优良菌种。在摇瓶中谷氨酸产量一般可稳定在4.0%以上。1.该菌要求生物素作为必要的生长因子,而硫胺素能显著地促进其生长。为了积累大量的谷氨酸,同时要求上述两种维生素。前者最适浓度为2微克/升后者100-200微克/升已足够。并证明了组氨酸、胱氨、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、羟脯氨酸、色氨酸、半胱氨酸、天门冬氨酸及酪     

关于谷氨酸高产菌WTH-1菌的选育

近年来,我国味精生产发展很快,已达到相当规模。国外采用一次高糖或低糖流加工艺路线,使发酵产酸率和转化率提高。本试验以北京棒杆菌AS.1.299为亲株,经紫外线、通电、硫酸二乙酯以及氯化锂等复合诱变处理,定向选育耐高糖、耐高谷氨酸、不利用谷氨酸与抗