水稻叶绿体16S启动子克隆改造、载体构建及转化研究

利用PCR方法从水稻叶绿体基因组DNA中分离16S启动子, 并在其下游加入rbcL基因SD序列,以增强该启动子的翻译能力;序列分析表明, 除加入的SD序列外, 扩增片段与水稻（Oryza sativa）叶绿体基因组DNA序列16S启动子相应区域同源性为100%。将16S启动子与bar基因和gfp基因的融合基因连接,以psbA基因的3′序列为终止子, 并以烟草叶绿体trnH-psbA和trnK为同源片段构建了烟草叶绿体表达载体pR16S。 用基因枪转化烟草, 转化植株经Southern、Northern检测及后代遗传学分析, 发现16S启动子具有启动活性, 融合基因已在烟草叶绿体中稳定整合并遵循母系遗传规律。     

水稻叶绿体16S启动子克隆改造、载体构建及转化研究

利用PCR方法从水稻叶绿体基因组DNA中分离16S启动子,并在其下游加入rbcL基因SD序列,以增强该启动子的翻译能力;序列分析表明,除加入的SD序列外,扩增片段与水稻(Oryza sativa)叶绿体基因组DNA序列16S启动子相应区域同源性为100％。将16S启动子与bar基因和gfp基因的融合基因连接,以psbA基因的3′序列为终止子,并以烟草叶绿体trnH—psbA和trnK为同源片段构建了烟草叶绿体表达载体pRl6S。用基因枪转化烟草,转化植株经Southern、Northern检测及后代遗传学分析,发现：16S启动子具有启动活性,融合基因已在烟草叶绿体中稳定整合并遵循母系遗传规律。     

油菜叶绿体多顺反子定点整合表达载体的构建

根据拟南芥叶绿体基因组序列设计PCR引物,从我国甘蓝型油菜栽培品种F4叶绿体基因组中克隆了长度为1.5kb的trnI和trnA2个基因序列,核酸序列分析表明它们与拟南芥基因的同源性高达94%和99%,这两个克隆的油菜叶绿体基因组序列trnI和trnA被用于构建叶绿体定点整合表达载体。利用烟草叶绿体基因强启动子Prrn和终止子TpsbA,以及筛选标记基因aadA和目的基因HSA,构建了多顺反子表达盒Prrn-aadA-HSA-TpsbA,将表达盒置于油菜叶绿体trnI和trnA序列之间,最后构建成油菜叶绿体多顺反子定点整合表达载体pIPaHTA。酶切鉴定及序列分析证实,构建的表达载体具有预期的调控元件及结构,这为后期油菜叶绿体转化体系的建立奠定了基础。     

甘薯叶绿体表达载体构建及其融合基因在叶绿体中的瞬间表达

利用叶绿体基因组进化中高度保守的特点,根据烟草叶绿体基因组全序列设计引物,从甘薯(Ipomoea batatas)叶绿体基因组中克隆了2个相邻的功能基因rbcL(GenBank登录号为AY942199)和accD(GenBank登录号为AY942200),并以此作为定点整合外源基因的同源重组片段.以来自叶绿体基因组的强启动子Prrn和RpsbA-pro分别驱动选择标记基因aadA及phaC-gfp融合基因,构建成表达盒prrn-aadA-TpsbA-ter与RpsbA-pro-phaC-gfp-RpsbA-ter,然后将这2个表达盒串联在一起克隆进甘薯叶绿体同源片段中,获得甘薯叶绿体定点整合表达载体pSC-GFP.酶切分析证明,所构建的载体符合预期设计;采用该载体对甘薯叶片进行基因枪转化,结果显示,phaC-gfp融合基因可在叶绿体特异启动子和终止子的调控下在甘薯幼嫩叶片中瞬间表达,证明构建的载体pSC-GFP可用于甘薯叶绿体转化.     

拟南芥色氨酸生物合成途径中PAI基因编码区5'端序列对基因表达的影响

将3个非等位PAI基因的启动子与其编码区5'端序列及GUS报告基因拼接成表达质粒,并转化拟南芥.GUS活性分析表明,PAI基因编码区5'端序列对维持PAI启动子所驱动的GUS活性是必须的, 有无该序列对GUS活性影响极大,在PAI1和PAI3中相差60～100倍, PAI2中相差1倍左右.GUS组织化学定位有相似结果,具5'端序列时,PAI启动子所驱动的GUS在植株的不同组织器官中有不同程度的表达,在叶片的叶肉细胞、保卫细胞中表达, 但在无叶绿体的表皮细胞中不表达.因此认为PAI基因的5'端片段所编码的多肽确有PTP的功能,PAI基因产物主要在质体(叶绿体)中表现出活性.     

Bt基因甜菜叶绿体转化载体构建及毒蛋白表达

利用植物叶绿体基因组在进化中高度保守的特点,根据烟草、菠菜、水稻叶绿体基因组全序列资料设计合成引物,PCR扩增并克隆了甜菜叶绿体两个重要功能基因rbcL和atpB(GenBank登录号分别为DQ067450和DQ067451),并以其作为定点整合外源基因的同源重组片段,构建了Bt基因CryIAc甜菜叶绿体定点转化载体pSKARBt,酶切鉴定表明:所构建载体符合预期设计。对克隆菌菌体总蛋白进行了生物杀虫试验,结果表明:Bt基因CryIAc能够在叶绿体特异性启动子及终止子的调控下表达,并对二龄末甘蓝夜蛾有很强的毒杀作用。该载体构建对培育甜菜高抗虫品种具有重要应用价值。叶绿体转化及后续工作正在进行中。     

高粱叶绿体psbA基因的结构特征及其5'-非编码区的调控效应

报道高粱叶绿体光系统ⅡpsbA基因的结构特征及其5'-非编码区的调控效应.比较分析表明,C4植物高粱与C3植物水稻psbA基因的核苷酸序列及其推测的氨基酸序列的一级结构之间,存在着高度的同源性.高粱psbA基因5'-非编码区,含有类似原核的-10和-35保守的启动子元件,以及类似于真核的TATA盒启动子元件,但与水稻的相比,前者比后者在mRNA的前导序列区多出了一段7 bp的额外序列,这在有关文献中尚未见报道.应用体外分析体系,证实在高粱叶绿体蛋白质提取物中存在着与psbA基因5'-非编码区特异性结合的蛋白质因子.荧光素酶表达量的检测结果是,在大肠杆菌中,带有高粱psbA基因前导序列区的表达质粒pALqs,其荧光素酶表达量,要比带有水稻相应结构的表达质粒pALqr的高出2～5倍.     

玉米叶绿体表达载体的构建及AsRED基因原核表达

从玉米幼嫩叶片中提取玉米叶绿体基因DNA,通过PCR克隆出叶绿体同源重组片段trnA和trnI、叶绿体特异性启动子Prrn以及终止子psbA.构建玉米叶绿体表达载体pBAIRTARED,含有一个人工操纵子,其中,筛选标记基因aadA和红色荧光蛋白报告基因AsRED处于Prrn启动子和psbA终止子控制.将构建的载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,观测到重组细胞呈现红色,表明构建的载体可以用于玉米叶绿体转化以及表达报告基因.     

基于四环素调控系统的叶绿体启动子在大肠杆菌中活性检测

旨在研究四环素调控系统在叶绿体基因工程中调控启动子活性。以四环素基因及四环素特异性识别序列的核心操控区为基础,首先合成带有四环素核心操控区的prrn O1O2启动子,通过酶切连接的方法连接到表达载体Bio3-GFP,并在大肠杆菌中验证该启动子的活性。结果表明,在该启动子的驱动下GFP基因表达使菌落呈明亮绿色;构建四环素诱导下GFP基因的表达载体Bio3-Tet R-prrn O1O2-GFP,筛选出适应大肠杆菌生长的最高四环素使用浓度为5μg/m L;然后构建四环素调控系统下的GFP表达载体,在未加入四环素时,prrn O1O2启动子的功能被抑制,加入四环素后,GFP基因表达出绿色荧光蛋白。说明利用四环素调控系统可以在大肠杆菌中控制叶绿体启动子prrn O1O2的活性,从而避免了核基因组对质体基因组的调控干扰,为进一步利用质体基因工程育种提供有效的方法和途径。     

油菜叶绿体基因组同源重组片段的克隆及phb基因定点整合载体的构建

利用叶绿体基因组在进化过程中高度保守的特点,根据烟草、水稻和玉米叶绿体基因组全序列资料,设计合成引物,PCR扩增并克隆了油菜叶绿体两个重要的功能基因rbcL和atpB（GenBank登录号分别为AF267640和AF267641）,并以此作为定点整合外源基因的同源重组片段。以来自叶绿体的强启动子PpsbA和Prrn等驱动PHB合成途径中3个关键酶基因phbA、phbB和phbC,分别构建表达盒,并将它们按照其在原始菌株中的自然转录顺序phbC-phbA-phbB相串联,最后连同选择标记基因aadA表达盒一起,克隆到油菜叶绿体同源片段中,构建成phb基因定点整合载体pRCABZ和pRCABF。酶切及Southern杂交结果证明所构建的转化载体符合预期设计。叶绿体转化及后续工作目前正在进行之中。     

油菜叶绿体基因组同源重组片段的克隆及phb基因定点整合载体的构建

利用叶绿体基因组在进化过程中高度保守的特点,根据烟草、水稻和玉米叶绿体基因组全序列资料,设计合成引物,PCR扩增并克隆了油菜叶绿体两个重要的功能基因rbcL和atpB(GenBank登录号分别为AF267640和AF267641）,并以此作为定点整合源基因的同源重组片段。以来自叶绿体的强启动子PpsbA和Prrn等驱动PHB合成途径中3个关键酶基因phbA、phbB和phbC,分别构建表达盒,并将它们按照其在原始菌株中的自然转录顺序phbC-phbA-phbB相串联,最后连同选择标记基因aadA表达盒一起,克隆到油菜叶绿体同源片段中,构建成pgb基因定点整合载体pRCABZ和pRCABF.酶切及Southem杂交结果证明所构建的转化载体符合预期设计。叶绿体转化及后续工作目前正在进行之中。     

粳稻和籼稻D1蛋白光抑制敏感性的差异与其编码基因序列结构特征的相关性分析(英文)

粳稻 (OryzasativaL .ssp .japonica)和籼稻 (O .sativassp .indica)对光抑制的敏感程度存在差异 ,它们的叶绿体光反应中心Ⅱ核心蛋白D1的稳定性不同。以菌落原位杂交法克隆了粳稻“95 16”和籼稻“籼优 6 3”叶绿体D1蛋白的编码基因psbA。核苷酸序列同源比较显示 :两者在启动子区和 5′_UTR完全相同 ;编码区存在着个别碱基的差异 ,但均位于三联体密码的第三位 ,不影响氨基酸编码特性 ,在蛋白质氨基酸序列上没有差异 ;在 3′_UTR内存在寡聚U长度的差异。因此 ,粳稻和籼稻D1蛋白对光抑制作用敏感性的差异与其蛋白质的氨基酸序列结构无关 ,可能与调控psbA基因表达的上游因子或光保护机制的差异有关。     

大肠杆菌yigP基因转录调控序列的鉴定

【目的】调查yigP基因启动子的活性,并对该转录调控序列进行分析。【方法】以lacZ为报告基因,克隆启动子片段至启动子探针质粒中,通过检测β-半乳糖苷酶活性判断启动子活性,并通过克隆一系列逐步缩短的启动子片段来确定启动子所在区域。利用定点突变技术,对启动子的重要序列进行定点突变,调查其对启动子活性的影响。【结果】确定了yigP基因启动子的区域,鉴定了启动子的-10区和-35区,并发现了启动子上游存在一个负调控序列,对该序列进行了初步的研究显示其中部分序列是这种负调控作用的核心序列。【结论】对yigP基因的转录调控序列进行了鉴定,丰富了我们对基因转录调控的认识。     

大豆GmcpSecA基因的克隆及表达特异性

Sec途径是将核编码的叶绿体蛋白输入到类囊体腔的蛋白分选途径之一,对叶绿体正确行使其功能有重要作用。前期研究获得了拟南芥AtcpSecA功能缺失的突变体agyl,其叶片呈黄白色,叶绿体发育缺陷,内部缺少类囊体片层结构。我们从大豆中克隆了拟南芥AtepSecA的同源基因GmcpSecA基因的全长cDNA序列和5’端ATG上游1．5kb的启动子序列,通过RT-PCR的方法对GmcpSecA基因表达的器官特异性进行了初步分析;并构建了GmcpSecA：：GUS和35S：：GmcpSecA融合基因,以农杆菌介导的转化方法获得转基因拟南芥。GUS组织化学染色结果表明：在转基因拟南芥的子叶、叶片、花萼等绿色组织中都有较强的GUS表达,而在非绿色组织中没有GUS表达。通过将过表达载体p35S：：GmcpSecA转化agyl,结果表明GmcpSecA能够部分回补拟南芥agyl突变体的表型。推测GmcpSecA基因具有与AtcpSecA基因相似的功能,在叶绿体发育过程中发挥重要作用。     

高保守性启动子短序列建模研究

启动子是调控基因转录表达的核心元件。启动子上的突变会影响启动子的功能活性,从而导致基因表达异常。本研究通过挖掘启动子序列中蕴含的序列特征,提出了一个基于序列模式挖掘的启动子序列打分模型,通过该模型,实现对启动子序列信号强度的定量度量。试验结果表明,该模型可有效区分真、假启动子序列,计算验证试验表明该模型具有良好的鲁棒性,并可用于识别致病启动子序列突变。     

石刁柏雄性偏向核质体DNA的克隆与分析

该研究以雌雄异株植物石刁柏为材料,利用基因组消减杂交技术对石刁柏雌雄核基因组中的性别差异核质体DNA（nuclear plastid DNA,NUPTs）进行了分离和分析。结果表明：（1）通过构建消减杂交文库共获得了52个雄性偏向序列,序列长度分布在63~297 bp之间,其中有19个差异序列属于叶绿体来源序列（命名为Ao1~Ao19）,且这些序列与石刁柏叶绿体基因组的相似性均大于84%,Ao19与石刁柏叶绿体基因组相似性为100%。（2）利用基因组半定量PCR对19个NUPTs序列的性别差异分析表明,有4条序列为稳定的雄性偏向NUPTs序列,分别为Ao1、Ao3、Ao10和Ao18。（3）序列比对表明,转移到核基因组的NUPTs主要来源于叶绿体基因组的反向重复区（包含IRa和IRb区）,说明石刁柏叶绿体基因组重复区序列更容易向核基因组进行转移形成雄性偏向的NUPTs序列。     

水稻叶绿体转化载体pBS的构建及融合基因功能的初步鉴定

利用PCR方法分别从载体pchN-CAT-Bar和Psk51中分离得到编码膦丝菌素乙酰转移酶基因bar和绿色荧光蛋白基因sgfp,并在bar基因前段连接T7 leader sequence/5′-UTR和T7 10 N-terminus的8个氨基酸序列.运用融合PCR技术,得到bar和sgfp的融合基因片段BS.以水稻叶绿体基因组中的trnI和trnA为同源重组片段,来自烟草叶绿体16S rRNA的Prrn为启动子,psbA基因的TpsbA为终止子,融合片段作为双效筛选标记,构建水稻叶绿体转化载体pBS.大肠杆菌原核表达检测到明显荧光,基因枪轰击TP309愈伤,筛选抗性愈伤.     

重金属增强核因子与水稻金属硫蛋白基因启动子的结合

植物金属硫蛋白(metallothioneins, MT)被认为在植物应答重金属胁迫方面发挥了重要作用,但该基因的转录调控机制目前仍不清楚.我们以前的研究初步鉴定出位于-331/-194的水稻MT基因(ricMT)启动子区对于金属激活ricMT的表达是必需的.为了明确 -331/-194启动子序列在控制ricMT表达中的作用,本课题开展了该序列 与核因子的结合特性研究.从2周龄水稻嫩叶中提取了几乎不含叶绿体污染的细胞核,并制备 了核蛋白用于凝胶阻滞实验,发现核因子能够与-331/-194启动子序列特异 结合.本研究还进一步考察了重金属对核因子结合活性的影响,发现在结合体系中去除重金 属离子,核因子与-331/-194序列的结合能力会丧失,而在结合体系中加入重金属离子, 结合能力则会随着外加的离子浓度提高而增强,证明这种结合确实依赖于重金属.这些证据 结合以前的结果表明,某些金属响应的核因子可能通过结合-331/-194启动子区域来调控 ricMT基因表达.     

丝兰属6种植物叶绿体基因组特征分析

为了理清丝兰属（Yucca）叶绿体基因组特征和序列变异情况,进行丝兰属植物叶绿体比较基因组学分析,并构建基于叶绿体基因组的系统发育树。利用高通量测序技术获得无刺龙舌兰（Y. treculeana）叶绿体基因组序列,结合丝兰属现已发表的叶绿体基因组,使用生物信息学方法对6种丝兰属植物叶绿体全基因组进行基本结构、重复序列、边界收缩与扩张以及序列变异分析等在内的比较基因组学研究,并进行系统发育分析。结果表明：6种丝兰属植物叶绿体基因组大小、基因的类型及数目相近,种间基因组结构比较保守;从丝兰属植物叶绿体基因组中检测到多条重复序列,其中SSR位点多是由单核苷酸、双核苷酸和四核苷酸组成,且偏好使用A、T碱基;根据核酸多态性指数π≥0.008,在6种丝兰属植物叶绿体基因组中筛选出了psbK-psbl-trnS-GCU、rpl20-rps12和ccsA-ndhD 3个高变异区域;基于叶绿体全基因组和LSC+SSC区序列构建的系统发育关系基本一致,确定了6种丝兰属植物间的系统发育关系,其中无刺龙舌兰与克雷塔罗丝兰（Y. queretaroensis）的亲缘关系最近。本研究测序获得了无刺龙舌兰叶绿体基因组,揭示了6种丝兰属植物叶绿体基因组特征和序列变异情况,明确了各物种间的亲缘关系,研究结果可为后续丝兰属植物分子标记开发及系统发育研究提供参考。     

基于一致序列多样性分析的启动子预测方法

基于启动子的以下特点:(1)启动子区域有一些一致序列,但对于不同的启动子,一致序列在个别碱基上会有所改变,具有多样性;(2)一致序列的位置并不固定,总是在某个范围内波动;(3)大部分的真核生物启动子都和CpG岛有关。提出了一个新的启动子预测方法,即采用了一种新的统计建模策略,并首次提出了区间位置权重矩阵(IPWM)概率模型。大规模序列测试结果表明,新的启动子预测系统具有较好的敏感性和特异性。