表达苏云金杆菌5－内毒素基因的转基因烟草的抗虫性

苏云金杆蓠(Bacillus thuringiensis)HD-1的δ-内毒索基因原始克隆THl2和TH48分别含有5．3kb和6．6kb型类同源异族基因。经定点突变改造其5’端,酶切对3’端进行缺失后,在大肠杆菌中仍能表达出有杀虫活性的被修饰的毒蛋白。将上述加工过的基因插入到双元载体pBin437(pBinl9的派生质粒)中,借助辅助Ti质粒(Pal,1404转人烟草,获得了抗卡那霉索的再生植株。经southern印迹和狭槽印迹(slot blot)杂交证明有1-5个拷贝的毒素基因整合至烟草染色体中。Northern印迹法分析结果表明这两类基医都在转基因植株中得到表达。育4株5．3kb类型,3株6．6kb类型的转基因植株对烟青虫有高抗性,与对照相比,这7株转基因烟草植株的杀虫率可达40一50％,并能显著抑制昆虫蜕皮和生长发育,表现明显的抗虫作用。结果表明这两类毒蛋白基因都可在植物中表达并赋予转基因植株以抗虫性。     

转苏云金杆菌毒蛋白基因玉米植株的获得及其抗虫性分析

玉米( Zea mays L.)转化成功与否与基因型密切相关.在转化过程中,除少数模式品种能够形成再生频率较高且易转化的Ⅱ型愈伤组织外,大多数栽培品种往往只能够形成再生频率较低且不易转化的Ⅰ型愈伤组织.因此探索Ⅰ型愈伤组织的诱导及其转化条件,提高转化效率,对直接改良玉米优良自交系具有重要意义.应用基因枪转化技术将苏云金杆菌( Bacillus thuringiensis ) cry1Ac3基因导入玉米优良自交系E28及340的Ⅰ型胚性愈伤组织中,经过膦丝菌素(PPT)或潮霉素(HygB)筛选,获得了再生植株.经PCR检测、Southern blot分析及Bt毒蛋白ELISA检测证实,外源基因已整合到玉米基因组中,并已获得表达.抗虫性分析结果表明,部分转基因玉米植株对玉米螟虫有较强的抗性.还比较了PPT和HygB两种筛选剂的筛选效果,表明PPT筛选的抗性愈伤组织的再生频率要高于HygB筛选的再生频率.     

转苏云金杆菌毒蛋白基因玉米植株的获得及其抗虫性分析

玉米 (ZeamaysL .)转化成功与否与基因型密切相关。在转化过程中 ,除少数模式品种能够形成再生频率较高且易转化的Ⅱ型愈伤组织外 ,大多数栽培品种往往只能够形成再生频率较低且不易转化的Ⅰ型愈伤组织。因此探索Ⅰ型愈伤组织的诱导及其转化条件 ,提高转化效率 ,对直接改良玉米优良自交系具有重要意义。应用基因枪转化技术将苏云金杆菌 (Bacillusthuringiensis)cry1Ac3基因导入玉米优良自交系E2 8及 34 0的Ⅰ型胚性愈伤组织中 ,经过膦丝菌素 (PPT)或潮霉素 (HygB)筛选 ,获得了再生植株。经PCR检测、Southernblot分析及Bt毒蛋白ELISA检测证实 ,外源基因已整合到玉米基因组中 ,并已获得表达。抗虫性分析结果表明 ,部分转基因玉米植株对玉米螟虫有较强的抗性。还比较了PPT和HygB两种筛选剂的筛选效果 ,表明PPT筛选的抗性愈伤组织的再生频率要高于HygB筛选的再生频率。     

转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达行为

Bt toxin genes were the insecticidal genes most widely used in genetic engineering of pest resistant plant, were of important significance to study their expression behavior in transgenic plants. In this work, a plant expression vector, pBinMoBc, was constructed. It contained the Cry IA(c) gene under control of chimeric OM promoter and the Ω factor. The vector was transferred into tobacco (Nicotiana tabacum L.) plant via Agrobacterium-mediated transformation. ELISA assay showed that the expression levels of the Cry IA(c) gene in transgenic tobacco plants were significantly higher than that in wild-type tobacco plants. The highest could be up to 0.255% of total soluble proteins; the expression level of CryIA(c) gene in transgenic tobacco plant was changeable during the development stages of tobacco plant. Bioassay showed that pBinMoBc transgenic tobacco plants had more notable insecticidal activity than the wild-type tobacco plants. The above results indicated that pBinMoBc was an effective pest-resistent plant expression vector. This study would be very helpful in screening transgenic cotton with high resistance to cotton bollworm (Heliothis armigeva Hubner).     

转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达行为

构建了高效植物表达载体ｐＢｉｎＭｏＢｃ,该载体携带超强表达复合启动子ＯＭ及Ω因子控制下的ＣｒｙＩＡ（ｃ）基因。采用根癌土壤杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ Ｔｏｗｎｓｅｎｄ）Ｃｏｎｎ）介导的方法转化烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．）,ＥＬＩＳＡ检测表明,大多数转基因烟草中ＣｒｙＩＡ（ｃ）基因表达量均超过０．１％,最高可达０．２５５％;转基因烟草     

苏云金芽孢杆菌(Bt)晶体毒蛋白基因在烟草叶绿体中的表达

将全长３．５ｋｂ的Ｂｔ基因３’端缺失,得到长为２．１ｋｂ、１．８ｋｂ的基因。分别将这３个长度（１．８ｋｂ、２．１ｋｂ、３．５ｋｂ）的基因置于水稻叶绿体ｐｓｂＡ基因的启动子和终止子调控之下,并与选择标记基因ａａｄＡ（编码氨基糖苷－３’－腺苷酸转移酶,具壮观霉素抗性）表达盒相连;以烟草叶绿体基因ｔｒｎＨ－ｐｓｂＡ－ｔｒｎＫ为同源片段,构建成叶绿体转化载体ｐＢＴ３、ｐＢＴ８和ｐＢＴ２２。用基因枪把Ｂｔ基     

苏云金杆菌毒蛋白抗虫基因工程取得重大进展

害虫是作物的天敌。长期以来,化学杀虫剂在防治虫害方面发挥了重要的作用。但是,化学杀虫剂对环境的污染和人类健康的危害越来越受到人们的关注,因此,科学家们更加致力于生物防治特别是利用基因工程进行抗虫杀虫的研究。随着植物基因工程技术的发展,将苏云金杆菌毒蛋白(Bt毒蛋白)基因转入植物获得抗虫的转基因植物已成为可能。1987年,国外有三家实验室报道了将Bt毒蛋白基因转入烟草或蕃茄,获得抗虫植株。但表达量低,抗虫活性不高。中国科学院微生物所等单位的研究人员承担了国家“七五”攻关课题——苏云金杆     

表达昆虫特异性神经毒素AaIT基因的转基因烟草的抗虫性

经改造的昆虫特异性神经毒素AaIT基因插入植物高效表达载体得到重组质粒pNGY-2。重组质粒中AaIT基因5＇端与烟草花叶病毒(TMV)的Ω序列3＇端融合,受两个串联的35S启动子控制,通过土壤农杆菌LBA4404介导转化烟草NC89,经NPTⅡ选择后再经GUS染色挑选出阳性再生植株,Southern blotting进一步证实了AaIT基因已经整合到烟草基因组中,对棉铃虫(Heliothis armigera)的抗虫实验表明,转基因烟草有显著的抗虫活性。     

影响苏云金芽孢杆菌基因在转基因植物中表达的因素

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）杀虫晶体蛋白基因是植物抗虫基因工程中应用最广泛的基因资源。影响Bt基因在转基因植物中表达的因素繁多,阐明这些因素的效应对于获得Bt基因在受体植物中的稳定高效表达具有重要意义。现对Bt基因表达的主要影响因子,如Bt基因表达单元、植物发育、外部环境条件、受体植物遗传背景、整合位点及Bt基因沉默现象等进行了综述。     

苏云金芽孢杆菌毒蛋白发掘方法的研究进展

自上世纪初发现苏云金芽孢杆菌对昆虫有杀虫活性以来,如何发掘利用苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白服务于农业生产和人类的卫生防控就成为一个重要课题。从早期的分离菌株使用菌体的复合物喷施到使用分子手段转化植物特定表达,人类在苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的利用精准度上在不断提高,但随之而来就是抗性的产生。因此不断发掘可使用的新的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因资源就是一个很重要的话题。本综述就苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因的发掘方法研究做一系统论述。     

表达苏云金杆菌内毒素的转基因植物(英文)

为防治一些重要农业害虫 ,转基因Bt作物已在许多国家商业化种植。在发展Bt作物的初期 ,未经改造的Bt基因被直接用来转化作物。但由于BtmRNA的不稳定 ,不适当的剪切以及译后变异 ,Bt在作物上的表达水平往往很低且不稳定。后来 ,科学工作者对Bt基因进行了一系列针对性的改造或人工合成 ,从而使其在植物细胞中得到高效表达。本文着重总结了这一转基因技术的发展过程。其内容包括未经改造的Bt基因在植物中表达低的原因以及改善Bt毒蛋白表达的有关技术。     

苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因在小麦基因组中的甲基化修饰

通过花粉管通道法将苏云金芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）毒蛋白基因（Ｂｔ．ｔｏｘｉｎｇｅｎｅ）转进了小麦品种京花５号与８６Ａｌ。利用点杂交、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＰＣＲ等技术鉴定了转化植株的当代和子代,证实了Ｂｔｔｏｘｉｎｇｅｎｅ的导入与对小麦染色体的整合。利用对腺嘌呤（Ａ）与胞嘧啶（Ｃ）甲基化敏感与否的限制性内切酶组（ｍｅｄｈｙｌａｔｉｏｎ－（ｕｎ）ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｇｒｏｕｐ,ＭＲＥＧ）酶切和ＲＣＲ扩增（ＭＲＥＧ－ＰＣＲ）,对转化子代中的Ｂｔ基因片段甲基化形式进行了研究。结果表明,整合在小麦基因组中的Ｂｔ基因的Ａ和Ｃ的甲基化形式发生了变化     

苏云金杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞及转基因…

以葡萄的胚性愈伤组织作为农杆菌介导,Ｔｉ质粒转化材料,利用共培养法将苏云杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞,通过胚状体发生途径再生转基因植株。实验发现：８００μｍｏｌ／Ｌ的乙酰丁香酮诱导处理农杆菌和葡萄愈伤组织后可转将化效率提高５０倍。     

烟草环斑病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清的制备

烟草环斑病毒(Tobaccoringspotvirus,TRSV)是我国二类进境检疫危险性有害生物,对农业生产危害较大。本研究依据TRSV外壳蛋白基因cp序列设计合成了2条引物,通过RT-PCR扩增得到长约1500bp的目的片段。将目的片段与质粒pET-22b( )连接,构建了含TRSVcp基因的融合蛋白原核表达载体pETRSV-CP。序列分析表明,TRSV-SD1的cp基因全长1548bp,编码515个氨基酸与GenBank中其它TRSV分离物cp基因相比,核苷酸及推导的氨基酸序列同源性为90.7%~94.6%。将pETRSV-CP转入大肠杆菌,诱导表达。SDS-PAGE结果显示,表达的TRSVCP融合蛋白的相对分子质量约为58kDa。以此融合蛋白制备的抗血清的效价为1/1024,抗血清与TRSV具有良好的特异性反应。     

烟草环斑病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清的制备

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)是我国二类进境检疫危险性有害生物,对农业生产危害较大.本研究依据TRSV外壳蛋白基因cp序列设计合成了2条引物,通过RT PCR扩增得到长约1500bp的目的片段.将目的片段与质粒pET-22b(+)连接,构建了含TRSV cp基因的融合蛋白原核表达载体pETRSV-CP.序列分析表明,TRSV-SD1的cp基因全长1548bp,编码515个氨基酸与GenBank中其它TRSV分离物cp基因相比,核苷酸及推导的氨基酸序列同源性为90.7%～94.6%.将pETRSV-CP转入大肠杆菌,诱导表达.SDS-PAGE结果显示,表达的TRSV CP融合蛋白的相对分子质量约为58kDa.以此融合蛋白制备的抗血清的效价为1/1024,抗血清与TRSV具有良好的特异性反应.     

苏云金芽胞杆菌S-层蛋白基因的异源表达及分离纯化

S-层(S-layer)普遍存在于古菌、G~+、G~-菌中,由S-层蛋白所构成细菌S-层结构的生物体中,其功能引起了科学家的广泛关注,但目前S-层的功能大都处于推测阶段。究其原因,是因为外源S-层基因可以造成宿主大肠杆菌的致死效应。本研究将一株苏云金芽胞杆菌的两个S-层蛋白基因(GenBank登录号为AJ012290和AY460125)的3’端序列在大肠杆菌BL21(DE3)中成功进行异源表达,在0.8mmol/LIPTG诱导培养6h时,菌体中包涵体表达量达到最高;并对表达蛋白进行了初步分离纯化,以期为后期利用该纯化蛋白进行抗血清制备,进而对该菌的S-层蛋白在宿主菌中的定位、功能分析打下基础。     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析

选择本实验室分离的苏云金芽胞杆菌李氏亚种 (subsp. Leesis) 菌株YBT833、鲇泽亚种(subsp.Aizawai) 菌株YBT-1416和库斯塔克亚种(subsp. Kurstaki)菌株YBT1535为出发菌株,以营养期杀虫蛋白基因PCR扩增的特异片段为探针,进行总DNA酶切片段的Southern杂交定位。结果显示3株菌株的营养期杀虫蛋白基因,均位于经XbaI完全消化的4～5kb大小的DNA 片段上。将该区域DNA片段回收后克隆到pUC19载体,建立了3个较基因组文库小的亚基因组文库。通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定分别得到3个相应的营养期杀虫蛋白基因vip83、vip14和vip15,并对其测序。DNA序列比较发现基因vip83与已知营养期杀虫蛋白基因存在5个差异碱基。将vip83、vip14基因亚克隆到苏云金芽胞杆菌大肠杆菌穿梭载体pHT315, 分别得到重组质粒pBMB8901和pBMB8902。将它们电转化到vip^-的B.t.受体菌BMB171和4Q7,获得了相应的工程菌BMB8901-171,BMB8902-171,BMB8901-4Q7和BMB8902-4Q7。SDS-PAGE电泳检测均有88kD大小的蛋白表达。生物测定结果亦表明了,营养期杀虫蛋白Vip83和Vip14对鳞翅目棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾的三龄幼虫均有一定的杀虫活性;其中对小菜蛾的毒力最高,LC₅₀值分别为28.6,31.6,45.4和37.6μL/mL。该结果为构建高效广谱工程菌提供了实际材料和理论依据。      

枯草芽孢杆菌纤溶酶基因在转基因烟草组织中的分泌表达

克隆枯草芽孢杆菌纤溶酶(Bacillussubtilisfibrinolyticenzyme,BSFE)基因及其前导肽序列。通过农杆菌EHA105介导转化,获得转基因烟草植株。其BSFE的表达水平为叶片42.97±28.59U·g-1FW、茎15.14±10.57U·g-1FW和根25.55±14.71U·g-1FW。其内源BSFE信号肽可在转基因烟草中行使蛋白转运功能,使BSFE具有分泌表达特性。这一系统可用于建立利用植物组织分泌表达外源蛋白的系统模型。     

苏云金杆菌杀虫蛋白的多样性

苏云金杆菌是生物防治中应用最为广泛的一种杀虫剂,其杀虫蛋白具有广泛的多样性。本文就苏云金杆菌杀虫蛋白的基因、基因分布、杀虫蛋白结构以及作用机制的多样性进行了概述。