欧李自交不亲和S基因的克隆及序列分析

以6株欧李优选株系为实验材料,利用引物EM-PC2consFD和EM-PC3consRD对欧李进行S等位基因的专一性PCR扩增、克隆测序,获得了9个大小不同的序列,经BLAST分析确定为欧李的9个新S基因,分别命名为S1~S9,GenBank登录号依次为EF569602、EF569603、EF577404、EF577405、EF595836、EF595837、EF601047、EF653137、EF653138,并确定了6株欧李优选株系的S基因型。依据欧李的9个新S基因和李属其它S基因构建系统树,聚类结果显示李、杏、梅、欧李、扁桃及甜樱桃种间相互交叉,表明李属果树的S基因起源于共同的祖先;李、杏、梅、扁桃及甜樱桃应归为一个属,即李属;并初步探讨了欧李的分类地位。     

核果类果树自交不亲和性研究进展

综述了核果类果树甜樱桃(Prunus avium L.)、杏(P. armeniaca L.)、扁桃(P. dulcis (Mill.) D. A.Webb)和梅(P. mume Sieb)等自交不亲和性的研究进展。着重讨论了S-RNase基因(S基因)和SLF基因(S-locus　F-box基因,或称SFB基因),S基因在杂交后代群体中的遗传规律,利用S基因的遗传特性选育自交亲和品种和确定S基因型的主要方法及其特点以及自交亲和机制的几种可能的类型。     

核果类果树自交不亲和性研究进展

综述了核果类果树甜樱桃(PFunus avium L.)、杏(P.armeniaca L.)、扁桃(P.dulcis(Mill.)D.A.Webb)和梅(P.mume Sieb)等自交不亲和性的研究进展.着重讨论了S-RNase基因(s基因)和SLF基因(S-locus F-box基因,或称SFB基因),S基因在杂交后代群体中的遗传规律,利用S基因的遗传特性选育自交亲和品种和确定S基因型的主要方法及其特点以及自交亲和机制的几种可能的类型.     

24份甜樱桃材料自交不亲和S基因型鉴定

甜樱桃品种绝大部分自交不亲和,限制了甜樱桃的正确评价和合理利用,因此自交不亲和基因型的鉴定对于生产具有重要意义。以24个甜樱桃主栽品种为材料,用5对蔷薇科李属引物组合对24个甜樱桃品种进行了S等位基因的PCR扩增,克隆S基因的扩增片段,用核酸序列在Gen Bank上搜索,确定了5种S基因的核酸序列和大小。结果表明:Pru C2+Pru C4R引物组合扩增效果最好;在琼脂糖凝胶上位置相同的扩增带其核酸序列相同,是同一种S基因;5种S基因扩增片段的大小分别是S1为800 bp,S3为762 bp,S4为962bp,S5为300 bp,S6为456 bp,S9为650 bp;24个甜樱桃S基因型是红手球、早红宝石为S1S3,拉宾斯S1S4',红宝石S1S6,布鲁克斯S1S9,那翁S3S4,秦林、泰安大紫、先锋、早大果、丽珠、美早、5-106、左滕锦、桑提娜为S3S6,黑珍珠、红灯、萨米脱、秦樱为S3S9,胜利为S5S9,明珠、红蜜、雷尼、滨库为S6S9。     

基于核基因和叶绿体基因序列的杏属系统发育分析——探讨洪平杏的起源和亲缘关系

洪平杏(Armeniaca hongpingensis C. L. Li)是杏属的一个狭域分布种,基于形态观察被推测为杏(A.vulgaris Lam.)和梅(A. mume Sieb.)的天然杂交种,但目前尚无该种与杏、梅亲缘关系的分子系统学研究。本文以洪平杏的成株和实生苗以及包括杏、梅在内的6种(含1变种)杏属植物为研究材料,分别采用核基因(ITS和SBEI)和叶绿体基因(mat K和ycf1b)序列构建系统发育树,并采用mat K、ycf1b和SBEI基因序列构建单倍型网络图,探讨该物种与杏、梅及杏梅(A. mume Sieb. var. bungo Makino)之间的亲缘关系。基于核基因和叶绿体基因序列分别构建的系统发育树均显示,洪平杏的成株及其全部实生苗个体单独聚为一支,且具有较高的支持率(分别为99/79、71/81),独立于杏属其他种之外。而基于核基因ITS序列的系统发育分析结果表明,洪平杏除极少数成株与杏、杏梅聚为一支外,其余所有成株与实生苗聚为2大支(支持率分别为0.82和0.97),而没有克隆的与梅聚在一起。单倍型分析结果表明,该物种的成株与实生苗在SBEI和ycf1b基因序列中均未检测到杏或梅的单倍型,仅有少数(2/9)的实生苗个体在叶绿体mat K基因序列中检测到杏的单倍型。研究结果不支持将洪平杏定为杏和梅的天然杂交种的观点,推测洪平杏应为一个独立的物种,与杏之间的亲缘关系更近并且存在可检测到的基因流。     

九台晚李PGIP基因的克隆及生物信息学分析

以九台晚李叶片基因组为模板,PGIP基因保守序列设计引物,PCR扩增到1条全长1192bp的目的片段(GenBank登录号:GU068978)。该基因包含有1个完整的开放阅读框,由2个外显子和1个内含子构成,外显子总长990bp,编码330个氨基酸,其编码的氨基酸序列中含有一段典型的亮氨酸重复序列。序列分析表明:该基因与中国李、杏、桃、马哈利樱桃、梅等李属植物的PGIP基因序列一致度达95%~99%。系统进化分析显示出属内亲缘关系较近、属间亲缘关系较远的特点。该序列为植物分子抗病育种提供了1条新的基因资源。     

杏属和樱属植物新组合

报道了蔷薇科李亚科两个种的改隶新组合,将广义李属中的背毛樱Prunus hypotrichodes改隶为杏属中的背毛杏Armeniaca hypotrichides;疏花稠李Prunus laxiflora改隶为疏花樱Cerasus laxifiora。进一步研究的结果,同意前苏联学者G．V．Eremin et V．S．Simagin的意见,将稠李属中的种斑叶稠李Padus maackii改隶为樱属中的斑叶樱Cerasus maackii。     

榆叶梅及其部分近缘种的染色体核型分析

采用常规压片法,对5份榆叶梅材料和桃、梅、李、杏4份近缘种材料进行了核型分析,首次报道了4类榆叶梅栽培品种材料的核型。结果表明:‘紫烟’榆叶梅染色体数目为42条,其它榆叶梅材料均为八倍体(2n=8x=64),桃、梅、李、杏均为二倍体(2n=2x=16);核不对称系数为57.68%~63.08%;核型分类为2B和2A型。其中‘紫烟’榆叶梅染色体相对长度组成为:2n=6L+9M2+24M1+3S;近缘种中桃与榆叶梅的核不对称性较接近。     

东北地区李属(Prunes L.)植物导管分子形态结构研究

利用扫描电子显微镜(SEM)和树脂铸型法对东北地区10种李属植物导管分子类型、纹孔式、穿孔板类型的微形态结构特征进行了观察,并测量管腔长度、宽度、尾端长度及端壁斜度角的量化数据。结果显示:在不同生境下该属同种植物的导管类型、尾端长度与穿孔板类型较为稳定。所观察的李属植物存在3种导管类型:螺纹、孔纹、网纹导管。除山杏、欧李、东北李3种植物中仅存在网纹与孔纹2种类型的导管外,其余7种植物普遍存在3种类型导管。螺纹加厚在该属导管分子中普遍存在。单穿孔板在李属所观察植物中普遍存在,仅在黑樱桃、毛樱桃和郁李中发现梯状穿孔板。仅在稠李、东北李、郁李及山杏中观察到相对原始的对列—互列同时存在的纹孔式,其余6种均为互列式纹孔式。根据结构分析,认为东北地区10种李属植物中,郁李最为原始,欧李最为进化。同时,发现管腔长度、宽度与端壁面积与生境显著相关。在对尾端长度测量发现,同种植物导管分子的尾端长度在不同生境下长度较为稳定,几乎没有变化,可作为微观植物分类学的分类依据。     

沙柳SpsLAS基因超表达对拟南芥营养生长的影响

用沙柳SpsLAS基因构建35S∷SpsLAS超表达载体并转化野生型拟南芥,对转基因拟南芥进行表型观察,利用荧光定量PCR,对分枝、生长素及细胞分裂素相关基因进行表达分析。结果显示:(1)成功构建35S∷SpsLAS超表达载体,并获得9株纯合转基因株系,且转基因株系的萌芽速率快于野生型(对照),生活周期也较长;其中7个株系表现为生长迅速、株高增加、莲座叶叶片增大、分枝增加,2个株系表现为矮化、分枝增加、育性降低等一系列变化。(2)荧光定量PCR显示,与对照相比24h时转基因株系幼苗生长素及细胞分裂素途径关键基因无明显变化,4d时各基因在各转基因株系呈上调趋势;30d时分枝相关基因RAX1、RAX3表达量均上调,而MAX1、MAX3、REV、AXR1无明显变化。研究表明,SpsLAS基因过表达对拟南芥株型、莲座叶有明显影响,该研究结果为进一步研究该基因对分枝调控机制奠定了基础。     

中国李PGIP基因的克隆及序列分析

以中国李叶片基因组为模板,PGIP基因保守序列为引物,扩增到1条全长1 192 bp的目的片段(Genbank登录号:DQ200847).序列分析表明:该片段与杏、桃、马哈利樱桃、梅的PGIP基因序列一致度达96%~99%,包含有1个完整的开放阅读框和1个内含子,其编码的氨基酸序列中含有一段典型的亮氨酸重复序列;分子进化分析表明,在分子进化树中,该序列与杏、桃、马哈利樱桃、梅的PGIP序列位于同一类.为植物分子抗病育种提供了1条基因资源.     

不同地域野生欧李及其近缘植物亲缘关系的RAPD分析

利用RAPD分子标记技术对21个不同地域欧李及其近缘种属植物(桃、杏、李、樱桃)进行了遗传亲缘关系及分类研究。结果表明,用于不同地域野生欧李分析的25条引物中,共扩增出441个清晰可用的DNA片段,其中多态性位点366个,多态性比为82.99%。在遗传相似系数为0.71时,可将中国野生欧李资源划分为3个大的区域,分别为东北分布群、华北华东分布群与中西部分布群。用于欧李及其近缘种属植物分析的20条引物中,共扩出多态性带683条,多态性比率为98.99%。聚类分析表明,在遗传相似系数为0.61时,欧李与其近缘种属植物分为3大类;欧李与麦李的亲缘关系最近,与桃亲缘关系最远。     

表达γ-亚麻酸的无筛选标记转基因大豆的鉴定

对所获得的9株无筛选标记基因的T1代莆豆8008转基因大豆的T2代进行了分析。PCR和Southern杂交检测表明标记基因已不存在于转基因株系中,同时目的基因以纯合或者杂合状态存在于部分株系中,除草剂抗性分析也表明这些转基因株系已不再具有抗除草剂的能力。Northern杂交检测表明Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因株系中可以转录。GC分析表明其中6个转基因植株富含GLA。     

葡萄抗病无核胚挽救育种及分子标记辅助选择

以欧洲葡萄无核品种为母本,中国野生葡萄双优、欧山杂种北醇及8个欧洲葡萄品种为父本共进行了16个组合的杂交,通过胚挽救技术获得胚挽救苗55个株系。利用无核基因特异引物GSLP1、抗黑痘病和抗炭疽病基因RAPD标记对杂种株系进行分子检测,杂种中检测出拥有无核基因RAPD标记的22株、拥有抗黑痘病基因RAPD标记的16株、拥有抗炭疽病基因RAPD标记的9株。在这些胚挽救杂种苗中,同时拥有无核、抗黑痘病、抗炭疽病基因RAPD标记的胚挽救苗4株,同时拥有无核和抗黑痘病基因RAPD标记的胚挽救苗9株,同时拥有无核、抗炭疽病基因RAPD标记的胚挽救苗1株。     

农杆菌介导抗储粮害虫转基因小麦(Triticum aestivum L.)的获得及分析

以本实验室选育的小麦优良品系的胚性愈伤组织为材料,采用农杆菌介导将抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTI转入小麦培养细胞,经筛选获得抗卡那霉素的愈伤组织并再生植株。经PCR和实时PCR检测、PCR-Southern和Southernblot验证,确定了3株独立再生植株为含有CpTI的转基因植株。农杆菌菌浓度、侵染时间及转化处理方式对小麦转化率均有明显影响。3株转基因植株正常可育并结籽,形成转基因株系。外源基因在转基因植株T1代中的分离呈多样性,部分株系(转基因株系T-Ⅰ、T-Ⅲ)表现出孟德尔遗传规律。抗虫试验表明,3株转基因植株T2代籽粒对储粮害虫麦蛾具有一定的抗性,转基因株系T-Ⅰ、T-Ⅱ、T-Ⅲ及非转基因植株的T2代籽粒虫蛀率分别为19·8%、21·9%、32·9%和58·3%。转基因植株T1代群体农艺性状调查显示,3个株系具有良好的农艺性状,为小麦的遗传改良提供了新的种质抗虫材料。     

泰安枣疯病植原体的分子鉴定

【目的】对3个枣疯病病原物泰安株系进行分子鉴定。【方法】采用植原体通用引物对R16F2n/R16R2,通过直接PCR技术,扩增枣疯病植原体16S rDNA基因,通过16S rDNA基因序列分析和在线模拟16S rDNA-RFLP分析,并将其16S rDNA基因序列提交到GenBank数据库。【结果】3个枣疯病病原物16S rDNA基因片段与16SrⅤ-B亚组中枣疯病植原体(AB052876和AF279272)、樱桃致死黄化植原体(AY197659)及杏卷叶植原体(FJ572660)的同源性高达99.5%99.7%,分别命名为枣疯病植原体泰安圆铃1号株系(Jujube witches’-broom phytoplasma strain Yuanling1,JWB-Yuanling1,TA)、枣疯病植原体泰安鲁北冬枣株系(Jujube witches’-broom phytoplasma strain Lubeidongzao,JWB-Lubeidongzao,TA)和枣疯病植原体泰安大白铃株系(Jujube witches’-broom phyto-plasma strain Dabailing,JWB-Dabailing,TA),基因登录号分别为:HM989946、HM989947和HM989948。【结论】3个枣疯病植原体泰安株系均归属于16SrⅤ-B亚组。     

扁桃CBF1转录因子的克隆及原核表达分析

为了探明CBF转录因子在扁桃中的抗寒分子机理,以新疆栽培扁桃‘矮丰’叶片为材料,通过PCR技术从扁桃基因组DNA中获得CBF1转录因子,命名为AF-Pd CBF1,Gen Bank登录号为KM245570。序列分析表明,该基因开放阅读框为729bp,编码242个氨基酸,推测蛋白质分子量为27.405 k D,并且该蛋白没有信号肽。进化树分析表明,AF-Pd CBF1与甜樱桃和中国梅的亲缘关系最近。将该基因片段连接到原核表达载体p ET-32a(+)中,构建融合表达质粒p ET-Pd CBF1,转化到E.coli Rosetta(DE3)中进行表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期大小一致,分子量大小约为47.8 k D。对重组蛋白的诱导条件进行优化后结果表明,重组蛋白p ET-Pd CBF1在IPTG浓度为0.2 mmol/L、诱导4 h时,其表达量最佳。试验结果可为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定基础。     

甜樱桃(Prunus avium L.)品种S基因型鉴定

根据蔷薇科S-RNase基因(S基因)高度保守区C2和RC4区设计一对特异引物PruC2和PruC4R,对甜樱桃品种的基因组DNA进行S基因特异PCR扩增。克隆S基因的扩增片段,核酸序列在GenBank上搜索,确定了4种S基因的核酸序列和大小。结果表明,在琼脂糖凝胶上位置相同的扩增带其核酸序列相同,是同一种S基因。4种S基因扩增片段的大小分别是：S1为677bp,S3为762bp,S4为945bp,S6为456bp。参试的自交不亲和品种的S基因型分别是：红灯、红艳、早红宝石和先锋相同,为S1S3;抉择、红丰和那翁相同,为S3S4;大紫为S1S6;长把红为S1S4;养老为S2S6;自交亲和品种外引7号和斯太拉为S3S4。     

转几丁质酶和葡聚糖酶基因棉花的获得及其对黄萎病的抗性

通过根癌杆菌介导法,将维管束特异启动子(竹节花黄斑病毒启动子CoYMV)启动的几丁质酶和CaMV35S启动的β-1,3-葡聚糖酶嵌合双价基因,导入陆地棉品种冀合321和中棉所35。利用卡那霉素涂抹法对转基因株的卡那霉素抗性进行初步鉴定,再经PCR和Southern杂交确证,结果显示双价抗病基因分别以1～2个拷贝整合到棉花基因组内。对转基因株系T3幼苗进行无底塑钵菌液浇根法鉴定和大田病圃鉴定,结果显示：7个转化株系均表现不同程度的抗或耐黄萎病性,苗期鉴定结果和大田病圃调查结果基本一致;其中D9910、D9915和D9919等3个转基因纯合系的大田病情指数分别为6．5、9．4和9．5．均达到高抗水平。对以上3个高抗黄萎病的纯合系进行遗传分析,结果显示这3个抗病纯合系的卡那霉素抗性符合一对显性基因分离规律。结合分子杂交验证结果,可以认为这3个转基因株均含有一个拷贝的双抗病基因。     

应用斑点杂交方法对甜菜易位系传递率的分析

以白花甜菜特异的DNA重复序列1054作为探针,PCR法进行标记,对16个株系共264株进行了斑点杂交检测。结果表明,其后代总传递率达50.4%,其中株系11和株系14的传递率高达100%和83.3%。对高频传递株系的进一步研究,为确定其是否带有无融合生殖基因及进一步缩小无融合生殖基因的寻找范围提供了必要的研究基础。