人I型胶原基因第一内含子调节转录的研究

人Ｉ型胶原α１（Ｉ）链（ＣＯＬＩＡ１）基因内含子序列在不同细胞内有不同的转录调节活性,报道了含人ＣＯＬＩＡ１基因内含子Ｉ不同区段（＋５４４～＋８５５和＋８２０～＋１０９３）的重组质粒ｐＳＣＥＰ－ＣＡＴ和ｐＳＣＩＰ－ＣＡＴ的构建并转染人胚肌腱成纤维细胞和Ｔｃａ８１１３舌癌细胞,地高辛标记抗ＣＡＴ－ＥＬＩＳＡ检测结果显示：ｐＳＣＥＰ－ＣＡＴ在两种细胞均获表达;ｐＳＣＩＰ－ＣＡＴ在人成纤维细胞未表达,但     

回转对COL1A1-EGFP基因表达的影响

研究微重力对COL1A1(Ⅰ型胶原α1链基因)启动子活性的影响,探讨微重力对成骨细胞相关基因表达影响的作用机制.将长为3.6 kb COL1A1启动子双酶切,获得不同长度的启动子片段,并与报告基因EGFP(增强型绿色荧光蛋白)连接,转染ROS17/2.8细胞,用G418筛选,得到稳定转染COL1A1-EGFP基因的ROS17/2.8细胞株.利用回转器模拟微重力效应,体外培养条件下,观察各细胞株报告基因的表达情况.结果显示细胞在模拟微重力下培养24,48 h后,报告基因EGFP和Ⅰ型胶原的表达升高,表明COL1A1启动子活性增强.说明短期模拟微重力条件下,成骨细胞能通过增强COL1A1启动子活性,代偿性提高Ⅰ型胶原的表达.     

应用寡核苷酸圈套技术研究胰岛素调控人α1（Ⅰ）型胶原基因转录

目的 应用寡核苷酸圈套技术研究胰岛素对人COL1A1基因转录的调控.方法 建立稳定转染pCOLH12.5质粒（含CAT基因与人COL1A1基因-2483～＋42bp片段）的WI-38细胞株,加入不同剂量胰岛素,测CAT值;分别瞬时转染不同序列ssPT入克隆细胞株中,加入2.5 μmol/ml的胰岛素,测CAT值.结果 2.5 μmol/ml的胰岛素显著增加了COL1A1基因启动子活性;含sp1l位点的ssPT浓度为120 nmol/L时,受胰岛素刺激所增加的CAT值得到显著抑制,不含sp1位点的ssPT无此作用.结论 ssPT能够应用于基因转录调控的研究.胰岛素在人COL1A1基因上的反应元件可能位于启动子-129至-105区域内.     

一成骨不全家系的COL1A1基因突变检测

成骨不全(Osteogenesisimperfecta,OI)是一种由于Ⅰ型胶原形成障碍,导致骨脆性增强为主要症状的 常染色体显性遗传性疾病。临床上主要表现为骨质脆弱、蓝巩膜、耳聋和中等程度的关节畸形等症状。成骨不全 基因分别定位于17q21.31 q22和7q22.1,其致病基因分别为COL1A1和COL1A2。对一常染色体显性遗传的 成骨不全家系进行连锁分析,在COL1A1遗传位点发现紧密连锁(LOD=9.31;θ=.00)。突变检测发现在 COL1A1基因第26内含子5′端剪接位点处存在一由GT转换为AT的致病突变,该突变引起的异常剪接是导致成 骨不全的致病原因之一。     

COL1A1基因转录调控序列变异与单纯性马蹄内翻足的相关性

采用半定量RT-PCR方法检测20例单纯性马蹄内翻足患儿下肢肌肉及肌腱组织中COL1A1基因mRNA的表达, 根据COL1A1基因转录调控区-1 031 bp~ +30 bp及第1内含子的序列, 设计8对引物, PCR扩增后, 采用变性梯度凝胶电泳技术筛查突变并测序。半定量RT-PCR结果表明, 与正常对照组相比, 单纯性马蹄内翻足患儿患侧肌肉及肌腱组织中COL1A1基因表达水平明显上调(t =12.680, P＜0.05); 经PCR-DGGE筛查并测序发现1名患者存在-161(C→T)的杂合变异, 另1名患者存在+274(C→G)的纯合变异。二者均为新发现的变异。提示COL1A1基因转录调控序列变异可能是单纯性马蹄内翻足的致病原因之一。     

Ⅰ型胶原蛋白α1链的真核表达及其与成纤维细胞的作用

[目的]构建鼠Ⅰ型胶原蛋白α1链(COL1A1)C端甘氨酸重复序列(氨基酸1 000~1 189)的真核表达载体,探究其与成纤维细胞(Rat-1)的相互作用。[方法]以COL1A1 c DNA为模板,PCR扩增甘氨酸重复序列基因,克隆至p AP-tag4载体上得到重组质粒,命名为p AP-Gly。将p AP-Gly转染至CHO细胞,Western Blot鉴定目的蛋白。用细胞原位和定量染色及配体受体亲和印迹实验探究其与Rat-1细胞的相互作用。[结果]p AP-Gly成功构建并表达,Western Blot检测到77k Da的目的条带。AP-Gly与Rat-1的原位染色及定量染色相对OD405值(OD405=1.157±0.066)表明其能与Rat-1结合。[结论]p AP-Gly成功构建并表达,融合蛋白能和Rat-1表面相互作用,为研究Ⅰ型胶原蛋白在成纤维细胞表面上的受体复合物奠定了基础。     

一成骨不全家系的COL141基因突变检测

成骨不全(Osteogenesis imperfecta,OI)是一种由于Ⅰ型胶原形成障碍,导致骨脆性增强为主要症状的常染色体显性遗传性疾病。临床上主要表现为骨质脆弱、蓝巩膜、耳聋和中等程度的关节畸形等症状。成骨不全基因分别定位于17q21．31-q22和7q22．1,其致病基因分别为COL1A1和COL1A2。对一常染色体显性遗传的成骨不全家系进行连锁分析,在COL1A1遗传位点发现紧密连锁(LOD=9．31;θ=.00)。突变检测发现在COL1A1基因第26内含子5′端剪接位点处存在一由GT转换为AT的致病突变,该突变引起的异常剪接是导致成骨不全的致病原因之一。     

基于Oncomine数据库探究COL1A1基因在胰腺癌中的表达及意义

[目的]探究COL1A1基因在胰腺癌中的表达及临床意义。[方法]收集Oncomine和NCBI/GEO Profiles数据库中关于COL1A1的信息,对目前数据库中资料再次进行分析,并对其在胰腺癌组织和正常胰腺组织中的表达进行荟萃分析,使用Kaplan-Meier Plotter在线数据库分析该基因是否与胰腺癌患者的预后相关。[结果]Oncomine数据库中共收集了400项不同类型的研究。其中COL1A1高表达有86项研究,低表达有6项研究。共有8项研究涉及COL1A1在胰腺癌组织与正常组织中的表达,包括209例样本,与正常组织相比,COL1A1在胰腺癌组织中高表达(P<0.05)。NCBI/GEO Profiles数据库分析发现TGF-β处理48 h后COL1A1表达升高。Kaplan-Meier Plotter数据库分析表明COL1A1高、低表达组胰腺癌患者的总体生存率(OS)无统计学差异(HR=1.4,95%CI:0.92~2.12,P=0.11),但高表达组胰腺癌患者的无复发生存(RFS)明显差于低表达组(HR=5.05,95%CI:1.48~17.24,P=0.0044)。[结论]COL1A1基因在胰腺癌组织中的表达明显高于正常组织,低表达患者的RFS延长。可见靶向COL1A1的药物有望改善胰腺癌患者的预后。     

人皮肤成纤维细胞中α1(Ⅰ)前胶原基因转录调控研究

为寻找纤维化形成中调控人Ⅰ型前胶原基因高水平转录的启动序列及其DNA结合蛋白 ,以人皮肤成纤维细胞α1(Ⅰ )前胶原基因转录起始点上游 - 2 5kb至 + 4 2bp的片段为靶序列 ,采用PCR、基因重组、报告基因测活、细胞基因转染技术比较不同长短启动子活性 .凝胶滞留实验 (EM SA)研究高启动活性片段相应的DNA结合蛋白 .基因转染高活性转录因子识别序列至靶细胞 ,探讨前胶原基因激活阻断的新手段 .结果表明 ,- 2 4 83～ + 4 2bp、 - 2 6 8～ + 4 2bp序列具有强启动调控活性 ,而 - 10 5～ + 4 2bp片段启动活性最低 .EMSA对高启动活性小片段DNA结合蛋白的分析提示 ,- 2 6 8～ + 4 2bp序列中存在转录因子Ap 1、Sp 1、NF 1的特异结合位点 .转染高活性转录因子识别序列Ap 1、Sp 1至靶细胞可竞争性阻断胶原基因启动转录激活 .研究提示 ,人α1(Ⅰ )前胶原基因 - 2 4 83～ + 4 2bp、 - 2 6 8～ + 4 2bp片段有高启动活性 .转录因子Ap 1、Sp 1、NF 1与 - 2 6 8～ + 4 2bp序列中相应识别序列的结合与其基础高转录活性有关 .转染高活性转录因子识别序列Ap 1、Sp 1可从转录水平阻断胶原基因的激活     

回转模拟失重对心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原代谢的影响

为探讨模拟失重对心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原代谢的影响 ,本研究采用回转器模拟失重效应 ,通过免疫细胞化学和反转录聚合酶链式反应 (RT PCR)研究了回转模拟失重对原代培养的新生大鼠心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白及mRNA表达 ,以及胶原降解抑制物———金属蛋白酶组织抑制因子 (Tissueinhibitorofmetallopro teinase ,TIMP)mRNA表达的影响。免疫细胞化学染色显示回转组Ⅰ型胶原蛋白沉积增加 ;RT PCR分析显示Ⅰ型胶原α1链 (TypeⅠcollagenα1chain ,ColⅠA1)mRNA表达没有明显变化 ,TIMP 1、TIMP 2及TIMP 3的mRNA表达均增强。提示在回转模拟失重条件下 ,心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白沉积增加 ,作为胶原降解抑制物的TIMP可能是造成胶原沉积的原因     

人FXR基因5′调控区功能分析

为研究人法尼酯衍生物X受体（FXR）基因5′调控区的功能,在对人FXR基因进行生物信息学分析的基础上,用5′RACE法确定该基因的转录起始位点碱基是A.采用PCR技术,扩增人基因组DNA中FXR基因5′上游序列,构建了5种含不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达体系.将它们瞬时转染HepG2细胞,检测其荧光素酶活性.结果表明,－1　651～+200、－1　496～+200区域的启动子活性无明显区别,－847～+200区域的启动子活性最高,－544～+200区域启动子活性较前显著降低.研究提示,FXR基因转录所必需的基因启动子序列在－847～－544范围内.     

内含子数量改变GUS基因的瞬时表达调控

内含子是基因的重要组成部分,它与功能基因表达之间的关系越来越被重视.本研究以pCAMBIA3301为载体,利用玉米泛素启动子Ubi1和水稻肌动蛋白启动子Actin1构建两个GUS基因表达载体p33U1和p33A1,同时设置3个对照载体.通过基因枪轰击法将上述载体转入水稻胚性愈伤组织,探讨内含子对外源目的基因表达的调控作用.组织化学检测结果表明:CaMV35S启动子调控下的iGUS (带内含子)基因能够顺利表达;同样,Actin1启动子(带内含子)调控下的不带内含子的GUS基因也可以正常表达,而当Actin1启动子(带内含子)驱动iGUS基因时,则导致GUS染色反应不能发生.Ubi1启动子(带内含子)调控GUS基因的瞬时表达也得出类似结果,证明表达框中内含子的数量为1个或两个时,对GUS基因的表达起到了不同的调控作用.本研究结果对植物表达载体构建及功能基因表达都具有指导意义.     

Ⅰ型胶原基因启动子研究进展

Ⅰ型胶原由α1（Ⅰ）链（COL1A1）与α2（Ⅰ）链（COL1A2）组成,人COL1A1与COL1A2基因的启动子都已鉴定并克隆。调节转录的核因子有Sp1、NE－1、AP－1、CBF、NF－κB、C－myb、c-Krox、BFCOL1、Zf9、Sp3、Smads、TGP、Egr-1、TWIST与NP／NMP4等。在COL1A1和／或COL1A2基因启动子上已鉴定出TGFβ、糖皮质激素、TNFα、IFNγ与视黄酸等的应答元件。     

人SCF基因5′旁侧-1190～- 853 AT富集区功能研究

 已有的报告基因和EMSA实验研究表明 ,人干细胞生长因子 (SCF)基因 5′旁侧AT富集区- 1 1 90～ - 853在HeLa和MCF 7细胞中均能增强下游基因转录 ,可能为一个核基质结合区(MAR) ,对人SCF基因的转录发挥调控作用 .为进一步研究该AT富集区的功能 ,将人SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853AT富集区分别克隆入SV40或CMV启动子前后紧接着CAT报告基因 ,瞬时转染Jurkat,HepG2和 3T3细胞 ,检测CAT报告基因的瞬时表达活性 .结果表明 :人SCF基因 5′旁侧- 1 1 90～ - 853AT富集区在Jurkat和HepG2细胞中 ,对分别由SV40和CMV启动子引导的CAT基因表达均有抑制作用 ;但在 3T3细胞中对SV40启动子的转录活性表现出增强作用 ,对CMV启动子的转录活性无明显影响 .这些结果提示 ,人SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853AT富集区转录调控具有组织细胞特异性 ,在不同的细胞中可能发挥转录增强或抑制作用     

淫羊藿素促进BMSCs成软骨分化的研究北大核心CSCD

研究淫羊藿素在GDF-5诱导BMSCs成软骨分化过程中的作用。全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),取P3代细胞随机分成4组:对照组,淫羊藿素(Icaritin)组,Growth differentiation factor 5(GDF-5)组,Icaritin+GDF-5联合组。连续诱导培养14 d,倒置相差显微镜观察细胞形态,Alcian Blue染色检测细胞的蛋白聚糖改变,RT-PCR检测软骨分化标记基因Aggrecan、COL2、Sox9及COL1的表达情况,Western Blot检测COL2和COL1蛋白表达水平。结果提示,与对照组及GDF-5组相比,Icaritin+GDF-5联合组蛋白聚糖染色更深;软骨分化标记基因Aggrecan、COL2、Sox9明显增加;Ⅱ型胶原蛋白表达量均明显增加。淫羊藿素能够促进GDF-5诱导BMSCs成软骨分化。     

Ad-Ang1-IRES-VEGF165腺病毒载体的构建及其促血管形成作用

目的:构建人血管生成素1(Ang1)和血管内皮生长因子VEGF165 (VEGF165)的共表达腺病毒载体Ad-Ang1-IRES-VEGF165(简称Ad-AV),为研究Ad-AV转基因细胞表达产物血管诱生活性提供实验依据。方法:采用IRES介导的Ang1和VEGF165双基因腺病毒共表达模式,通过常规的基因克隆和重组技术,构建Ad-AV双基因共表达腺病毒载体,经感染人胚肾QBI-293A细胞(293A)进行扩增和效价测定后,再感染WI-38人胚肺成纤维细胞,均用ELISA法检测VEGF、Ang1目的基因的表达,并采用鸡胚尿囊膜血管形成实验(CAM)法分析其对血管形成的影响。结果: 扩增的Ad-AV腺病毒效价可达4×10¹⁰pfu/ml;Ad-AV不仅能在293A细胞中成功表达目的基因Ang1、VEGF,而且在WI-38成纤维细胞也能成功表达,其表达产物具有显著的促进CAM上血管生成的活性。结论:成功构建并获得了Ad-Ang1-IRES-VEGF165重组病毒子, 目的基因均能在人胚肾和人胚肺成纤维细胞中表达,其表达产物具有诱导血管形成的功能。     

灰葡萄孢菌AUR1基因内含子对肌醇磷脂酰神经酰胺合成酶表达的影响及致病性

【目的】AUR1编码的肌醇磷脂酰神经酰胺(IPC)合成酶是真菌鞘脂代谢的关键酶,在转录水平和翻译水平研究AUR1内含子对其基因表达的影响,以及AUR1内含子对相关致病因子的影响,为内含子调控基因表达的分子机制提供理论依据。【方法】实时定量PCR测定野生型灰葡萄孢菌(BcAUR1)和AUR1缺失115 bp内含子突变体(BcAUR1a)的mRNA表达量,高效液相层析测定IPC合成酶活性,分别采用辣根过氧化物酶法、邻苯三酚自氧化法、愈创木酚法和紫外分光光度法测定单位菌体的H2O2含量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的酶活力。【结果】突变体BcAUR1a的IPC合成酶基因cDNA测序结果表明,IPC合成酶无氨基酸突变。实时定量PCR和高效液相层析的结果表明BcAUR1a的AUR1基因mRNA表达量和IPC合成酶活力比野生型BcAUR1分别增加了50.2%和14.16%。短梗霉素A(AbA)显著刺激BcAUR1 H2O2、SOD、POD和CAT的分泌,但对BcAUR1a的这几种物质的分泌无显著影响。【结论】突变体BcAUR1a的AUR1基因在转录和翻译水平上表达上调,AbA显著增强野生型灰葡萄孢菌致病力,但对突变体影响较小。突变体产生了对AbA的抗性,推测AUR1基因内含子在AUR1基因表达调控中起转录抑制子的作用。     

淫羊藿素促进BMSCs成软骨分化的研究

研究淫羊藿素在GDF-5诱导BMSCs成软骨分化过程中的作用。全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),取P3代细胞随机分成4组:对照组,淫羊藿素(Icaritin)组,Growth differentiation factor 5(GDF-5)组,Icaritin+GDF-5联合组。连续诱导培养14 d,倒置相差显微镜观察细胞形态,Alcian Blue染色检测细胞的蛋白聚糖改变,RT-PCR检测软骨分化标记基因Aggrecan、COL2、Sox9及COL1的表达情况,Western Blot检测COL2和COL1蛋白表达水平。结果提示,与对照组及GDF-5组相比,Icaritin+GDF-5联合组蛋白聚糖染色更深;软骨分化标记基因Aggrecan、COL2、Sox9明显增加;Ⅱ型胶原蛋白表达量均明显增加。淫羊藿素能够促进GDF-5诱导BMSCs成软骨分化。     

不同方向内含子对重组CHO细胞中神经生长因子表达的影响

为了研究不同方向的嵌合体内含子对重组神经生长因子 (Nerve growth factor,NGF) 基因表达的影响,以人β-珠蛋白第一内含子5?端剪接序列和人免疫球蛋白重链可变区内含子3?端剪接序列组合而成的嵌合体内含子作为研究对象,在NGF基因5?端插入不同方向的嵌合体内含子,构建含不同方向内含子的NGF基因表达载体。转染至CHO细胞后,G418筛选稳定转染的细胞,荧光定量PCR、ELISA和Western blotting检测不同载体NGF基因的表达情况。结果显示内含子可以大幅度提高NGF基因的表达,且正向内含子对NGF基因表达的增强作用无论是在mRNA水平还是在蛋白水平都要高于反向内含子。所以内含子能够提高外源NGF基因的表达,且内含子调控转基因表达具有方向性。     

抗癌药莪棱舌草Ⅱ号诱导人肺癌细胞凋亡的研究

通过运用流式细胞光度术检测细胞凋亡;运用细胞化学方法检测凋亡相关基因蛋白的表达以及Westernblotting分析等方法来研究抗癌药莪棱舌草Ⅱ号对人肺癌细胞(A549细胞)凋亡的诱导作用。结果表明药物能够诱导A549细胞发生凋亡,凋亡率近40%;药物作用可以使细胞中凋亡抑制基因bcl2表达减少,而凋亡促进基因Bax表达增加。提示诱导肿瘤细胞凋亡可能是莪棱舌草Ⅱ号抑杀肺癌细胞的机制之一。