中华蜜蜂蜂毒磷脂酶A_2基因在大肠杆菌中的表达(英文)

将中华蜜蜂蜂毒磷脂酶A2(AcPLA2)蛋白成熟肽编码区基因(405 bp)克隆至表达载体pETBlue-1,在大肠杆菌Tuner(DE3)plac I中诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,表达产物分子量为15kD,约占细菌总蛋白的4.6％;用意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A2(AmPLA2)纯品制备的兔源多克隆抗体为一抗作Western blot,表达产物显示类似于天然纯AmPLA2的特异性印迹,证实AcPLA2基因已在大肠杆菌中得到表达。     

蜂毒过敏原磷脂酶A2

蜂毒 (ｂｅｅｖｅｎｏｍ)是由工蜂毒腺和副腺分泌的、具有芳香气味的一种透明液体 ,贮藏在毒囊中 ,在蜜蜂蛰刺时由蛰针排出[1] 。蜂毒具有抗菌、消炎、镇痛、降血压、抗辐射、预防癌症等药理作用 ,可用于治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、神经痛等多种疑难杂症。目前世界上许多国家都已开展蜂针疗法 ,并有各种类型的蜂毒软膏和针剂生产。但由于蜂毒易使人产生过敏反应 ,致使蜂针疗法不能得到广泛推广。鉴于这一点 ,国内外许多学者对主要引起人类过敏的蜂毒组分———磷脂酶Ａ2 (ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＡ2 )进行了研究 ,并且取…     

意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A2基因在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达

利用Bac to Bac系统将意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A₂（AmPLA₂）基因cDNA克隆至转移载体pFastBacHTa中,得到pBacHT-AmPLA₂,再将其转化入含穿梭载体Bacmid的受体大肠杆菌DH10Bac中,通过转座作用,得到含AmPLA₂基因的重组病毒rBacmid-AmPLA₂的DNA。提取其基因组DNA,用脂质体介导转染粉纹夜蛾细胞Tn-5B1-4,得到重组病毒rACV-Bac-AmPLA₂。用此重组病毒感染Tn-5B1-4细胞, 在细胞中表达AmPLA₂。SDS-PAGE电泳结果显示,与6×His Tag融合表达的产物蛋白分子量约为18 kD左右,表达量约占细胞总蛋白的5.35%。Western blot印迹显示,融合表达产物能与意大利蜜蜂蜂毒AmPLA₂抗血清发生免疫反应。生物活性测定显示,含表达产物的细胞蛋白粗提物对底物蛋黄的酶活力约为6.13 μmol·min^-1·mg^-1。     

蜜蜂毒主要过敏原磷脂酶A_2研究概述

本文综述了国内外蜜蜂毒主要过敏原磷脂酶Ａ_２的研究进展,主要包括一般的蛋白质特性、作用机制、免疫学及生物学作用等。     

EXPRESSION OF A BEE-VENOM PHOSPHOLIPASE A2 FROM APIS CERANA CERANA IN E,.qCHERICHIA COLI

The venomous phospholipase A2 (AcPLA2) coding reading region of the Chinese honeybee (Apis cerana cerana), which is composed of 405 bp encoding a mature glycosylated peptide with 134 amino residues was transformed into the expression vector pETblue-1. Then the recombinant vector was introduced into Escherichia coli Tuner (DE3) plac I for expression. Analysis result of SDS-PAGE showed that the expression products had a protein band of about 15 kD. Detection of western blot using ant-European honeybee (Apis mellifera) phospholipase A2 (AmPLA2) polyclonal serum as the first antibody showed that the expression products appeared a special blot same as the native AmPLA2.The result demonstrated that the AcPLA2 peptide had been expressed in E. coli and the AcPLA2 has the similar antigenicity as the AmPLA2.     

中华蜜蜂蜂毒透明质酶基因的克隆与序列分析(英文)

从中华蜜蜂工蜂毒腺中快速抽提总RNA ,用RT PCR方法扩增得到该蜂毒的透明质酸酶 (AcHya)基因 ,其核苷酸序列全长为 1 1 6 4bp ,可编码 3 87个氨基酸残基 ,预计分子量为 42 .6kD。将所推导出的氨基酸序列与其它 6种透明质酸酶 (Hya)氨基酸序列比较 ,结果表明 ,AcHya与意大利蜜蜂Hya非常相似 ,具有91 %的同源性 ,与长黄胡蜂Hya、常见黄胡蜂Hya、、马蜂Hya、吸血沙蠓唾腺Hya、人精液PH2 0Hya的同源性分别为 5 4 %、5 2 %、46 %、2 7%和 2 0 %。同时根据氨基酸序列用GENETYX程序绘制了 7种Hya的分子系统树 ,并根据同源性比较分析了 7种Hya的保守性、结构与功能的关系     

中华蜜蜂和意大利蜜蜂蜂毒前溶血肽原蛋白cDNA的克隆与序列分析

分别从中华蜜蜂Apis cerana cerana和意大利蜜蜂Apis mellifera工蜂毒腺中抽提总RNA,通过RT-PCR方法扩增,各得到了蜂毒前溶血肽原蛋白的cDNA,再将扩增产物克隆到pGEM-Teasy载体上,进行测序和序列分析。结果表明,所扩增到的这两个片段长度均为213 bp,均为编码蜂毒前溶血肽原的cDNA,并分别推导出两者所编码的氨基酸序列。经序列比较,中华蜜蜂前溶血肽原与意大利蜜蜂、印度蜜蜂Apis cerana indica前溶血肽原的同源性都为97%。所报道的中华蜜蜂蜂毒前溶血肽原的核苷酸序列的GenBank登录号为AF487907。     

2种蜜蜂和3种胡蜂蜂毒前肥大细胞脱粒肽原基因的克隆及同源性分析

从中华蜜蜂、意大利蜜蜂、大胡蜂、墨胸胡蜂和亚非马蜂5种雌成蜂毒腺中快速抽提总RNA,用RT-PCR方法分别扩增各得到大小约为350bp的cDNA片段,进一步将这5个片段克隆入pGEMT-easy载体,进行测序和序列分析。结果表明：所扩增得到的5个片段长度均为341bp,均包含一个完整的开放阅读框和3′端未编码区的188bp核苷酸序列,证实为5种蜂的蜂毒前肥大细胞脱粒肽原的cDNA。经序列比较,意大利蜜蜂、中华蜜蜂、大胡蜂、墨胸胡蜂和亚非马蜂前肥大细胞脱粒肽原核苷酸序列彼此间的同源性都为90％以上。中华蜜蜂、大胡蜂、墨胸胡蜂和亚非马蜂与意大利蜜蜂的前肥大细胞脱粒肽原氨基酸序列的同源性分别为96％、100％、94％和98％。尽管大胡蜂和墨胸胡蜂与意大利蜜蜂属于不同的科,但它们的肥大细胞脱粒肽却完全相同,而中华蜜蜂与意大利蜜蜂属于同一个属,它们的肥大细胞脱粒肽却不相同。中华蜜蜂和亚非马蜂肥大细胞脱粒肽第5号位的氨基酸为精氨酸,替代了意大利蜜蜂5号位的半胱氨酸,该位置的半胱氨酸与19号位的半胱氨酸组成意大利蜜蜂肥大细胞脱粒肽分子的一个对蛋白活性起重要作用的二硫键。     

蜂毒疗法和蜂毒针刺疗法现状分析

近年来,蜂毒疗法已日益引起世界各国生物医药界的关注。现将《美国蜜蜂杂志》近期刊载的德国吉森大学的科学家Karsten Münstedt以及英国埃克塞特大学和普利茅斯大学的科学家Katja Schmidt等有关蜂毒疗法和蜂毒针刺疗法现状的论述,译介于下。     

广东眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2的分离纯化及抗血小板聚集作用

目的 研究眼镜王蛇毒中酸性磷酸脂酶Ａ２对血小板的作用。方法 采用ＣＭ－Ｓｅｐｈａｄｅｓｘ Ｃ－２５Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５,ＤＥＡＥ－Ｓｅｐ「ｈａｄｅｘＡ－２５,Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５多步柱层析法,聚丙烯酰胺产胶电泳,酸性磷脂酶Ａ２酶活性测定;血小板聚集实验。累进要从粗中分离纯化出一酸性磷脂酶Ａ２单体,分子量为１４ＫＤ;等电点ＰＩ３．８;ＰＬＡ２比值２０μｍｏｌ．ｍｇ＾－１．ｍｉｎ＾－１;小     

短尾蝮蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及抗血小板聚集作用

目的研究短尾蝮蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及其抗血小板聚集作用。方法磷脂酶A2的分离纯化采用CM-SephadexC-25、DEAE-SepharoseCL-6B、SephacrylS-200、SephadexG-75柱层析法,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其蛋白分子质量,以磷脂酶Az测定方法测定其酶活性,用比浊法测定其对二磷酸腺苷（ADP）引起的血小板聚集的影响。结果从短尾蝮蛇毒中纯化所得磷脂酶A2的相对分子质量为16．0×10^3（非还原）、17．6×10^3（还原）,它具有磷脂酶A2活性,能明显抑制ADP引起的血小板聚集并呈剂量-效应关系。结论此方法成功地从短尾蝮蛇毒中分离纯化出磷脂酶A2,并能抑制血小板聚集。     

虎纹捕鸟蛛毒液中透明质酸酶的纯化和部分性质的研究

用分子筛（岛津ＤＩＯＬ－１５０柱）和阳离子交换（岛津ＷＣＸ－１柱）高效液相色谱从虎纹捕鸟蛛（Ｓｅｌｅｎｏｃｏｓｍｉａｈｕｗｅｎａ）毒液中分离提纯透明质酸酶（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ,ＥＣ３．２．１．３５）．经等电聚焦电泳为一条带,ｐＩ＝７．２．经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳测得分子量为４０ｋＤ,经凝胶过滤测得分子量为４０．７ｋＤ。以透明质酸为底物时在ｐＨ３．５─５．５范围内有较大活性,最适ｐＨ值为４．０;在ｐＨ４．５─６．０范围内稳定,在反应温度为３０─６０℃时有较大活性,最适温度为５０℃;对热稳定,０．１５ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ对酶活性有一定的稳定作用．３％的肝素、５００μｍｏｌ／Ｌ的Ｈｇ~（２＋）、Ｆｅ~（２＋）、Ｃｕ~（２＋）对酶活性有明显的抑制作用。     

Bimodal regulatory effect of melittin and phospholipase A2-activating protein on human type II secretory phospholipase A2

Melittin and phospholipase A2-activating protein (PLAP) are known as efficient activators of secretory phospholipase A2(sPLA2) types I, II, and III when phospholipid liposomes are used as substrate. The present study demonstrates that both peptides can either inhibit or activate sPLA2 depending on the peptide/phospholipid ratio when erythrocyte membranes serve as a biologically relevant substrate. Low concentrations of melittin and PLAP were observed to inhibit sPLA2-triggered release of fatty acids from erythrocyte membranes. The inhibition was reversed at melittin concentrations above 1 microM. PLAP-induced inhibition of sPLA2 persisted steadily throughout the used concentration range (0-150 nM). The two peptides induced a dose-dependent activation of sPLA2 at low concentrations, followed by inhibition when model membranes were used as substrate. This opposite modulatory effect on biological membranes and model membranes is discussed with respect to different mechanisms the interaction of the regulatory peptides with the enzyme molecules and the substrate vesicles.     

五步蛇蛇毒磷脂酶A_2的纯化及部分性质

经Sephadex G-75和QAE-Sephadex A-50离子交换层析等方法,从湖南产五步蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒中纯化一种均一的酸性磷脂酶A_2。SDS-PAGE测得分子量为15.8kD,按氨基酸残基计算其分子量为14.352kD,IEF-PAGE测得等电点为5.32。氨基酸组份分析表明磷脂酶A_2分子由128个氨基酸残基组成,富含Asp和Glu,不含中性糖。PLA_2酶活性的最适温度为45℃,最适pH为8.5左右,没有抗胰蛋白酶的活性,具一定的热稳定性。K~+、Ca~(++)和Na~+离子激活,而Cd~(++)、Sn~(++)、Cu~(++)、Li~+、Hg(++)、Zn~(++)、Fe~(++)和Co~(++)离子可抑制或完全丧失酶活力。手工微量顺序分析测得PLA_2分子N-末端氨基酸为Leu。此酶对小白鼠的LD_(50)至少大于10mg/kg(ip)。     

广西眼镜蛇毒磷脂酶A2初步晶体学分析

广西眼镜蛇毒酸性磷脂酶A2具有抗凝血活性和溶血活性。采用悬滴气相扩散法,培养出该酶四方和立方两种晶型的单晶,并进行了X射线衍射鉴定。四方晶型的空间群为P43212或P41212,晶胞参数为α=b=8.797nm,c=10.831nm。每不对称单位中含3个分子;立方晶型的空间群为P213,晶胞参数为a=b=c=6.840nm,其不对称单位含1个分子,对两种晶型分别收集了0.28nm分辨率衍射数据。对不同地域眼镜蛇毒磷脂酶A2的晶体特性进行了比较。     

一种新的烙铁头蛇毒肌肉毒素

用分子筛和快速蛋白质液相色谱从烙铁头（ＴＲｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ ｍｕｃｒｏｓｑｕａｍａｔｕｓ）蛇毒中分离了一个新的碱性肌肉毒素,命名为ＴＭＰＢ。它的分子量为１６０００,等电点为９．２．用蛋白质序列仪测定了其Ｎ端２４个氨基酸残基,ＴＭＰＢ与其他两个从同种蛇毒中分离到的碱性磷酯酶Ａ２的同源性分别为４１．７％和５４．２％《     

江浙蝮蛇毒磷脂酶A2的结构模建与分析

我们用同源模建方法构建了江浙蝮蛇毒碱性－酸性杂合磷脂酶Ａ２－Ⅱ和中性磷脂酶Ａ２的三维结构,并对它们的结构特征做了比较分析。在此基础上,我们在三维结构水平上解释了磷脂酶Ａ２荧光光谱学研究的一些结果。我们还对四种江浙蝮蛇毒磷脂酶Ａ２的酶活性部位的静电势分布做了分析。我们认为：含钙的ＰＬＡ２酶活性部位周围的静电势有利于ＰＬＡ２与带负电荷的底物结合。     

Immunological properties of notexin, a potent presynaptic and myotoxic component from venom of the Australian tiger snake Notechis scutatus scutatus

Neutralizing antibodies were raised in mice against notexin, the most toxic phospholipase A₂ (PLA₂) from Notechis scutatus scutatus venom, without the necessity of detoxifying the toxin prior to immunization. Using a sensitive radioimmunoassay we demonstrated that anti-notexin antibodies recognized (i) the parent antigen, (ii) closely related isoforms of notexin and (iii) venoms from Notechis genus snakes. In contrast, they failed to recognize other purified PLA₂ or PLA₂-containing venoms from other origins. Substitutions or chemical modifications occurring in the C-terminal part of the polypeptide chain of notexin altered the binding affinity for antibodies, implying that this region constitutes an antigenic domain of notexin.     

广西眼镜王蛇毒碱性磷脂酶A_2(PLA_2)的分离纯化及其性质的研究

广西眼镜王蛇毒用羧甲基纤维素CM-52、磷酸纤维素P-11和Sepharose CL-6B柱层析纯化,得到一个在聚丙烯酰胺凝胶电泳上为单一蛋白带,PLA_2的比活性较原蛇毒提高3.6倍,分子量的为13000,由122个氨基酸组成,_pI为8.9,具有良好的热稳定性。从碱性PLA_2对红细胞影响的电镜观察可见,对人的红细胞膜有明显的作用,而对山羊红细胞作用不明显。PLA_2无论对人还是对山羊、兔和豚鼠红细胞电泳速度都有明显的迟缓作用。