体细胞克隆牛产品安全分析

体细胞克隆技术是将已分化的体细胞移到去核的成熟卵母细胞中,通过体外激活和培养,再移植入受体母畜子宫内,繁殖出具有相同基因型后代的一种技术。该技术可以大幅提升繁殖效率,并提供高质、充足和营养丰富的动物食品。近年来,美国、日本和欧洲等国家相继宣布体细胞克隆动物食品可以上市。然而,目前体细胞克隆效率相当低下,即使是出生的克隆动物也往往伴随发育畸形或高死亡率等现象,在对克隆动物发育异常知之甚少的情况下,宣布克隆动物产品上市是否为时过早?以下综述了克隆牛肉、奶及其产品安全。     

我国首个体细胞克隆牛胚胎移植中心成立

,中国农业大学和芦台经济技术开发区日前签署协议,中国第1个体细胞克隆牛胚胎移植中心在唐山正式成立。据了解,早在2001年,中国农业大学就和芦台经济技术开发区合作,建立了生物技术实验基地。第2年4月,中国第1头地方优质奶牛在芦台经济技术开发区诞生。此后,在这个开发区又陆续培育出5头体细胞克隆优质奶牛。今年又培育出具有世界最新药物蛋白基因的两头克隆奶牛。目前,芦台经济技术开发区的克隆牛成活率处于我国领先水平。此次成立的我国第1个体细胞克隆牛胚胎移植中心将成为华北地区克隆奶牛繁育基地和生物工程服务中心。摘自《科学时报》…     

Mash2基因在体细胞克隆牛肺脏中DNA甲基化状态分析

体细胞核移植(体细胞克隆)技术在动物生产、医药工业、治疗性克隆以及对珍稀濒危动物的拯救有重要意义,然而克隆效率低下以及克隆动物发育异常,严重制约了克隆技术的发展和应用．在体细胞核克隆中,供体核来自高度分化了的体细胞,发生在核移植后几小时内供体核的重编程,决定了克隆胚胎的发育能力．印记基因是由等位基因表观遗传修饰的不对称导致的基因表达具有亲本选择性,而DNA甲基化是调控印记的一个主要方式．印记基因Mash2在胚胎发育和器官形成过程中起着非常重要的作用．为了探求核移植过程中Mash2基因DNA 甲基化的表观重编程是否充分,利用亚硫酸氢盐测序法对出生48 h内死亡的体细胞核移植牛和正常对照牛肺脏中Mash2基因的DNA甲基化状态进行分析．结果显示,尽管位于Mash2基因启动子和第一个外显子处的CpG岛在正常牛和克隆牛中甲基化水平都不高(20.04%,5.55%),但克隆组的甲基化水平仍显著低于正常对照组 (P < 0.05)．甲基化模式正常组中9N3有5种不同的形式,9N4仅1种;而克隆组9C3和9C5也分别是1种．推测Mash2基因的异常DNA甲基化很可能是导致克隆牛肺脏发育异常的一个重要原因．     

哺乳动物体细胞克隆技术的研究进展

尽管与已有十几年发展史的哺乳动物胚胎细胞克隆技术相比,其体细胞克隆技术的研究仅有不到三年的时间;然而,鉴于哺乳动物体细胞克隆技术在供核效率等方面所具备的明显优势,其应用价值远高于胚胎细胞克隆技术。随着对哺乳动物体细胞克隆技术基本机理的进一步广泛深入的研究,它将在大量克隆优良种畜、扩大同基因型实验动物种群、培育转基因动物和保护濒危野生动物遗传资源等方面发挥巨大作用。     

哺乳动物体细胞克隆技术的研究进展

尽管与已有十几年发展史的哺乳动物胚胎细胞克隆技术相比,其体细胞克隆技术的研究仅有不到三年的时间;然而,鉴于哺乳动物体细胞克隆技术在供核效率等方面所具备的明显优势,其应用价值远高于胚胎细胞克隆技术。随着对哺乳动物体细胞克隆技术基本机理的进一步广泛深入的研究,它将在大量克隆优良种畜、扩大同基因型实验动物种群、培育转基因动物和保护濒危野生动物遗传资源等方面发挥巨大作用。     

牛体细胞克隆胚胎类ES细胞集落的筛选及其核移植

对第7d的牛体细胞克隆囊胚进行体外增殖培养,分离筛选类ES细胞,并对其进行了传代培养,接种在饲养层上的体细胞克隆囊胚细胞,在传代的24h内增殖形成小集落,2～3d有雀巢状的集落出现,筛选形态相同的细胞集落进行传代培养,4～5代后,皿底出现多个大小不等的多细胞单层集落,将传4～5代的细胞集落接种到无饲养层的4孔培养皿中培养,24h出现多细胞单层集落,4～7d长满皿底,并形成上皮样细胞,呈网状,将其作为核供体细胞进行核移植实验。结果有80%（40/50）核-质融合的移核重构胚发生卵裂,5%（2/40）发育至桑椹胚期,2.5%（1/40）发育至囊胚期,92.5%（37/40）停止在2～4细胞期,结果表明：采用牛体细胞克隆胚胎的类ES细胞进行核移植,具发育形成早期胚胎的潜能。     

体细胞克隆猪的研究进展

哺乳动物克隆不仅可以保护濒危动物 ,而且与干细胞工程技术相结合能应用于克隆性治疗 ,是目前生物技术领域研究的热点之一 ,具有重大的科学意义和应用价值。由于体细胞克隆猪在人类器官移植方面具有巨大的应用潜力 ,已成为当今体细胞克隆研究的热点。从 2 0 0 0年开始 ,在不同国家相继诞生了体细胞克隆猪及转基因猪 ,但是其成功效率很低 ( 1 %～ 2 % )。主要综述了影响体细胞克隆猪的几个因素 ,涉及胞质受体、供核细胞、显微操作、激活以及重组胚移植     

供体细胞的选择与动物克隆效率研究进展

哺乳动物体细胞克隆经过几年的发展,已取得了很大进展.已有多种细胞被采用并得到了克隆后代.但动物克隆效率仍然很低,供体细胞的选择是动物克隆中的重要步骤.供体细胞的细胞周期、细胞类型、细胞来源和分化程度等方面都可能影响动物克隆的效率.     

哺乳动物体细胞克隆遗传物质的检测

随着哺乳动物克隆研究的开展以及体细胞克隆动物的相继诞生 ,克隆动物及其早期胚胎的遗传物质检测研究也越来越显得重要。从染色体分析、核DNA分析、线粒体DNA分析和端粒DNA分析四个方面简要介绍了哺乳动物体细胞克隆遗传物质检测研究的进展。     

哺乳动物体细胞克隆及在动物转基因中的应用

哺乳动物体细胞克隆及转基因技术,近些年发展迅速。尤其1997年‘多利’羊的诞生,对推动哺乳动物克隆及转基因技术的发展具有里程碑式的意义。本文介绍了哺乳动物体细胞克隆的方法,存在的问题和体细胞克隆的机理研究。对这些方法和研究理论进行了讨论,并探讨如何利用克隆技术进行转基因动物的制备。     

影响小鼠体细胞脂质体法转染效率的因素

We studied the effects of the amount of liposome and plasmid, exposure time of cells to the liposome-plasmid complexes, number of cell passages and cell types on GFP gene transfection of mouse somatic cells. The maximal GFP transgene expression (30.7%) was achieved when mouse fetal fibroblast cells (MFFC) at 70%-90% confluence of passage 3 were exposed for 6 h to the complexes of 4 microg liposome (LipofectAMINE) and 0.3 microg plasmid (pEGFP-N1). Under these conditions, we compared the effect of the number (from primary to 15) of passages on the transfection efficiency of MFFC. The transfection efficiency of MFFC was 10.0%, 28.9% and 7.2% at the primary, 3rd and 15th passage, respectively, which indicated that the transfection efficiency decreased with passaging. When MFFC, mouse oviductal epithelial cells (MOEC) and mouse granulosa cells (MGC) were transfected at passage 3, the transfection efficiency was 27.8%, 13.7% and 14.2%, respectively, under the described transfection conditions. When the cell cycle stages of different cell types at transfection were examined, it was found that 17.2% of MFFC, 8.7% of MOEC and 9.9% of MGC were at M phases of the cell cycle. Examination of the cell cycle stages of MFFC at different passages showed that MFFC at the third passage had the highest percentage of M cells and the percentage decreased afterwards. This suggested that the transfection efficiency was correlated with the percentages of cells at M phase, and provided essential data for improvement of the transfection efficiency.     

用RACE技术扩增并克隆牛BMP4基因3'端序列

RACE技术是一项扩增基因末端序列的新技术。该研究从牛BMP4基因出发,以牛软骨的RNA为模板,按照不同物种BMP4基因的相似性设计特异引物,运用PCR和RACE技术扩增并获得了特异片段,该片段经PCR、酶切和测序验证,证实所克隆序列为牛BMP4的3′端序列,包含有1170bp组成的开放读码框(ORF),编码389个氨基酸,3′非编码区121bp个核苷酸和poly(A)15。同源性分析结果表明,牛BMP4 cDNA最大开放读码框所推测的氨基酸序列与已知人、小鼠、大鼠、狗、羊和鸡等真核生物BMP4氨基酸序列进行比较,分别有94.5%、93.1%、91.9%、87.4%、94.2%、79%的同源性。这为克隆其他物种的BMP4基因提供了依据,同时牛骨形态发生蛋白的测序为我们更好的理解牛的生骨机理提供帮助。     

小鼠-牛体细胞种间核移植

本文探讨了小鼠-牛异质胚构建的简便方法及小鼠体细胞核在牛卵母细胞中重新编程的可能性。以牛的卵母细胞为细胞质供体,用去除透明带及徒手切割的方法去核,设定电压1.5 KV/cm,脉冲时间40μsec,与小鼠皮肤成纤维细胞进行电融合的融合率为67.44%,卵裂率为30.23%。融合细胞经离子酶素-6-DMAP激活,用微滴内压制做窝的方法培养小鼠皮肤成纤维细胞异质胚,异质胚的最终发育阶段为8细胞期。结果表明,去透明带牛卵母细胞经切割法去核,可用于小鼠异质胚构建;微滴内做窝的体外培养方法可避免无透明带胚胎的聚合。     

脱落酸对黄连体细胞胚胎发育的影响

用ＨＰＬＣ法测得黄连体细胞胚的内源ＡＢＡ含量,在胚性细胞团、球形胚、鱼雷形胚和子叶胚中分别为０．４５２、０．４６１、０．８３１和２．５０μｇ／ｇ ｆｒ．ｗｔ。培养基中加入４μｍｏｌ／Ｌ ＡＢ时,可最大幅度地提高正常子叶胚的和次生胚的产量,环己亚胺对体细胞胚（子叶胚）蛋白质合成的抑制率在含ＡＢＡ的培养基上显著高于不含ＡＢＡ的培养。由此推测,ＡＢＡ调节黄连体细胞胚发育的方式之一是诱导蛋白质合成。     

影响小鼠体细胞脂质体法转染效率的因素

本实验主要研究脂质体量、质粒量、细胞在脂质体-质粒复合物中暴露时间、细胞传代次数以及细胞种类对转基因效率的影响。首先研究了脂质体量、质粒量和细胞在脂质体-质粒复合物中暴露时间对小鼠胎儿成纤维细胞(MFFC)的绿色荧光蛋白(GFP)转染效率的影响。结果表明,在本实验条件下,用传至3代的MFFC,24孔培养板中每孔接种4-10×10~4个细胞,70%-90%贴满程度,当脂质体(LipofectAMINE)4μg、质粒(pEGFP-N1)0.3μg,复合物作用时间为6h时获得的转染效率最高, 为30.7%。用此方案比较不同传代次数的MFFC转染效率结果表明,原代细胞的转染效率为10.0%, 3代为28.9%,到15代降到7.2%。说明随着传代次数的增加,转染效率逐渐降低。将MFFC、小鼠输卵管上皮细胞(MOEC)和小鼠颗粒细胞(MGC)分别传至3代,采用上述方案进行转染,转染效率分别是27.8%、13.7%和14.2%。可见不同种类细胞的转染效率不同。细胞周期检测表明,无论是不同代次的细胞还是不同种类的细胞,其转染效率高低与M期所占比例的多少有关。这为如何提高转染效率提供了有利的依据。     

哺乳动物体细胞克隆技术的研究进展

哺乳动物体细胞克隆技术在动物育种及珍稀动物保护领域具有极其广阔的应用前景,但极低的成功率限制了这项技术的应用.相关学者从不同方面进行了研究,试图提高体细胞克隆技术的成功率.综述了近年来哺乳动物体细胞克隆技术的研究进展,为其相关研究提供必要的参考.     

体细胞起源的人胚胎干细胞

根据治疗性克隆假设,可以通过体细胞核移植技术获得与病人具同样基因型的细胞或组织。这样起源的细胞或组织植回病人将不会引起免疫排斥反应。本研究将5岁、42岁、52岁和60岁4个不同年龄的人体细胞核植入去核的兔卵母细胞中重新启动,发育至囊胚,并分离人胚胎干细胞。研究结果提示,年龄不影响体细胞被重新启动的效率。经过核型分析,同源染色体分析,原位杂交,PCR和免疫组化染色等多种鉴定,ntES细胞具有人染色体。ntES细胞可以长期增殖并保持不分化状态,也可以形成类胚体并分化出包括神经和肌肉在内的多种细胞类型。由类胚体诱导生成的混合细胞群体表达所有三个胚层(外、中、内胚层)细胞类型标记,说明ntES细胞具有分化成所有三个胚层的潜力。因此,从人体细胞核获得的ntES细胞与普通人胚胎干细胞一样具有向多种细胞类型分化的能力。     

运用PRINS和体细胞杂种克隆板对猪新微卫星的定位

In this study, two new microsatellites HAU02 and HAU06, which are screened and cloned. HUA02 and HAU06 are repectively mapped in lq23-27 and 6q11-21 by means of PRINS (primed in situ labeling) and somatic cell hybrid (SCH) panel techniques, we discussed their advantage and disadvantage in gene mapping. These two means provide us more techniques in gene mapping, and the locations of these new microsatellites accumulate more resource for Porcine Physical Map.