呼吸道合胞病毒G蛋白基因片段的克隆及高效表达

呼吸道合胞病毒(RSV)感染遍布全球,并可导致严重的疾病,但目前尚无成功的疫苗问世。为寻求可能用于RSV疫苗研制的重组蛋白抗原,我们在克隆RSV-A全长G蛋白基因的基础上,构建了多种共表达载体蛋白和G蛋白片段的表达载体,并从中筛选出能以可溶形式高效表达抗原蛋白的原核表达体系。通过亲和层析纯化了重组蛋白抗原DsbA-G101,将其免疫Balb／c小鼠后获得了相应的抗血清。经ELISA检测表明DsbA-G101具有良好的免疫原性。基于本研究所构建的系列表达载体,可以比较不同的G蛋白片段免疫原性的强弱及载体蛋白的优劣,从中发现最佳的RSV抗原蛋白。     

呼吸道合胞病毒G蛋白的相关研究

呼吸道合胞病毒G蛋白介导病毒附着在宿主细胞表面,且具有亚型间抗原结构变异大的特点,其抗原变异推测是呼吸道合胞病毒逃避已存在免疫监视,引起反复感染的原因,了解G蛋白与免疫反应的关系对研制呼吸道合胞病毒亚单位疫苗,有效地防治该病毒感染具有重要意义。     

北京等四地区呼吸道合胞病毒分离株G蛋白基因的比较分析

为了解我国不同地区呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）感染特征是否与基因变异有关,对北京、广州、长春和河北四个地区不同流行特征中分离的ＲＳＶ毒株的Ｇ蛋白基因进行了序列分析。结果表明,该Ｇ蛋白基因同国外Ａ型亚原型株（Ａ２株）间存在显著差异,Ａ２株同分离株间的核苷酸同源性为９２．７－９３．６％,氨基酸同源性只有８８．３－８９．９％。分离株间的核苷酸同湃性为９６．０－９８．９％,氨基酸同源性９２．６－９７．７％。氨     

免疫A型呼吸道合胞病毒G75-225蛋白的小鼠对病毒感染的抗性

目的:评价A型呼吸道合胞病毒(RSV)G75-225蛋白(G151)与二硫键异构酶(DsbA)的重组蛋白抗原DsbA-G151的免疫活性。方法:采用PCR方法从A型RSVG蛋白扩增G151基因片段,插入表达载体pET-DsbA,经E.coli表达、亲和层析纯化制备DsbA-G151蛋白;将其免疫BALB/c小鼠后获得相应的抗血清,利用ELISA方法、保护性实验检测蛋白免疫活性。结果:构建了表达载体pET-DsbA-G151,表达、纯化获得了重组蛋白DsbA-G151。ELISA检测表明,DsbA-G151能在小鼠体内产生高滴度的特异性IgG;保护性实验显示该蛋白能有效保护BALB/c小鼠不被RSV感染。结论:经ELISA检测、保护性实验,表明DsbA-G151具有良好的免疫原性。     

呼吸道合胞病毒北京地区分离株G蛋白的基因分析

从经单克隆抗体证实为Ａ亚型的北京地区呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）分离株Ｂ７９中,用ＲＴ－ＰＣＲ扩增出编码Ｇ蛋白的基因片段,克隆至载体ｐＴＺ１８Ｒ中。经核苷酸序列测定证明,我国北京地区分离的Ａ亚型株Ｂ７９与ＲＳＶＡ亚型原型株（Ａ２株）Ｇ蛋白基因的核苷酸同源性为９３．８％,核苷酸的有义突变率达６５％。由核苷酸推导出氨基酸序列的同源性为８９．６％。氨基酸的变异主要集中在胞外区一个高度保守区的两端,而胞内区和跨膜区相对保守。本文探讨了我国北京地区ＲＳＶ分离株的Ｇ蛋白基因同原型株之间的变异,在疫苗研制中的意义。     

呼吸道合胞病毒在北京地区分离株G蛋白的基因分析

从经单克隆抗体证实为Ａ亚型的北京地区呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）分离株Ｂ７９中,用ＲＴ－ＰＣＲＴ扩增出编码Ｇ蛋白的基因片段,克隆至载体ｐＴＺ１８Ｒ中,经核苷酸序列测定证明,我国北京地区分离的Ａ亚型株Ｂ７９与ＲＳＶＡ亚型原型株（Ａ２株）Ｇ蛋白基因的核苷酸同源性为９３．８％,核苷酸的有义突变率为６５％,由核苷酸推导出氨基酸序列的同源性为８９．６％,氨基酸的变异主要集中在胞外区一个高度保守区的两端,而胞内区     

重组呼吸道合胞病毒G蛋白疫苗的免疫安全性研究

将呼吸道合胞病毒(respiratory syncytical virus,RSV)G蛋白与CpG佐剂共同免疫小鼠,分析RSV G蛋白免疫原性及安全性。前期纯化的G_(CX3C)和G_(CTL)两种蛋白分别与CpG佐剂混合,在0、2、4周以肌肉注射方式免疫昆明小鼠,免疫结束后检测小鼠肺部匀浆液中的IFN-γ、IL-4及Ig E等指标。同时末次免疫结束后,小鼠用滴度105pfu的RSV进行攻毒,解剖分离小鼠肺部,制备病理切片进行观察。G_(CTL)蛋白免疫组肺部匀浆液中的IL-4以及IgE低于G_(CX3C)蛋白免疫组。CpG组及GCTL+CpG组肺组织匀浆液中的INF-γ含量以及INF-γ/IL-4比值显著高于其他组(P0.05),且ELISPOT实验表明CpG佐剂能够促使分泌INF-γ的脾淋巴细胞数量增多。攻毒后,通过肺部组织切片观察,发现PBS和CpG免疫组肺部病变极为严重,G_(CTL)+CpG组的病变程度比G_(CX3C)+CpG组严重,而G_(CX3C)组的病变情况比G_(CTL)组严重。这些结果表明,重组G_(CTL)蛋白能够降低动物免疫应答的Th2型极化,具有良好的安全性。     

呼吸道合胞病毒B亚型分离株的G蛋白基因分析

对一株长春地区B亚型分离株(CC169)的G蛋白基因进行了 序列分析,结果表明：我国呼吸道合胞病毒(RSV)分离株CC169同RSV B亚型原型株CH18537的 核苷酸同源性为94%,核苷酸的有义突变率达65%。由核苷酸推导出氨基酸序列的同源性为894%,氨基酸的变异全部发生在胞外区,并主要集中在一个高度保守区的两端,胞内区和跨 膜区保守不变。氨基酸的变异导致了分离株既有糖基化位点的改变,又有蛋白长度的变异。 此外还初步探讨了我国RSV B 亚型分离株CC169的G蛋白基因同原型株之间的变异与疫苗研制 中的意义。     

基于融合蛋白的呼吸道合胞病毒疫苗的研究进展

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是一种引起严重下呼吸道感染的病原体,易感人群为婴幼儿、老年人及免疫功能低下者。目前尚无有效的抗病毒药物和预防疫苗。RSV融合蛋白(fusion protein,F蛋白)具有高度保守性,其诱导的抗体可同时抑制A型和B型两个亚型的RSV感染。因此,以F蛋白作为靶抗原的RSV亚单位疫苗、颗粒样疫苗和病毒载体疫苗是目前研究的主要策略。现就基于F蛋白的RSV疫苗研究进展作一综述。     

呼吸道合胞病毒疫苗研究进展

呼吸道合胞病毒(RSV)是引起严重下呼吸道感染的重要病原体,尽管经历了半个多世纪的努力,至今仍未有安全有效的RSV疫苗上市。近年来在RSV F蛋白结构生物学方面的研究进展为新一代RSV疫苗的开发提供了新方向,同时更多的采用不同技术、或针对不同人群的RSV侯选疫苗也在迅速发展,尤其是针对婴幼儿及老年人的RSV侯选苗已有60多种在研究中,大部分已处于临床前研究阶段,18种侯选苗已进入临床试验。我们简要介绍RSV疫苗的最新研究进展。     

武汉地区1988—1992年呼吸道合胞病毒流行株的抗原性分析

利用呼吸道合胞病毒的单克隆抗体,通过间接免疫荧光法和免疫转印法对本室分离到的武汉地区１９８８－１９９２年的５６份ＲＳＶ毒株进行了分型,可将其分为Ａ、Ｂ两型和Ｂ１、Ｂ２亚型,流行病学分析显示：本地区ＲＳＶ的主要流行株,四年中有三年为Ｂ型株。不同于欧美等地;Ａ、Ｂ两型的分布还具有灶化分布的特点;两型在性别、发病年龄之间无显著性差异。     

婴幼儿呼吸道合胞病毒感染的治疗

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus RSV)是引起婴幼儿毛细支气管炎最重要的病原体。其主要临床表现为喘息。部分患儿可出现反复喘息发作而发展为哮喘。对RSV感染尚无特效治疗药物,仍然以支持对症治疗为主,目前的研究热点是中西医结合治疗,反义基因治疗,高渗盐水雾化吸入治疗等。     

裸鼠呼吸道合胞病毒感染的动物模型

呼吸道合胞病毒(RSV)是全世界婴幼儿下呼吸道感染的首位病毒病原体,免疫缺陷个体容易发生严重感染,目前尚无理想RSV感染动物模型用于研究。我们用细胞免疫缺陷裸鼠感染RSV,旨在建立理想的动物模型,为RSV感染的防治研究奠定基础。裸鼠滴鼻感染RSV后肺组织分离到病毒,直接免疫荧光检测到支气管肺泡灌洗液RSV抗原阳性,空斑形成实验检测肺组织病毒滴度在感染后第3天达高峰,并持续到第9天仍能检测到病毒。免疫组化检测RSV抗原主要分布在细支气管、毛细支气管和肺泡上皮细胞胞浆内。肺组织病理学显示RSV感染导致裸鼠淋巴细胞浸润为主的肺间质性炎症,电镜分析超微结构可见到细胞内病毒颗粒和气血屏障的破坏。支气管肺泡灌洗液白细胞计数显示裸鼠RSV感染炎症高峰在感染后第9天。裸鼠RSV感染的病毒复制和病理改变特点与人相似,病毒持续高水平复制,是客观而实用的评价抗RSV制剂效果的小鼠模型。     

裸鼠呼吸道合胞病毒感染的动物模型

呼吸道合胞病毒(RSV)是全世界婴幼儿下呼吸道感染的首位病毒病原体,免疫缺陷个体容易发生严重感染,目前尚无理想RSV感染动物模型用于研究.我们用细胞免疫缺陷裸鼠感染RSV,旨在建立理想的动物模型,为RSV感染的防治研究奠定基础.裸鼠滴鼻感染RSV后肺组织分离到病毒,直接免疫荧光检测到支气管肺泡灌洗液RSV抗原阳性,空斑形成实验检测肺组织病毒滴度在感染后第3天达高峰,并持续到第9天仍能检测到病毒.免疫组化检测RSV抗原主要分布在细支气管、毛细支气管和肺泡上皮细胞胞浆内.肺组织病理学显示RSV感染导致裸鼠淋巴细胞浸润为主的肺间质性炎症,电镜分析超微结构可见到细胞内病毒颗粒和气血屏障的破坏.支气管肺泡灌洗液白细胞计数显示裸鼠RSV感染炎症高峰在感染后第9天.裸鼠RSV感染的病毒复制和病理改变特点与人相似,病毒持续高水平复制,是客观而实用的评价抗RSV制剂效果的小鼠模型.     

Dynamic Host Immune and Transcriptomic Responses to Respiratory Syncytial Virus Infection in a Vaccination-Challenge Mouse Model

Virologica Sinica - Respiratory syncytial virus (RSV) is the major cause of lower respiratory tract infections in children. Inactivated RSV vaccine was developed in the late 1960’s, but the...     

人呼吸道合胞病毒RNA聚合酶复合体蛋白N、P的表达鉴定

本研究根据编码A亚型人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,HRSV)核壳体蛋白(Nucleocapsid protein, N)和磷蛋白(phosphoprotein, P)的基因序列,各设计一对特异性的引物,应用RT-PCR技术,从感染HRSV的HEp-2细胞中扩增获得n和p的基因片断,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+).获得的重组质粒通过脂质体Lipofectamine 2000转染COS-7细胞,72 h后再用Western blot鉴定蛋白的表达.结果显示真核表达载体pcDNA3.1(+)/N和pcDNA3.1(+)/P的限制性内切酶分析结果与预期一致,基因序列分析显示没有发生无义突变,利用蛋白印记方法也检测到了N和P的特异性条带.于是我们认为成功构建了含有HRSV N和P编码基因的真核表达载体,在真核细胞内能顺利表达.为进一步开展HRSV反向遗传学等研究奠定了基础.     

人呼吸道合胞病毒RNA聚合酶复合体蛋白N、P的表达鉴定

本研究根据编码A亚型人呼吸道合胞病毒(HumanRespiratorySyncytialVirus,HRSV)核壳体蛋白(Nucleocapsidprotein,N)和磷蛋白(phosphoprotein,P)的基因序列,各设计一对特异性的引物,应用RT-PCR技术,从感染HRSV的HEp-2细胞中扩增获得n和p的基因片断,克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )。获得的重组质粒通过脂质体Lipofectamine2000转染COS-7细胞,72h后再用Westernblot鉴定蛋白的表达。结果显示真核表达载体pcDNA3.1( )/N和pcDNA3.1( )/P的限制性内切酶分析结果与预期一致,基因序列分析显示没有发生无义突变,利用蛋白印记方法也检测到了N和P的特异性条带。于是我们认为成功构建了含有HRSVN和P编码基因的真核表达载体,在真核细胞内能顺利表达。为进一步开展HRSV反向遗传学等研究奠定了基础。     

人呼吸道合胞病毒M蛋白非复制型重组腺病毒的构建和鉴定

人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus, RSV)基质蛋白（matrix protein,M）在RSV形态发生上具有重要作用,因含有CTL抗原表位,在疫苗研究上具有一定意义。为此,应用RT-PCR 方法从感染RSV的HEp-2 细胞中扩增获得M蛋白基因,构建了含M基因的非复制型重组腺病毒并进行表达和鉴定。基因序列分析显示RSV M基因仅有一处碱基发生错义突变。非复制型重组腺病毒DNA分子FGAd/RSVM转染293细胞,观察到细胞出现CPE,RT-PCR发现M基因有转录,Western blotting及间接免疫荧光分析检测到M蛋白。成功克隆A亚型RSV Long株M基因,并获得一株可表达A亚型RSV M蛋白的非复制型重组腺病毒FGAd/RSVM,可用于体内研究观察其免疫效果及免疫保护作用。