几种不同鹅膏菌毒素对真核生物RNA聚合酶Ⅱ抑制作用的比较研究

用鹅膏菌属含α－毒伞肽的毒素粗提液培养新鲜绿豆,结果在３６小时后,各种不同毒 的毒素粗提液培养的绿豆生长情况有明显不同,用紫外吸收法测定蛋白质含量,发现毒素粗提液培养的绿豆细胞中蛋白质含量比蒸馏水培养的有明显下降,这表明α－毒伞肽的作用机理确是通过抑制ＲＮＡ聚合酶Ⅱ而导致蛋白质合成减少。     

鹅膏毒肽与RNA聚合酶II相互作用的分子机制研究

研究鹅膏毒肽与RNA聚合酶II相互作用的分子机制,利用分子对接方法获得了9种鹅膏毒肽与RNA聚合酶II相互作用的结合模式、结合位点、对接能和抑制常数等信息,并对鹅膏毒肽的毒性与结构间的构效关系进行了考察。结果表明：利用分子对接方法获得的鹅膏毒肽与RNA聚合酶II相互作用的信息与实验结果相一致;不同R2取代基引起毒素与聚合酶II结合能力强弱不同,从而导致鹅膏毒肽分子间的毒性差异。结果证实了运用分子对接方法探索多肽分子与蛋白质相互作用的可行性,为在分子水平上研究多肽与蛋白质的相互作用开拓了新的思路。     

长白山鹅膏菌肽类毒素的HPLC分析

采用HPLC法对长白山地区分布的10种鹅膏菌中的-鹅膏毒肽(-amanitin)、鹅膏毒肽(-amanitin)和鬼笔毒肽(phalloidin)3种毒素的含量进行了测定。结果表明:白鹅膏(A.verna)和鳞柄白鹅膏(A.virsa)中含有-amanitin和-amanitin两种毒素,二者-amanitin的含量分别为 1861.85g/g和2477.02g/g,均高于欧洲产毒鹅膏(A.phalloides)中的含量(1607g/g)而接近灰花纹鹅膏Amanita fuliginea中的量(2633.80g/g)。毒鹅膏A.phalloides中含有3种毒素,并且菌蕾中的含量高于成熟子实体,尤其菌蕾中Phalloidin的含量(1113.35g/g)是灰花纹鹅膏成熟子实体中(432.5g/g)的3倍。     

黑鹅膏菌（Amanita fuliginea）毒素的HPLC初步分离鉴定

本文了用反相高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）分离黑鹅膏实体内几种鹅膏毒素的结果,采用Ｃ１８液相柱,以不同浓度的０．０２ｍｏｌ／Ｌ乙酸铵－乙腈混合液为流动相,从黑鹅膏子产体中分离并鉴定出了６种毒素,每公斤干重含量分别为（ｍｍｏｌ）：α－毒伞肽：５．１９ｍｍｏｌ;β－毒伞肽;１．１７ｍｍｏｌ;ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ;１．５ｍｍｏｌ;ｐｈａｌｌａｃｉｄｉｎ;０．４０ｍｍｏｌ;ｐｈａｌｌｉｓｉｎ;０．２６ｍｍｏｌ     

长白山鹅膏菌肽类毒素的HPLC分析*

采用HPLC法对长白山地区分布的10种鹅膏菌中的-鹅膏毒肽(-amanitin)、鹅膏毒肽(-amanitin)和鬼笔毒肽(phalloidin)3种毒素的含量进行了测定。结果表明:白鹅膏(A.verna)和鳞柄白鹅膏(A.virsa)中含有-amanitin和-amanitin两种毒素,二者-amanitin的含量分别为 1861.85g/g和2477.02g/g,均高于欧洲产毒鹅膏(A.phalloides)中的含量(1607g/g)而接近灰花纹鹅膏Amanita fuliginea中的量(2633.80g/g)。毒鹅膏A.phalloides中含有3种毒素,并且菌蕾中的含量高于成熟子实体,尤其菌蕾中Phalloidin的含量(1113.35g/g)是灰花纹鹅膏成熟子实体中(432.5g/g)的3倍。     

α-鹅膏毒肽与真核生物RNA聚合酶Ⅱ相互作用研究进展

鹅膏毒肽是我国蘑菇中毒事件中致死率最高的蘑菇毒素。鹅膏毒肽引起机体中毒的主要机制为鹅膏毒肽与真核生物RNA聚合酶Ⅱ (RNAP Ⅱ)特异性结合并抑制mRNA形成。本文系统整理了有关α-鹅膏毒肽与真核生物RNAP Ⅱ相互作用的国内外研究进展。由于同一时代各领域对该主题有不同研究角度,研究进展既有平行也有交叉,因此,本文将鹅膏毒肽与真核生物RNAP Ⅱ相互作用的110多年研究史(1907-至今)分为8个阶段,包括(1) 鹅膏毒肽的早期研究、(2) 化学结构解析、(3) 毒理学研究、(4) 构-效关系研究、(5) 生物化学研究、(6) 分子生物学研究、(7) 结构生物学研究和(8) 药物开发与评价。本文按以上顺序,分主题论述α-鹅膏毒肽与真核生物RNAP Ⅱ相互作用的研究历程和重要研究结果,以期给中毒和临床毒理学等领域带来新的思考。     

7种鹅膏菌属真菌肽类毒素的HPLC分析

利用HPLC法对长白山地区分布的7种鹅膏属真菌成熟子实体中的α鹅膏毒肽(αamanitin)、β鹅膏毒肽(βamanitin)和鬼笔毒肽(phalloidin)的含量进行了测定。结果表明:芥橙黄鹅膏(Amanitasubjunquillea)和橙黄鹅膏(Amanitaaff.citrina)中均含有3种毒素,其中芥橙黄鹅膏的α鹅膏毒肽含量为2395.91μg/g、β鹅膏毒肽含量为1653.75μg/g和鬼笔毒肽含量为405.26μg/g;橙黄鹅膏的分别为1121μg/g、4244μg/g和9442μg/g。芥橙黄鹅膏白色变种(Amanitasubjunquilleavar.abla)中含有β鹅膏毒肽,其含量为614.00μg/g。其他5种鹅膏中均未检测到上述3种毒素。     

我国鹅膏菌新发现种--致命鹅膏(Amanita exitialis)的肽类毒素分析

采用高效液相色谱(HPLC)技术对在广州发现的鹅膏菌新种——致命鹅膏(Amanita exitialis)不同组织部位的肽类毒素(鹅膏毒肽和鬼笔毒肽)的含量进行了分析,结果表明,致命鹅膏是一种剧毒蘑菇,其毒素含量相当高,子实体中组织部位不同,毒素含量以及鹅膏毒肽和鬼笔毒肽在其中的分布也不一样,菌盖中的毒素含量最高,达8152．6μg／g干重,菌柄的毒素含量次之,为3742．3μg／g干重,菌托中的毒素含量最低,只有1142．5μg／g干重;在菌盖、菌柄和菌托中都以鹅膏毒肽为主,尤其以α-amanitin的相对含量最高,但从菌盖至菌柄到菌托,鬼笔毒肽尤其是Phallacidin的相对含量依次增加。     

一种简便、快速测定鹅膏多肽毒素的方法—抑芽法

低浓度（5-10ngml^-1)的鹅膏毒肽（amatoxins)能专一性抑制RNA聚合酶Ⅱ的活性,高浓度（为RNA聚合酶Ⅱ10^3-10^4倍的浓度）也能抑制RNA聚合酶Ⅲ的活性,因而影响细胞mRNA的转录和蛋白质的合成,抑制种子的萌发和生长,根据此原理我们建立了一种以植物种子萌发试验检测鹅膏毒肽的方法,称之为“抑芽法”（bud-inhibited assay)。该方法简便、实用、准确,操作流程：45℃干燥至恒重的鹅膏菌等子实体菌盖;水提法提取毒素并用氯仿沉淀蛋白质等;粗毒液浓度为0.025-0.05gml^-1干子实体;萝卜或绿豆种子培养温度为28℃,培养时间为24-72h,绿豆芽下胚轴生长被抑制率在95%以上,可能为鹅膏毒肽含量高的剧毒鹅膏菌：当被抑制率在60-80%,可能为鹅膏肽含量较低的微毒鹅膏菌;当被抑制率在30%以下时,可能是不含鹅膏菌肽的鹅膏菌。     

鹅膏环肽毒素生源合成的研究进展

在蘑菇目Agaricales中,已知鹅膏属Amanita、环柄菇属Lepiota和盔孢伞属Galerina 3个属的部分物种能产生剧毒的鹅膏环肽毒素。全球90%以上的致死性蘑菇中毒事件是由含鹅膏环肽蘑菇导致。上述3个属的剧毒蘑菇虽然亲缘关系较远,但却可以合成同一种鹅膏环肽毒素,且使用了大致相同的生源合成代谢途径,涉及多个毒素合成基因,采用了特殊的组合式合成机制。本文总结了鹅膏环肽毒素合成途径研究的最新进展,指出了当前工作中遇到的一些难题,对未来研究的趋势进行了展望。     

一种简便、快速测定鹅膏多肽毒素的方法--抑芽法

低浓度（5-10ngml-1）的鹅膏毒肽(amatoxins)能专一性抑制RNA聚合酶Ⅱ的活性,高浓度（为RNA聚合酶Ⅱ103-104倍的浓度）也能抑制RNA聚合酶Ⅲ的活性,因而影响细胞mRNA的转录和蛋白质的合成,抑制种子的萌发和生长。根据此原理我们建立了一种以植物种子萌发试验检测鹅膏毒肽的方法,称之为"抑芽法"（bud-inhibitedassay）。该方法简便、实用、准确。操作流程45℃干燥至恒重的鹅膏菌等子实体菌盖;水提法提取毒素并用氯仿沉淀蛋白质等;粗毒液浓度为0.025-0.05gml-1干子实体;萝卜或绿豆种子培养温度为28℃,培养时间为24-72h。绿豆芽下胚轴生长被抑制率在95%以上,可能为鹅膏毒肽含量高的剧毒鹅膏菌;当被抑制率在60-80%,可能为鹅膏肽含量较低的微毒鹅膏菌;当被抑制率在30%以下时,可能是不含鹅膏菌肽的鹅膏菌。     

我国鹅膏菌新发现种——致命鹅膏(Amanita exitialis)的肽类毒素分析

采用高效液相色谱（HPLC）技术对在广州发现的鹅膏菌新种——致命鹅膏(Amanita exitialis)不同组织部位的肽类毒素(鹅膏毒肽和鬼笔毒肽)的含量进行了分析,结果表明,致命鹅膏是一种剧毒蘑菇,其毒素含量相当高,子实体中组织部位不同,毒素含量以及鹅膏毒肽和鬼笔毒肽在其中的分布也不一样,菌盖中的毒素含量最高,达8152.6μg/g干重,菌柄的毒素含量次之,为3742.3μg/g干重,菌托中的毒素含量最低,只有1142.5μg/g干重;在菌盖、菌柄和菌托中都以鹅膏毒肽为主,尤其以αamanitin的相对含量最高,但从菌盖至菌柄到菌托,鬼笔毒肽尤其是Phallacidin的相对含量依次增加。     

一种简便、快速测定鹅膏多肽毒素的方法——抑芽法*

低浓度（5-10ngml-1）的鹅膏毒肽(amatoxins) 能专一性抑制RNA聚合酶Ⅱ的活性,高浓度（为RNA聚合酶Ⅱ103-104倍的浓度）也能抑制RNA聚合酶Ⅲ的活性,因而影响细胞mRNA的转录和蛋白质的合成,抑制种子的萌发和生长。根据此原理我们建立了一种以植物种子萌发试验检测鹅膏毒肽的方法,称之为“抑芽法”（bud-inhibited assay）。该方法简便、实用、准确。操作流程：45℃干燥至恒重的鹅膏菌等子实体菌盖;水提法提取毒素并用氯仿沉淀蛋白质等;粗毒液浓度为0.025-0.05gml-1干子实体;萝卜或绿豆种子培养温度为28℃,培养时间为24-72h。绿豆芽下胚轴生长被抑制率在95%以上,可能为鹅膏毒肽含量高的剧毒鹅膏菌;当被抑制率在60-80%,可能为鹅膏肽含量较低的微毒鹅膏菌;当被抑制率在30%以下时,可能是不含鹅膏菌肽的鹅膏菌。     

云南楚雄致命鹅膏中环肽毒素的检测与分析

采用反相高效液相色谱法对采自云南楚雄双柏县的致命鹅膏在3个不同生长期中不同部位的6种环肽毒素含量进行了检测和分析。结果表明,致命鹅膏含有α-, β-鹅膏毒肽、羧基三羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽,未检出γ-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽。生长期毒素总量最高（9.3mg/g）、从成熟期（7.5mg/g）到衰老期（6.5mg/g）逐渐降低,但鬼笔毒肽的相对含量随着年龄增长而逐渐增加,鹅膏毒肽与鬼笔毒肽比值从生长期、成熟期到衰老期分别为2.6、1.4和0.9。在3个不同发育阶段中,4种毒素含量从菌盖、菌柄到菌托逐渐降低,而鬼笔毒肽的相对含量逐渐增加。α-鹅膏毒肽和β-鹅膏毒肽在生长期菌盖中含量最高,分别为7.4mg/g和3.1mg/g,而羧基三羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽在衰老期的菌盖中含量最高,分别为2.8mg/g和2.1mg/g。     

三种鹅膏菌培养条件及所产肽类毒素的比较研究

以外生菌根菌鹅膏菌属三个种Amanita muscaria,A.pseudoporphyria和A.fritillaria为研究材料,以生长速率为评价指标,对其最适生长温度、pH值、光照、培养基、C及N源的利用等基本培养条件及所产肽类毒素进行了比较研究。研究结果表明,三种菌株最适生长温度有差异,A.pseudoporphyria和A.fritillaria的最适温度为28℃,A.muscaria的最适温度为22℃;A.muscaria菌丝体生长的pH值范围为5-7,另外两个菌株的pH值范围为3-6;24h光照、12h光暗交替和24h黑暗对鹅膏菌的生长速率影响不大;SPDM培养基和MMN培养基都适合三种菌株的生长,但对于A.muscaria来说PDM培养基更适合其生长。鹅膏菌能够利用比较广泛的C、N源,但三个种在利用的C、N源种类上有一定的差别。通过抑芽法实验和HPLC分析分别表明三种鹅膏菌所含肽类毒素在种类和含量上有所不同,但都对绿豆发芽有一定的抑制作用。A.pseudoporphyria和A.fritillaria菌丝体中α-amanitin的含量分别为35.56μg/gDCW(drycellweight细胞干重)和26.02μg/gDCW,不含有phalloidin和β-amanitin;A.muscaria菌丝体中没有检测到α-amanitin、β-amanitin和phalloidin。结果表明供试的三种鹅膏菌在基本培养条件及所产肽类毒素方面存在种水平上的差异。     

四种剧毒鹅膏菌肽类毒素的HPLC分离与鉴定

利用反相市郊和液相色谱（ＨＰＬＣ）、紫外吸收光谱、擀谱分析了灰花纹鹅膏Ａｍａｎｉｔａ ｕｌｉｇｉｎｅａ,白毒鹅膏Ａ．ｖｅｒｎａ,鳞柄白毒鹅膏Ａ．ｖｉｒｏｓａ,豹斑鹅膏Ａ．ｐａｎｔｈｅｒｉｎａ等四种剧毒鹅膏菌的肽类毒素,结果表明：Ａ．ｆｕｌｉｇｉｎｅａ、Ａ．ｖｅｒｎａ含有九种标样毒素中的七种,Ａ．ｖｉｒｏｓａ含有九种标样毒素中的七种,Ａ．ｖｉｒｏｓａ含有标样中的五种;Ａ．ｐａｎｔｈｅｒｉｎａ含有标样     

中国几种剧毒鹅膏菌的ITS序列分析

测定了来自中国不同地区的9个剧毒鹅膏菌的核糖体内转录间隔区(ITS)核苷酸序列.以湖南鹅膏为外类群,用ITS序列构建了系统进化树.结果表明:两个不同产地的欧氏鹅膏存在一定的差异,但仍可聚为同一组;欧氏鹅膏与其它几种剧毒鹅膏的亲缘关系较远;两个根据形态特征鉴定为灰花纹鹅膏的标本可能是两个不同的种;欧氏鹅膏、致命鹅膏和黄盖鹅膏白色变种这3个产生白色子实体的种系统演化上不是同源的.     

绿豆子叶脱分化过程中RNA聚合酶的制备、特性及其活性的研究

绿豆(Phaseolus vadiatus L.)子叶切段在脱分化形成愈伤组织过程中,制备的染色质具有较高的RNA聚合酶活力;3天愈伤组绢的酶活力高于5天和7天的;3天、5天和7天加激素脱柱依次分分化形成的愈伤组织,其酶活力均比不脱分化的高一倍以上;用DEAE-纤维素酶部,依据层析洗脱性质和层析图谱及对α-鹅膏菌素的敏感程度,证明三个峰是RNA聚合Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。     

玫瑰红鹅膏主要肽类毒素的HPLC 测定及其对白色念珠菌的抑制活性

【目的】检测玫瑰红鹅膏中所含肽类毒素及其含量,并对其肽类毒素的抑制白色念珠菌活性进行研究。【方法】采用HPLC和ESI-MS法从玫瑰红鹅膏中分离并鉴定出所含肽类毒素,并采用HPLC法测定其子实体、菌盖及菌柄和菌托混合部分中肽类毒素的含量。同时,采用纸片法研究了玫瑰红鹅膏粗毒液和分离到的单品肽类毒素对白色念珠菌JLC31680和JLC31681的抑菌作用。【结果】分离并鉴定出α-鹅膏毒肽(α-AMA)、β-鹅膏毒肽(β-AMA)和二羟鬼笔毒肽(PHD)等3种肽类毒素。玫瑰红鹅膏子实体中α-AMA、β-AMA、PHD的含量分别为30.3168、6.9932和9.9459 mg/g;菌盖中含量分别为44.9573、11.0798和11.3025 mg/g;菌柄和菌托混合部分中:α-AMA 11.6904 mg/g和PHD 7.9775 mg/g,β-AMA未检出。粗毒液、α-AMA、β-AMA和PHD对白色念珠菌JLC31680均具有很好的抑制作用,抑制率分别达到11.96%、32.52%、23.29%(p<0.01)和15.46%(p<0.05);粗毒液和β-AMA对白色念珠菌JLC31681的最高抑制率分别为10.16%和11.10%(p<0.01),α-AMA对白色念珠菌JLC31681最高抑菌率为6.89%(p<0.05)。【结论】玫瑰红鹅膏中的三种肽类毒素的含量较高,是制备肽类毒素的新资源;其具有抑制白色念珠菌的活性,可开发利用。     

HL-60细胞内DNA甲基化作用与RNA聚合酶活力的关系

以 S-腺苷酰 - L-甲硫氨酸 ( SAM)为诱导物 ,在 1 0 μmol/L最佳浓度下可诱导 HL- 60细胞分化达 1 6%左右 .HPLC测定结果证明 ,诱导物处理后 HL- 60细胞 DNA甲基化水平升高 .通过 3 H-UTP同位素参入法 ,测定了不同处理时间和不同浓度 SAM对 HL- 60细胞 DNA模板体外转录活性的影响 ,发现体外活力下降 .比较了不同浓度α-鹅膏蕈碱存在下 RNA聚合酶活力的变化 ,结果表明 SAM处理后细胞中不同 RNA转录产物所占份额改变