汉滩病毒糖蛋白G1G2和核蛋白NP在痘苗病毒天坛株中的联合表达

以汉滩病毒７６／１１８株Ｍ、Ｓ片段分别插入转南粒ＰＪＳＢ１１７５的Ｐ１１和Ｐ７．５启动子下游,构建成重组质粒ＰＪＳＢ１１７．５Ｓ。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染针重组质粒分别与痘苗病毒天坛株ＴＫｖｖ和表达Ｓ片的重线痘苗病毒ＶＪＳＡ１１７５Ｓ进行共转染,免疫酶斑和蓝白筛法筛选并纯化,得到了重组病毒ＶＪＳＢ１１Ｍ５Ｓ。Ｂｕｄｒ的选择压力试验表明,外源基因确定插入在ＴＫ基因区;ＰＣＲ及打点杂交证实了两个片     

汉滩病毒核蛋白的分段表达及抗原表位分析

在大肠杆菌中对汉滩病毒Ｓ基因４种不同长度片段的重组表达质粒进行诱导表达。结果表明表达的４种ＧＳＴ－ＮＰ融合蛋白均以不溶性包含体形式存在于茵体细胞内,表达量分别占菌体蛋白总量的２９－３６％,分子量分别约为７２ｋＤ、６６ｋＤ、５４ｋＤ和４４ｋＤＤ。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ显示５４ｋＤ和７２ｋＤ融合蛋白用酶标记汉滩病毒ＮＰＭｃＡｂｌＡ８和抗ＧＳＴ ＭｃＡｂ ３Ｃ１１染色呈阳反应。６６ｋＤ和４４ｋＤ融合蛋     

狂犬病病毒CVS株核蛋白基因的原核表达、纯化及鉴定

用KT-PCR技术对狂犬病病毒(RV)CVS株核蛋白(N)基因进行扩增,经克隆与序列分析,该基因编码450个氨基酸残基.将目的基因克隆到原核表达载体pET28a( )中,构建了重组质粒pET-N,将其转化表达菌BL21(DE3),于37℃1.0mmol/L IPTG条件下诱导表达.大肠杆菌菌体裂解产物经SDS-PAGE电泳分析,在分子量约为54kD处出现一新蛋白带,和预期的目的蛋白的分子量相符.质谱鉴定的结果表明成功表达了RV N蛋白,为狂犬病的进一步研究奠定了基础.     

汉滩病毒核蛋白的分段表达及抗原表位分析

在大肠杆菌中对汉滩病毒S基因4种不同长度片段的重组表达质粒进行诱导表达.结果表明表达的4种GST-NP融合蛋白均以不溶性包含体形式存在于菌体细胞内,表达量分别占菌体蛋白总量的29-36%,分子量分别约为72 kD、66 kD、54 kD和44 kD.Western blot显示54 kD和72 kD融合蛋白用酶标抗汉滩病毒NP McAb 1A8和抗GST McAb 3C11染色呈阳性反应.66 kD和44 kD融合蛋白仅与酶标3C11呈阳性反应.用凝血酶切去GST,获得4种汉滩病毒重组核蛋白(rNP),分子量分别约为44 kD、40 kD、26 kD和16 kD.用19株McAb对表达产物做抗原位点分析,结果完整的rNP可与19株McAb中的13株反应,McAb反应谱与天然NP相同;S1.1 kb表达产物(N-端1-37和C端402-429位aa缺失)和S 0.5 kb表达产物(N-端1-274位aa缺失)与19株McAb均不发生反应;S0.7 kb表达产物(C-端275-429位aa缺失)可与5株组特异性McAb反应.表明汉坦病毒核蛋白上的抗原位点主要存在于N-端1-37位aa区段内.     

SARS病毒M蛋白的二级结构和B细胞表位预测

以SARS病毒基因组序列为基础,采用GarnierRobson方法、ChouFasman方法和KarplusSchulz方法预测蛋白质的二级结构;按KyteDoolittle方案、Emini方案和JamesonWolf方案预测SARS病毒M蛋白的B细胞表位。预测结果表明,在SARS病毒M蛋白N端第11～20、27～36区段和第133～141区段可能是α螺旋中心;M蛋白分子N端第20～27、34～37,44～56,61～64,70～76,79～97,117～132,142～147,165～176区段和第216～221区段可能是β折叠中心。在M蛋白N端第5～6、40～44、105～107、112～116、189～190、202～203区段和第210～215区段具有较柔软的结构,有可能进行一定幅度的摆动或折叠而形成较复杂的三级结构。SARS病毒M蛋白N端第1～15、37～47、99～120、181～192区段和第196～215区段内或附近很可能是B细胞表位优势区域。以蛋白质的二级结构预测作为辅助手段,用抗原指数,亲水性参数和可及性参数预测SARS冠状病毒M蛋白的B细胞表位,为实验确定SARS病毒M蛋白的B细胞表位和免疫识别研究奠定了基础 。     

奥利亚罗非鱼DMO和DMT蛋白二级结构和B细胞抗原表位的预测

以DMO和DMT氨基酸序列为基础,采用Garnier-Robson法、Chou-Fasman法和Karplus-Schulz法预测蛋白质的二级结构;按Kyte-Doolittle法、Emini法和Jameson-Wolf法预测DMO和DMT蛋白的B细胞抗原表位。预测结果表明：在DMO蛋白N-端第80～112,144～147,193～194,251～255,260～269区段和279～283区段,DMT蛋白N－端61～86,98～105,140～146,239～241区段和第269～273区段,可能是α-螺旋中心;DMO蛋白N-端第59～61,69～70,148～150区段和383～390区段,DMT蛋白的N-端第125～129,207～213,255～264区段和第281～284区段,可能是β-折叠中心;在DMO蛋白分子N-端40～41, 44～45,50～51,128～129,189～192,204～207,216～222,226～233,244～246,298～299区段和第323～326区段和DMT蛋白分子N-端第12～13,26～27,43～44,58～60,93～95,115～120,136～139区段和第149～151区段具有较柔软的结构,这些区段有可能进行一定幅度的摆动或折叠而形成较复杂的三级结构。DMO蛋白N-端第1～5,41～51,65～67,86～89,98～110,154～170,183～203,205～248,258～264,284～291,293～298,270～375,389～392,402～410区域和DMT蛋白N-端第1～9,17～28,77～84,114～123,131～139,157～184,196～207区域可能是B细胞表位优势区域。以蛋白质的二级结构预测作为辅助手段,用抗原指数,亲水性参数和可及性参数预测DMO和DMT蛋白的B细胞表位,为DMO和DMT蛋白单克隆抗体的制备提供了线索,为系统研究奥利亚罗非鱼DMO和DMT基因的性别调控机理研究提供参考。     

狂犬病病毒糖蛋白表达及纯化及其记忆性B细胞结合能力的分析

表达纯化不同标签、不同大小3个狂犬病病毒糖蛋白,分析其结合功能后,得到具备高亲和力的、可特异性结合记忆性B细胞的狂犬病病毒糖蛋白。本实验通过基因工程的方法,采用不同的原核表达系统分别表达带有不同标签的、全长和膜外区的RVG,纯化蛋白并分析比较其结合功能,荧光标记候选蛋白,结合CD19及CD27的抗体,流式细胞术检测狂犬疫苗免疫后PBMCs中抗狂犬病病毒特异性记忆性B细胞的情况,确认候选蛋白与抗狂犬病毒特异性记忆性B细胞的结合功能。本实验成功构建了3个表达载体pGEX-5X-1-RVG、pET28a-RVG和pET30a-G,优化表达纯化条件成功获得了糖蛋白GST-RVG、His-RVG和His-G。纯化后的GST-RVG、His-RVG和His-G经Western blotting和ELISA鉴定均有抗原特异性;由竞争ELISA法测得3个纯化后糖蛋白与抗狂犬病病毒抗体的亲和力。通过流式细胞术可以检测到狂犬疫苗免疫后阳性志愿者PBMCs中的抗狂犬病病毒特异性记忆性B细胞,从而获得了高亲和力、可用于分选抗原特异性的记忆性B细胞的狂犬病病毒糖蛋白。     

一株新的狂犬病重组痘苗病毒某些生物学性质的研究

对表达狂犬病毒糖蛋白的重组痘苗病毒ＶＶＭ１１ＫＲＧ株生物学性质进行了研究,该重组病毒的特点是：（１）糖蛋白基因插入到痘苗病毒天坛株基因组ＨｉｎｄⅢＭ片段中;（２）启动子为痘苗病毒天坛株Ｐ１１晚期启动子;（３）不含外源ｌａｃ基因。该重组病毒在ＣＶ－１细胞和鸡胚细胞上繁殖滴渡略高于另一株重组痘苗病毒ＶＶＴＫ１１ＫＲＧ,在鸡胚细胞中繁殖滴度第三天达到最高,在ＣＶ－１细胞中第二天达到最高。温度稳定性与天坛株相比没有明显改变。重组病毒在家兔皮内的毒力比亲本株（天坛株）低。间接免疫荧光和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ都证明了狂犬病毒糖蛋白有良好的表达。通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实糖蛋白基因准确地插入到ＨｉｎｄⅢＭ片段中。重组痘苗病毒启动子与部分糖蛋白基因克隆到ｐＧＥＭ３ｚｆ（－）质粒上,对该段ＤＮＡ序列分析表明不会产生移码和融合蛋白,从而为该重组病毒的使用提供了明确的基因背景资料。     

抗原表位的研究方法及口蹄疫病毒抗原表位的研究进展

本文综述了近几年来用于B细胞表位及T细胞表位研究的常用方法及其在口蹄疫病毒抗原表位研究中的应用,并介绍了口蹄疫病毒抗原表位的研究进展.     

牦牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OmpH的扩增与生物信息学分析

旨在扩增牦牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OmpH的编码基因,并预测OmpH蛋白二级结构和B细胞抗原表位,从而探讨牦牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OmpH在免疫保护中所起的作用。对牦牛多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白OmpH基因进行PCR扩增及序列测定。应用生物信息学相关软件和方法,对牦牛多杀性巴氏杆菌OmpH蛋白的二级结构和B细胞抗原表位进行预测。牦牛多杀性巴氏杆菌OmpH基因全长1 478 bp,ORF包含1 002 bp编码333个氨基酸。二级结构以无规卷曲为主,有少量的α-螺旋和延伸带;推测OmpH蛋白有1个细胞黏附位点、2个糖基化位点。     

Parainfluenza Virus 5 Expressing the G Protein of Rabies Virus Protects Mice after Rabies Virus Infection

Rabies remains a major public health threat around the world. Once symptoms appear, there is no effective treatment to prevent death. In this work, we tested a recombinant parainfluenza virus 5 (PIV5) strain expressing the glycoprotein (G) of rabies (PIV5-G) as a therapy for rabies virus infection: we have found that PIV5-G protected mice as late as 6 days after rabies virus infection. PIV5-G is a promising vaccine for prevention and treatment of rabies virus infection.     

中国19个狂犬病病毒街毒分离株N基因的序列分析

测定了30年来从不同动物中分离的19个中国狂犬病病毒街毒株N基因的部分核酸序列,并对其核苷酸差异做了比较分析.可将中国狂犬病病毒街毒株分为4个组群,各组间的同源性为83.45%～88.62%.除广西地区分离的狂犬病病毒街毒株彼此差异较大外,其余街毒株的地理分布与其N基因核酸序列差异的距离是密切相关的,基本上可按其地理分布分为东、西二大组.     

犬瘟热病毒TN株血凝基因的克隆与序列分析

用RT PCR方法对分离的TN野毒株H基因进行了扩增 ,并将其克隆到pGEM T载体上 ,进行核苷酸序列测定。结果TN野毒株H基因ORF全长 1 ,81 5bp ,编码 60 4个氨基酸。与GenBank中己报道的 7个CDV毒株相比 ,H基因核苷酸序列的同源性在 92 %～ 99%之间 ,推导的H蛋白氨基酸序列的同源性在 91 %～ 99%之间。TN株H蛋白潜在的N 联糖基化位点为 8个 ,而Onderstepoort弱毒株H蛋白为 4个 ;其中N端第 1 9～ 2 1、 30 9～ 31 1、 5 8     

Plant Transformation Vectors Having Street Rabies Virus (Indian Strain) Glycoprotein Gene

Rabies, a serious health hazard, affects central nervous system of mammals and is caused by rabies virus. The viral glycoprotein forms the external surface of virus and is the most antigenic protein. Hence the rabies glycoprotein is an ideal candidate for use in the construction of a subunit marked vaccine. With the idea to substitute the total inactivated virus with G protein in the production of vaccine, the study was undertaken to clone the full-length glycoprotein gene under the control of various constitutive and expression promoters for its expression in bacterial background and its further cloning for plant transformation.     

狂犬病毒街毒株全长基因cDNA克隆的构建及鉴定

利用分子克隆的方法,将狂犬病毒街毒株的全基因组分为4个片段按照它们基因组上的顺序克隆到真核表达载体pVAX1上,并将G-L间隔区的非编码区替换为表达绿色荧光蛋白(GFP)的核苷酸,构建出表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组狂犬病毒HN10株全长基因组cDNA真核表达质粒,同时,在全长cDNA的两侧嵌入锤头状核酶(HamRz)和丁型肝炎病毒核酶(HdvRz)的序列,并置于CMV启动子的控制下,为下一步拯救出该嵌合病毒提供了可直接使用的全长cDNA真核表达质粒。     

Endophilin B1 基因及蛋白的生物信息学分析

目的:利用生物信息学方法分析人Endophilin B1基因以及蛋白的结构,为进一步研究其功能和参与的调控机制提供一定的理论依据。方法:通过GenBank搜索Endophilin B1基因及蛋白序列,采用生物信息学方法分析该基因在不同物种中的差异,分析该蛋白的亚细胞定位,二级结构,功能域以及抗原表位。结果:该基因编码一个长度为365个氨基酸的蛋白,具有两个BAR和SH3两个功能域。Endophilin B1蛋白理论分子量为40796.3,理论等电点为5.78。二级结构中α螺旋(H)占56.44%,β折叠(E)占5.48%,无规卷曲占38.08%。Endophilin B1蛋白含有4个可能的N连接糖基化位点,5个潜在的酪蛋白激酶II磷酸化位点,7个豆蔻酰基化位点,3个PKC磷酸化位点以及2个酪氨酸激酶磷酸化位点。并进一步利用DNAstar软件分析了了该蛋白的抗原表位。结论:利用生物信息学预测出的结构和功能信息,能为Endophin B1蛋白的相关研究提供一定的信息基础。     

猪细小病毒自然弱毒N株VP2基因的克隆、测序及生物信息学分析

本研究对猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)自然弱毒N株(PPV-N)VP2基因进行克隆、测序并利用生物信息学技术分析PPV-NVP2蛋白基因的同源性、遗传进化、密码子偏爱性、糖基化位点、磷酸化位点、B细胞抗原表位及其二、三级结构。结果表明:成功扩增出包含VP2基因完整目的片段(1901bp),构建了VP2基因的克隆重组质粒pMD18-T-VP2,测序获取VP2基因序列(1740bp)并将该序列登录到GenBank(HM355807)。PPVVP2基因属高度保守的基因;PPV-N株与PPV弱毒代表毒株NADL-2株亲缘性近,推测PPV-N株属于弱毒株;PPV-N株VP2基因氨基酸密码子偏爱以A结尾的密码子;PPV-N株VP2蛋白可能存在7个糖基化位点,其丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸可能分别有9、7、8个磷酸化位点,可能存在24个B细胞抗原表位;PPV-N株VP2蛋白二级结构预测,α-螺旋占11.74%,β-折叠占22.97%,无规则卷曲占65.28%,而三维结构预测VP2蛋白主要以无规则卷曲为主,存在多个螺旋和折叠区域。本研究结果为进一步阐释PPV-N株自然弱毒的分子机理提供依据,并为PPV分子诊断试剂及基因工程疫苗研究等提供有益借鉴。     

用狂犬病毒核蛋白基因小干扰RNA库抑制狂犬病毒复制和感染的研究

采用RNaseⅢ消化长片段双链RNA的方法,制备了狂犬病毒N基因、P基因和G基因小干扰RNA库(siRNACocktail)。将siRNA转染BSR和MNA细胞单层后,采用直接免疫荧光法观察发现,N基因siRNACocktail能够对RV的复制和感染产生明显和稳定的抑制作用,并且通过RT-PCR在转录水平探测到mRNA产量的降低;而P基因或G基因siRNACocktail对RV的复制和感染不产生或仅产生弱的抑制作用。这一结果为RNA干扰在RV研究中靶基因的选择及进一步的应用提供了依据。     

用狂犬病毒核蛋白基因小干扰RNA库抑制狂犬病毒复制和感染的研究

采用RNase Ⅲ消化长片段双链RNA的方法,制备了狂犬病毒N基因、P基因和G基因小干扰RNA库(siRNA Cocktail).将siRNA转染BSR和MNA细胞单层后,采用直接免疫荧光法观察发现,N基因siRNA Cocktail 能够对RV的复制和感染产生明显和稳定的抑制作用,并且通过RT-PCR在转录水平探测到mRNA产量的降低;而P基因或G基因siRNA Cocktail对RV的复制和感染不产生或仅产生弱的抑制作用.这一结果为RNA干扰在RV研究中靶基因的选择及进一步的应用提供了依据.