Smad3基因剔除对小鼠造血功能的影响

研究Smad3基因剔除对小鼠造血功能的影响。实验小鼠分为 5组 ,每组有Smad3基因剔除小鼠(Smad3 - - )和其同窝孪生的野生型小鼠 (Smad3 + + )各 1只。小鼠的造血功能用 14天形成的脾结节 (CFU S1 4 )、多系祖细胞 (CFU GEMM)、粒 单系祖细胞 (CFU GM)、红系祖细胞 (BFU E)测定及外周血象、骨髓象等实验血液学指标来确定。每组小鼠取尾血作白细胞、红细胞和血小板计数 ,涂片作白细胞分类计数。将一侧股骨的骨髓冲出 ,制成单细胞悬液 ,计数其中有核细胞数 ,测定CFU GM、BFU E、CFU GEMM值。将每只小鼠的 4× 10 4个骨髓有核细胞 ,经尾静脉注入 3只 8～ 10周经致死量射线照射的同系雌性小鼠体内 ,测定 14天的CFU S。取一部分胸骨、肝脏、脾脏固定做病理切片 ,其余胸骨冲出骨髓 ,涂片作分类计数。结果Smad3 - - 小鼠外周血白细胞和血小板计数明显高于Smad3 + + 小鼠 ,红细胞数无显著差异。外周血白细胞分类结果也表明粒细胞显著增高。骨髓有核细胞数无显著差异 ,CFU GM显著增高 ,BFU E无显著差异 ,CFU GEMM明显减少 ,CFU S显著减少。病理形态学观察发现骨髓增生极度活跃 ,以粒系为主 ,肝脾无显著差别。骨髓涂片分类表明粒系增多 ,粒系 :红系比例增高。因此得出结论Smad3基因剔除使小鼠造血干祖细胞数目     

Smad3基因剔除致骨关节炎小鼠血清蛋白质组双向凝胶电泳分析

Smad3基因剔除导致小鼠骨关节炎。为了进一步深入研究Smad3基因缺失导致骨关节炎形成的分子机制,寻找骨关节炎发生早期的分子变化。用双向电泳技术结合肽质量指纹谱技术对Smad3基因剔除小鼠和野生型小鼠血清蛋白质组进行了初步分析。对其中7个表达差异蛋白质进行了鉴定,并探讨了所鉴定蛋白质与骨关节炎发生的关系。为揭示SMAD3介导的TGF-β信号在骨骼发育中的重要作用提供了线索。      

转修饰cry1Ac基因籼稻明恢81经花药培养获得抗虫DH系

对基因枪法获得的明恢81转修饰的cry1Ac基因当代植株进行花药培养,共接种花药2600枚,获得83份花培植株,其中双倍体植株43份,单倍体植株40份。 PCR结果表明含有cry1Ac基因的植株55份,花培植株群体中转基因与非转基因植株的比值为2∶1（55/28）。进一步结合Southern blot和ELISA分析,于花培植株当代筛选到转基因纯合株系36份。外源蛋白表达量上,花药来源于同一克隆的DH系的不同植株之间基本一致,最高的Cry1Ac含量达0.25%。田间抗虫性试验表明,经花药培养纯合获得的部分转基因纯合系植株对二化螟(Chilo suppressalis)表现出高抗,而且主要农艺性状保持不变。以上结果表明水稻花药培养可以加速转基因的纯合与育种利用。     

p18INK4C基因缺失增强造血干细胞在亚致死剂量

观察p18^INK4C (p18)基因缺失对造血干细胞(HSC)在亚致死剂量照射小鼠体内长期植入的影响. 供体为p18基因缺失型(p18^-/-)纯系C57BL/6小鼠(CD45.2表型), 竞争性细胞来源于C57BL/6-Ly5.1(CD45.1/2)双表型小鼠, 受体为野生型(p18^+/+)C57BL/6-Ly5.1(CD45.1)小鼠. 竞争性骨髓移植(cBMT)实验根据受体小鼠照射剂量的不同分为3个剂量组(10 Gy, 5 Gy和1 Gy). 供体细胞和竞争性细胞1:1混合后移植, 移植后采集外周血和骨髓细胞用流式细胞仪检测各细胞比例. 造血恢复移植实验: 移植后检测外周血白细胞计数评价移植后造血恢复速度. 10和5 Gy照射剂量组, 供体细胞和竞争性细胞成功植入, 而1 Gy照射剂量组无供体细胞植入. 无论在10 Gy或是5 Gy照射剂量情况下, 供体细胞在受体内的比例均高于竞争性细胞. 移植后6周, 10和5 Gy照射剂量时外周血中供体细胞比例分别为竞争性细胞的1.46±0.21倍和1.64±0.43倍, 14周时分别为竞争性细胞的1.84±0.25倍和2.00±0.49倍, 26周时分别为竞争性细胞的3.13±0.79倍和3.24±1.33倍. 移植后6个月, 10 Gy照射剂量时骨髓细胞中供体细胞比例为竞争性细胞的7.68±4.42倍, 5 Gy照射剂量时为竞争性细胞的10.83±2.98倍. 移植后6个月, 在10和5 Gy照射剂量组之间骨髓中造血细胞植入率相当, 分别为(85.53±8.71)%和(80.87±2.87)% (P = 0.457). p18^-/-细胞与p18^+/+细胞相比, 移植后造血恢复的速度相当. p18基因缺失可以显著增强HSC在亚致死剂量照射小鼠体内的长期植入能力.     

来源于Aspergillus candidus的乳糖酶基因的克隆及序列分析

从一株产乳糖酶的亮白曲霉(Aspergillus candidus)中克隆到了乳糖酶基因组DNA及cDNA序列(EMBL ACCESSION No. AJ431643),序列分析表明,乳糖酶基因组DNA序列长3458bp,其中含有8个内含子,cDNA编码区长3015bp,共编码1005个氨基酸,前19个氨基酸为信号肽序列,氨基酸序列中共含有11个潜在的糖基化位点。将此基因与不同来源的乳糖酶基因序列进行比较发现,该基因与绝大多数乳糖酶基因同源性较低。虽与米曲霉ATCC 20423的乳糖酶序列同源性较高,但其在酶学性质上更优于后者,亮白曲霉的乳糖酶基因可能是一个具有更广阔的生产应用前景的新基因。      

对水稻MADS-box基因M79的表达模式和功能的分析

利用简并引物和T引物,通过RT-PCR, 从水稻减数分裂时期的小花中扩增并克隆出一个MADS-box基因M79,序列分析表明M79与OsMADS7在DNA水平上同源性达到97.5%,推导的蛋白序列同源性却只有91.0%.M79的转录本有5个不同的 poly (A)添加位点,它同OsMADS7一样在水稻中为单拷贝基因,也定位在水稻的第8号染色体上.M79仅在花器官中表达,其表达从减数分裂前期开始贯穿整个花的发育各时期,并且成熟雌蕊中的表达量比成熟雄蕊中多.对两代转基因水稻的分析表明,M79涉及水稻的花时控制,异位表达可使烟草的花期提前,并且还可能参与控制营养生长中的分枝以形成更多的花芽.     

DNA错配修复基因mutS的高效表达及表达产物活性鉴定

将DNA错配修复基因mutS（2.56kb）克隆于分泌型原核表达载体pET32a（+）上,以N端融合6个组氨酸的形式在E.coliAD494(DE3) 中进行了IPTG诱导表达。SDSPAGE分析证实有一与预期分子量相应的诱导表达条带,其表达量占全菌蛋白质的35％左右,且表达蛋白以可溶形式存在。利用固定化金属离子（Ni²⁺）配体亲和层析柱纯化目的蛋白,其纯度为90％以上。与含有错配碱基DNA双链的结合反应证明该蛋白具有特异性识别、结合含有错配碱基DNA双链的生物活性。     

外源基因pheA,aroG和tyrB在苯丙氨酸合成途径中的共表达

利用基因工程技术提高了短杆菌的苯丙氨酸合成途径中关键酶活性,大幅度地增加了生物合成苯丙氨酸的产量。首先采用聚合酶链反应(PCR)从大肠杆菌的氟代苯丙氨酸抗性变异菌株基因组中扩增到与苯丙氨酸合成相关的aroG,pheA和tyrB 3个基因。其中aroG编码3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(DS),pheA编码双功能酶蛋白-分枝酸变位酶(CM)和预苯酸脱水酶(PD),tyrB编码转氨酶(AT)。设计不同的酶切位点,利用质粒pUC118的多克隆位点,将3个基因按不同的顺序组合串联,然后插入穿梭质粒pCZ.10,导入短杆菌中表达。结果表明3个大肠杆菌基因在短杆菌中能够表达。其中以aroG-pheA-tyrB顺序串联而构建的黄色短杆菌工程菌株1311-GAB中的DS酶活力提高4.5倍,CM提高4.2倍,PD提高2.7倍,AT提高3.2倍;它的苯丙氨酸合成量提高2.35倍。     

hprK 基因敲除及对其枯草芽孢杆菌核黄素发酵的影响

枯草芽孢杆菌在葡萄糖丰富的环境中,胞内糖分解代谢物浓度的提高将引起碳分解代谢物阻遏效应（CCR）及糖吸收 的抑制,对核黄素等发酵过程产生不利影响。通过缺陷细胞的分解代谢物控制蛋白A（CcpA）可以解除CCR效应,但不能解除糖吸收的抑制。磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统（PTS）是枯草芽孢杆菌主要的糖吸收方式,HPr蛋白和双功能的HPr激酶/HPr-Ser46-P 磷酸酶（HprK/P）参与PTS系统的调控。在葡萄糖丰富的条件下,K96SRQ 的激酶活性受1,6二磷酸果糖激活,催化HPr蛋白46位丝氨酸残基磷酸化,形成HPr-Ser46-P.HPr-Ser46-P抑制某些碳源透过酶基因的表达;同时HPr-Ser46-P难以被酶I在His15磷酸化,不能在PTS系统中发挥转移磷酸基团的作用,使细胞的糖吸收受到抑制。在CcpA缺陷的背景下,敲除核黄素生产菌株B.subtilis24Al/Pmx45 的HprK/P 编码基因hprK,构建了CcpA和HprK/P双缺陷的重组菌B.subtilisZHc/Pmx45.摇瓶发酵显示,B.subtilisZHc/Pmx45核黄素发酵的最适葡萄糖浓度由24Al/Pmx45的8%提高到10%;核黄素产量达到4.374mg/Ml,比24Al/Pmx45提高了19.2%。结果表明,CcpA和HprK/P的双缺陷可有效解除高浓度葡萄糖所引起的CCR效 应和糖吸收抑制,有助于提高细胞对葡萄糖的耐受力,并提高核黄素产量。     

疟蚊Anopheles gambiae和A. arabiensis嗅觉结合蛋白基因的鉴定和表达谱分型

嗅觉在疟蚊寄主发现行为过程中起主要作用. 基于生物信息学技术, 对按蚊嗅觉结合蛋白基因进行了全基因组分析, 结果总共鉴定了32条嗅觉结合蛋白(OBP)候选基因序列. 进一步采用半定量反转录聚合酶链反应(semi-quantitative RT-PCR), 以疟蚊激动蛋白基因为内部表达参照标准, 研究了冈比亚按蚊所有嗅觉结合蛋白候选基因的组织特异性表达谱. 结果显示: 其中20个OBP候选基因在嗅觉组织(雌蚊触角)中有强的表达, 这说明OBP在疟蚊嗅觉行为中起重要作用. 还研究了冈比亚按蚊复合体(A. gambiae complex)中两种最重要的疟蚊, 即冈比亚按蚊(A. gambiae)和阿拉伯按蚊(A. arabiensis)的蚊种嗅觉特异性表达型, 结果发现其中12个OBP候选基因显示种间差异表达, 同时发现阿拉伯按蚊触角中OBP的累积相对表达强度高于冈比亚按蚊, 其比例为1441.45︰1314.12. 这可能是由二者的不同寄主偏好行为所致, 因为冈比亚按蚊高度嗜吸人血, 而阿拉伯按蚊则介于嗜吸人血和嗜畜血之间, 因此后者需要表达更多的OBPs以支持其寄主选择行为模式. 疟蚊OBP基因的鉴定及其组织和蚊种特异性表达型的确定, 是分析疟蚊嗅觉探测的分子机制的第一步, 如嗅觉结合蛋白重组表达及其配体鉴定.     

玉米耐渍功能基因组分析及相关基因Sicyp51的鉴定与克隆

选用耐渍性有明显差异的玉米自交系Mo17和Hz32, 对二叶一心期的幼苗进行淹水处理, 构建了这两个材料各自正向和反向的SSH(suppression subtractive hybridization)文库. 从SSH文库中筛选到105个阳性克隆; 利用处理及对照mRNA与Mo17全生育期cDNA芯片分别杂交, 得到57个3倍以上表达差异的克隆. 对所有162个克隆进行序列分析, 结果表明: 所有差异表达的克隆代表85个TUGs(tentative unique genes), 这些TUGs主要参与厌氧代谢、逆境自我保护、信号传导、细胞结构和能量代谢等生理生化途径, 同时还包括41个未知功能的cDNA, 说明玉米根系对淹水胁迫响应涉及到复杂的代谢反应. 对从Mo17和Hz32中筛选到的差异表达克隆进行比较分析发现, 在淹水条件下, 耐渍性不同的材料具有不同的耐渍相关基因的表达模式. 利用Northern及RT-PCR检测了部分阳性克隆的表达谱, 并克隆到一个与耐渍相关的新基因(Sicyp51).     

嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的高效表达及其免疫原性

根据嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的核苷酸序列设计引物,运用聚合酶链式反应（PCR）扩增出与预期大小相符的基因片段。将此基因片段克隆至质粒pRSET A的BamHI和EcoRI位点,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导获得高效表达,SDS-PAGE蛋白电泳表明在39.9kD处出现超强特异带,占总蛋白的51％。以 Ni-NTA-Conjugate抗体进行Western blot分析证明该399kD的蛋白为所表达的融合蛋白。纯化融合蛋白注射雄性新西兰大白兔可诱导产生特异抗体。ELISA和Western blot检测结果显示,该抗体与表达的融合蛋白和从嗜水气单胞菌中提取的36.9 kD外膜蛋白均呈阳性反应,表明所表达的融合蛋白仍保持原有外膜蛋白的免疫原性,为此融合蛋白作为疫苗的候选成份提供理论基础。     

TFAR19基因对MEL细胞在小鼠体内流变学特性和致病性的影响

将依托泊甙(etopside, VP16)、MEL细胞和MEL-TF19细胞注射到小鼠体内, 观测4周 时间内小鼠的血象、肝脏和脾脏的组织学, 以及血液流变学指标变化. 结果表明: 注射MEL细胞使小鼠发生了类似于红白血病的病征, 表现为肝脾组织受损、骨髓和脾脏细胞涂片出现大量的原红、早幼和中幼红细胞, 红细胞的变形和取向能力明显下降; 而携带了TFAR19基因的MEL-TF19细胞对小鼠的致病性明显小于MEL细胞, 并且在化疗药物诱导凋亡的作用下, MEL-TF19细胞完全失去了原本较弱的致病性. 动物实验的结果提示, TFAR19基因可以抑制MEL细胞对小鼠的致病性, 并且在化疗药物VP16的协同下可发挥更好的作用.     

外源性双链RNA对小鼠卵母细胞basonuclin基因表达的影响

在植物及低等动物线虫中, 引入外源性双链RNA(dsRNA)会导致细胞中同源mRNA降解, 从而干扰其内源基因的表达, 这可能是有机体防范病毒或转座子诱导DNA突变的一种生理机制, 称为RNA干涉(RNA interference, RNAi). 利用RNAi研究basonuclin基因在卵母细胞发生过程中的功能. 将basonuclin特异的dsRNA导入小鼠生发泡期卵母细胞, 可有效降低其mRNA的丰度, 这种降解作用与dsRNA的浓度及作用时间成正比, 但不影响非同源基因的表达, 证明basonuclin dsRNA能特异识别、降解其内源基因的转录产物. 免疫组化实验显示, dsRNA能降低卵母细胞中basonuclin蛋白的水平, 但其效率不如RNAi对tPA及cMos基因活性的抑制, 这可能是由于basonuclin蛋白的半衰期较长, 而生发泡期卵母细胞在体外存活时间较短. 结果表明, dsRNA能阻抑卵母细胞中同源基因的表达, 其作用相当于基因敲除. 质粒表达的发夹环型dsRNA也可以有效降解basonuclin转录产物, 这为研究basonuclin在卵母细胞发育早期的功能提供了新的手段.     

ACA基因启动子的克隆及功能初探

根据已知的ACA基因的 5 '端序列设计三个基因特异的反向引物 (GSP-1,GSP-2 ,GSP-3)分别与 11个简并引物 (AD1-AD11)配对 ,进行热不对称嵌套PCR(ThermalasymmetricinterlacedPCR ,TAIL-PCR)扩增 ,获得了ACA基因起始密码子上游约700bp的片段。为检测其表达特性 ,构建了该片段与Gus嵌合基因的表达载体pBpAG ,在真空条件下通过农杆菌介导 ,转化了植物的叶、果实、种子三种不同组织 ,Gus瞬时表达染色结果显示 ,该DNA片段具有种子特异的启动子活性。对该启动子的一些顺式元件进行了讨论。     

单引物方法克隆盐角草orf25基因

采用单引物RTPCR扩增的方法,从新疆野生植物盐角草（Salicornia europaea）中克隆获得了1.7kb的cDNA片段,经过测序和序列分析,发现基因片段包含了orf25基因完整的读码框架。采用序列同源性分析方法,结果显示新疆盐角草orf25基因与甜菜线粒体同源性高达98%,与烟草线粒体同源性达到95%,与小麦同源性为92%,与玉米同源性为88%,表明orf25 基因在植物中是高度保守的一种基因, 同时说明野生植物盐角草中也存在与农作物相似的雄性不育相关基因,orf25 基因编码的功能性蛋白可能在影响植物雄性不育改良作物品种方面具有重要的意义。     

负调节基因nsdA在链霉菌中同源性及激活沉默抗生素合成基因簇的研究

nsdA基因是在天蓝色链霉菌中发现的抗生素合成负调控基因。以nsdA基因片段为探针,通过Southern杂交发现nsdA存在于多种链霉菌中。根据天蓝色链霉菌和阿维链霉菌的nsdA序列设计PCR引物,扩增多种链霉菌中nsdA基因并测序。发现在不同链霉菌中nsdA基因的相似性高达77%～100%。其中变铅青链霉菌与天蓝色链霉菌A3(2)的nsdA序列100%一致。变铅青链霉菌通常不合成放线紫红素,中断nsdA获得的突变菌株WQ2能够合成放线紫红素;在WQ2中重新引入野生型nsdA,又失去产抗生素能力。表明nsdA的中断可以激活变铅青链霉菌中沉默的放线紫红素生物合成基因簇的表达;nsdA的广泛存在及其序列高度保守则提示可以尝试用于这些菌种的抗生素高产育种。     

Smad3基因剔除小鼠血清酶活性的变化

目的　探讨Smad3基因对剔除小鼠血清酶活性的影响。方法　采用荷兰半自动生化分析仪对 35日龄、70日龄、6月龄的三种不同基因型的小鼠的ALP、AST、ALT、CK、LDH L进行测定。结果　纯合型小鼠各项指标较野生型高 ,且表现出ALP随着年龄的增长而降低 ;AST、ALT、CK、LDH L随着年龄的增长而增高。结论　Smad3基因的剔除对小鼠的血清酶活性有一定的影响 ,为该小鼠的进一步研究提供基础。     

小鼠胚胎干细胞向脂肪细胞分化过程中PPARγ2基因的表达模式

将PPARγ2基因启动子和报告基因荧光素酶相连接克隆于特定载体构建成表达质粒 ,电穿孔转染小鼠ES细胞 ,筛选阳性克隆。诱导ES细胞向脂肪细胞分化 ,通过定量检测荧光素酶活性跟踪PPARγ2基因的表达情况 ,以此研究脂肪细胞分化过程中该基因的表达模式。结果显示PPARγ2基因在未分化的ES细胞和EB形成的前两天中不表达 ,从EB形成的第 3天开始表达 ,直至脂肪细胞分化完成。该基因在已完成分化的脂肪细胞中的表达远强于在分化中的前脂肪细胞中的表达。首次报道了从小鼠ES细胞到脂肪细胞分化过程中PPARγ2基因的表达模式 ,支持了PPARγ2基因为脂肪组织特异性表达基因的已有报道 ,并为脂肪细胞分化机理研究提供了线索。     

Smad3基因剔除的骨髓细胞移植对小鼠的影响

目的通过小鼠骨髓细胞剔除Smad3基因,观察小鼠病理变化以及免疫T细胞状态。方法将Smad3基因剔除Smad3-/-)的小鼠骨髓细胞和野生型(Smad3+/+)小鼠骨髓细胞分别移植给60Co射线照射GFP小鼠。观察骨髓移植后GFP小鼠体征变化,第6周处死小鼠,取肠道固定,HE染色观察其病理变化,流式细胞技术检测淋巴结中T细胞变化。结果移植Smad3-/-骨髓细胞的GFP小鼠逐渐消瘦,大肠出现炎症;淋巴结中活化型的CD4+CD62LloT细胞增多。结论骨髓细胞TGF-β信号受阻,可导致小鼠患炎症疾病,引起免疫T细胞活化。