孤儿受体TR3在小鼠睾丸中的定位和表达

本文采用原位杂交和免疫组织化学技术,观察孤儿受体ＴＲ３及其ｍＲＮＡ在小鼠睾丸中的表达及细胞定位。结果表明,在小鼠睾丸中有显著量的孤儿受体ＴＲ３ ｍＲＮＡ和蛋白表达,其表达量在不同曲细精管有明显的差异;孤儿受体ＴＲ３蛋白主要定位于生精细胞,其ｍＲＮＡ在生精细胞特异表达,主要在精原细胞和发育早期的初级精母细胞表达,提示孤儿受体ＴＲ３在小鼠曲细精管精子发生的早期阶段中起着调控作用。     

睫状神经营养因子的基因结构及受体

睫状神经营养因子最初由于能促进鸡胚胎睫状神经节副交感神经元存活而被发现,现已知道它对神经系统的细胞具有更广泛的作用。最近研究表明睫状神经营养因子与成血细胞因子的一个亚家族成员在结构上相似并共用受体成分。     

核孤儿受体TR3/nur77与一种新细胞凋亡机制

核孤儿受体TR3/nur77是一种立刻早期基因（immediate-early gene）的产物,与固醇类激素受体结构相似,是核受体超家族的重要成员之一,可被多种生长因子或凋亡诱导剂诱导表达,具有复杂的生物学功能,涉及细胞增殖、分化发育和凋亡过程.最近对其诱导凋亡机制的研究取得了重大进展,发现当细胞受到凋亡诱导剂刺激后,TR3基因表达升高,其产物从细胞核移位至线粒体膜,引起细胞色素c释放,从而导致细胞凋亡.即TR3的转录激活功能和诱导凋亡功能是由其不同的亚细胞定位结合所决定的,其诱导凋亡过程与其对基因的反式激活功能无关.核转录因子p53也具有类似情况.这种核转录因子由细胞核移位至细胞浆并发挥生物学功能的调控方式是一种新模式,可能具有重要的生物学意义.     

大鼠眼球和泪腺中睫状神经营养因子及其受体的组织定位

目的观察睫状神经营养因子(CNTF)及其受体CNTFRα在大鼠眼球、泪腺上的分布情况.方法取雄性SD大鼠两侧眼球和泪腺,作石蜡切片,用免疫组织化学ABC法染色检测眼球、泪腺中CNTF和CNTFRα的免疫阳性反应.结果 CNTF和CNTFRα的免疫阳性反应产物在眼球和泪腺的组织定位基本相同,包括角膜上皮细胞、固有层神经纤维、角膜细胞、内皮细胞,虹膜上皮细胞,睫状体上皮细胞,晶状体上皮,视网膜色素上皮细胞、苗勒细胞、节细胞层细胞,球结膜上皮细胞,泪腺腺细胞及导管上皮.结论 CNTF及其受体选择性地分布于眼球和泪腺的一些细胞中,且多数细胞与房水和泪液的产生和接触有关.     

大鼠损伤坐骨神经远侧端CNTF表达的免疫组织化学研究

目的：探讨大鼠坐骨神经损伤后CNTF的表达和变化。方法：采用抗CNTF抗免疫组织化学方法和计算机图像处理系统定量观察大鼠正常坐骨神经与坐骨神经横断损伤后1周、2周、4周神经远侧端CNTF的表达。结果：正常大鼠坐骨神经具有高水平的CNTF免疫阳性反应,坐骨神经损伤后1周、2周、4周远侧端神经中CNTF免疫阳性反应均低于正常坐骨神经,免疫阳性反应强度为正常＞伤后1周＞伤后2周＞伤后4周,呈逐渐减弱趋势。结论：大鼠坐骨神经损伤后远侧端神经中CNTF的表达呈下调性变化。     

人睫状神经营养因子结构和功能的研究

睫状神经营养国子在神经系统的发育和损伤修复过程中具有重要作用。本文根据由核苷酸序列推导的氨基酸序列预测了人睫状神经营养因子和二级结构。参考结构预测结果,用片段插入法和缺失地,改造人睫状神经营养因子编码基因,在大肠菌中表达并纯化了五系人睫状神经营养因子的突变体,观察结构改造对人睫状神经营养因子神经营养活性的影响。     

睫状神经营养因子对应激引起大鼠海马神经元损伤的保护作用及其机制的研究

本实验用Ｎｉｓｓｌ染色法、Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙ－Ｇｒｏｓ－Ｌａｗｒｅｎｔｊｅｗ染色法、常规透射电镜、行为活动测定、双侧海马微量给药、海马神经元原代培养、活细胞连续照相、全细胞膜片钳记录、细胞内游离Ｃａ＾２＋浓度测定及Ｐ５３蛋白免疫组化测定等方法,观察了睫状神经营养因子（ＣＮＴＦ）对应激引起动物行为变化和海马神经元形态学变化的影响,探讨了ＣＮＴＦ的部分作用机制。结果表明,急性应激不引起大鼠海马神     

内耳发育研究的新进展——神经营养素及其受体的调控和

近年来,对神经营养因子尤其是神经营养素及其功能性受体－－酪氨酸激酶受体ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ的研究进展迅速,这些因子能够促进神经元的存活、生长、分化以及损伤后的修复,应用免疫组化、原位杂交和基因敲除小鼠模型方法研究这些因子及其受体在内耳发育中的调控作用,可以在细胞、分子水平上提供有关内耳发育机制的新认识,外源性神经营养素可能在临床治疗失聪上具有潜在的应用价值。     

重组人睫状神经营养因子的表达及其临床前药效学研究

目的:人睫状神经营养因子(hCNTF)是神经营养因子(NGF)家族以外的一种神经营养因子,具有明显的减轻体重的作用。为了将hCNTF的研究逐步推向应用,开展了hCNTF减肥作用的临床前相关研究。方法:依据国内减肥药临床前药效学指导原则,设计并实施了动物实验,建立了各种指标与人类肥胖最为相似的肥胖SD大鼠模型,分别测定了重组hCNTF用药后大鼠的体重、血清三酰甘油、总胆固醇、肾周围脂肪重量和肥胖指数。结果:在200μg/(kg·d)剂量下,重组hCNTF对减轻肥胖SD大鼠体重、减轻其右肾周围脂肪及改善体型都有一定的效果;400μg/(kg·d)以上剂量的重组hCNTF,对减轻肥胖SD大鼠体重、改善体型、降低血清三酰甘油都有极其显著的效果;惟有剂量达到1600μg/(kg·d),重组hCNTF才能降低血清总胆固醇含量。结论:所获得的重组hCNTF在肥胖SD大鼠动物模型上具有十分良好的减肥效果。     

分泌睫状神经营养因子腺病毒载体的构建及小量复制病毒增强其分泌表 达的研究

目的:探讨复制型腺病毒能否增强增殖缺陷型腺病毒Ad5-hCNTF所携带外源基因的表达分泌。方法:亚克隆获得分泌型睫状神经营养因子的基因(ciliary neurotrophic factor),然后将此基因插入到穿梭质粒pshuttle。pshuttle-hCNTF经pme1酶切后,CIAP去磷酸化,利用Ad-EASY腺病毒制备系统,将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转化大肠杆菌BJ5183,通过同源重组,筛选出含目的基因的重组型腺病毒质粒的菌株,获得大量该质粒后转染病毒包装细胞AD-293,成功包装出一种血清5型增殖缺陷型腺病毒Ad5-hCNTF。结果:经PCR鉴定该病毒含有该基因片断,Western blotting证实该病毒感染细胞后能表达CNTF蛋白。采用ELISA法检测培养液证实感染细胞能高水平地分泌CNTF。结论:体外实验表明在不同滴度的复制型腺病毒Ad5-E1+E3+的带动下,该病毒感染细胞后分泌表达目的蛋白的水平显著提高,为今后应用Ad作为基因治疗的载体提供实验证据。     

分泌睫状神经营养因子腺病毒载体的构建及小量复制病毒增强其分泌表达的研究

目的：探讨复制型腺病毒能否增强增殖缺陷型腺病毒Ad5-hCNTF所携带外源基因的表达分泌。方法：亚克隆获得分泌型睫状神经营养因子的基因（ciliary neurotrophic factor）,然后将此基因插入到穿梭质粒pshuttle。pshuttle-hCNTF经pme1酶切后,CIAP去磷酸化,利用Ad-EASY腺病毒制备系统,将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转化大肠杆菌BJ5183,通过同源重组,筛选出含目的基因的重组型腺病毒质粒的菌株,获得大量该质粒后转染病毒包装细胞AD-293,成功包装出一种血清5型增殖缺陷型腺病毒Ad5-hCNTF。结果：经PCR鉴定该病毒含有该基因片断,Western blotting证实该病毒感染细胞后能表达CNTF蛋白。采用ELISA法检测培养液证实感染细胞能高水平地分泌CNTF。结论：体外实验表明在不同滴度的复制型腺病毒Ad5-E1＋E3＋的带动下,该病毒感染细胞后分泌表达目的蛋白的水平显著提高,为今后应用Ad作为基因治疗的载体提供实验证据。     

睫状神经营养因子受体

睫状神经营养因子是一种能够促进感觉、交感和运动神经元存活和分化的细胞因子．睫状神经营养因子受体复合物由三个亚基组成,α亚基是睫状神经营养因子的结合蛋白,它不是跨膜蛋白,而是通过GPI键锚在细胞膜上;信号传递体的两个亚基分别是gp130和LIFRβ．随状神经营养因子受体复合物的形成是一个有序过程、Jak／Tyk家族的激活与细胞内信号传导有关．     

蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体基因的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

AX15是一种比天然睫状神经营养因子具有更高的生物学活性、更好的稳定性和可溶性的hCNTF突变体。在巴斯德毕赤酵母中表达时AX15易发生降解。氨基酸序列分析表明降解位于由12和13位氨基酸残基组成的双碱性氨基酸之后。根据KEX2蛋白酶的底物专一性把双碱性氨基酸从RR变为RK,构建了KEX2抗性的AX15突变体AX15（R13K）。AX15（R13K）的稳定性得到了显著的提高,在诱导100 h后也未发生降解。利用超滤浓缩和凝胶过滤得到了纯度>90%的AX15（R13K）。TF-1细胞存活实验表明AX15（R13K）具有与AX15相同的生物学活性。蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体可能具有更好的体内稳定性,在临床应用上具有潜在的优势。     

重组人睫状神经营养因子的复性研究

利用凝胶层析对人睫状神经营养因子原核基因工程产品进行复性研究,发现此方法的复性率高于稀释透析法.而且在复性的同时也进行了一步纯化工作.该方法简单、迅速、高效、重复性好,可用于规模生产.     

睫状神经营养因子对听觉损伤的保护作用

本研究以耳廓反射、听觉脑干诱发电位、耳蜗生物电和耳蜗铺片组织学检测为指标,观察重组人睫状神经营养因子对豚鼠庆大霉素耳毒性的防治作用。实验结果表明,睫状神经营养因子能减轻庆大霉素对耳蜗及听神经的损害,具有保护听觉功能的作用。     

重组人睫状神经营养因子衍生物的构建、表达和活性分析

采用PCR定点突变技术对睫状神经营养因子(CNTF)基因进行改造,获得了CNTF衍生物(CNTF-D)基因序列分析证明其核苷酸序列符合设计要求,并在大肠杆菌中获得高效表达,CNTF-D表达量超过40%,复性后,经Q-Sepharose HP纯化,其纯度超过95%,体内法测定发现能明显降低实验小鼠的体重。表明CNTF-D在体内具有良好的生物学活性,为下游开发奠定了基础。     

睫状神经营养因子突变体蛋白的活性研究

为了进一步研究我室应用计算机分子模拟设计并表达纯化的睫状神经营养因子突变体蛋白的生物学活性,分别采用鸡胚背根神经节无血清培养法、TF-1细胞增殖法、正常小鼠减重法对其活性进行研究。结果是突变体蛋白能促进鸡胚背根神经节的生长;促进TF-1细胞增殖,MTT测定法表明突变体蛋白与国际参考品相比,比活不低于2.0×106U/mg;使正常小鼠的体重减轻,摄食量减少,脂肪指数下降,并且体重的减轻与突变体蛋白的给药剂量呈现良好的剂量依赖关系,其ED50为：150.986?g/kg/d。以上实验表明CNTF突变体蛋白具有促神经生长、促TF-1细胞增殖和减重的生物学活性。从而为其进一步的应用和开发提供了线索。     

BDNF及其受体在抗抑郁症中的作用及其机制研究

脑源性神经营养因子(brain-derived neurothrophic factor,BDNF)广泛存在于中枢和外周神经系统,具有神经再生和修复功能。近年来,研究发现BDNF在改善抑郁发生过程中神经可塑性以及抗抑郁药物治疗中发挥重要的作用。综述了BDNF及其受体在抗抑郁症中的作用及其机制研究。     

睫状神经营养因子突变体的设计及活性分析

利用计算机分子模拟系统模建了CNTFRα的三维结构,并对CNTF与CNTFRα结合的关键部位进行分析,同时综合了同源比较的结果及CNTF分子自身的特点,设计了2个CNTF的突变体A和B.表达纯化后得到目的蛋白,TF-1细胞增殖实验的结果表明,2个突变体蛋白的比活性均达到106U/mg的水平,且A的活性大于B的活性.上述结果初步表明设计的合理性,为其进一步的开发和应用奠定了基础.     

人血清白蛋白-睫状神经营养因子突变体融合蛋白基因在毕赤酵母中的表达及表达产物的纯化和活性鉴定

为了延长人睫状神经营养因子突变体的体内半衰期 ,将人血清白蛋白 (HAS)的C 末端和人睫状神经营养因子突变体AX15 (R13K)的N 末端通过一个 11个氨基酸的连接肽融合在一起 ,构建了融合蛋白HAS-AX15 (R13K)。HAS-AX15 (R13K)融合蛋白基因在巴斯德毕赤酵母中进行表达后通过阳离子交换层析、反向层析和凝胶过滤对表达产物进行了分离纯化。体外TF 1细胞存活实验表明与HAS融合并未影响AX15 (R13K)的生物学活性。体内动物实验表明HAS-AX15 (R13K)融合蛋白的疗效比AX15 (R13K)更为持久 :每 3天注射一次 4 8mg/kg的HAS-AX15 (R13K)融合蛋白的治疗效果优于每天注射一次 1 6mg/kg的AX15 (R13K)的治疗效果。HAS-AX15(R13K)融合蛋白不但可以减少用药次数 ,提高病人的顺应性 ,而且还可以减少用药量和血药浓度的波动 ,从而降低副反应 ,在临床应用上具有一定的优势。