RNA的生物合成与加工(一)

所有细胞的RNA都是按照DNA模板的指令,由RNA聚合酶催化合成的。RNA的生物合成(转录)过程的有些地方与DNA复制相似,如底物是核苷三磷酸,合成方向是5′→3′。但,RNA聚合酶不需要引物,也不具备有校正作用的核酸外切酶活力。DNA模板在RNA合成中是全保留的,而在DNA复制中则是半保留的。原核生物的转录原核生物转录的源料主要是从大肠杆菌取得的。大肠杆菌的所有RNA都是由同一种RNA聚合酶催化合成的。这种酶的分子量为460KDa,全酶的亚基组成为α_2ββ′σ,核心酶为α_2ββ′。σ亚基只在转录的启动中起作用,     

玉米雄性不育的基因表达与调控 Ⅰ.克隆化玉米线粒体DNA的离体转录

我们用克隆化的玉米线粒体DNA(mtDNA)为转录模板,以玉米RNA聚合酶B为转录酶建立起一个无细胞离体转录系统。这是首次用克隆化DNA为模板,以植物RNA聚合酶B建立起的无细胞离体转录系统。     

RNA聚合酶的模板特异性

研究了多种动物、植物、酵母及细菌RNA聚合酶对不同DNA模板的转录活性,结果表明,各种RNA聚合酶都表现出对同源模板比对异源模板具有更高的转录活性;对热变性DNA比对天然DNA有更高的转录活性。用混合DNA作为转录模板时,玉米RNA聚合酶B和615小鼠RNA聚合酶B都能优先转录其同源模板。     

真核基因启动子非依赖的功能转录延伸复合物的体外组装

真核生物RNA聚合酶Ⅱ的持续合成能力对基因转录过程中每一个阶段,包括启动子脱离、转录暂停、转录终止以及转录偶联DNA损伤修复过程的调节至关重要.在RNA聚合酶Ⅱ介导的转录延伸过程中,其和模板DNA及转录产物RNA紧密结合,形成一个非常稳定的延伸三维复合物(elongationcomplex,EC).此特征性“泡”状结构的形成是RNA聚合酶Ⅱ持续合成能力所必需的.在不依赖启动子及众多转录起始因子的条件下,利用人工合成的RNA与DNA寡核苷酸,在体外组装形成具有功能转录活性的延伸复合物.结果表明,长度为9个核苷酸的RNA与模板DNA形成的杂合分子对转录延伸复合物的形成是必需的,而非转录模板DNA链的加入导致最终活性转录“泡”状复合物的形成,并可转录形成与模板相关的转录产物,进一步通过在模板DNA的特定位置引入一个乙酰氧乙酰氨基芴修饰基团,可特异性地阻断转录延伸过程,从而显示该系统在研究真核基因转录及转录偶联DNA损伤修复机制中的潜在应用价值.     

HL-60细胞内DNA甲基化作用与RNA聚合酶活力的关系

以 S-腺苷酰 - L-甲硫氨酸 ( SAM)为诱导物 ,在 1 0 μmol/L最佳浓度下可诱导 HL- 60细胞分化达 1 6%左右 .HPLC测定结果证明 ,诱导物处理后 HL- 60细胞 DNA甲基化水平升高 .通过 3 H-UTP同位素参入法 ,测定了不同处理时间和不同浓度 SAM对 HL- 60细胞 DNA模板体外转录活性的影响 ,发现体外活力下降 .比较了不同浓度α-鹅膏蕈碱存在下 RNA聚合酶活力的变化 ,结果表明 SAM处理后细胞中不同 RNA转录产物所占份额改变     

三尖杉酯碱抑制脱氧核糖核酸生物合成机制的研究——Ⅲ.三尖杉酯碱抑制作用动力学及其衍生物作用的比较

本文报告了三尖杉酯碱抑制艾氏腹水癌细胞DNA聚合酶α的动力学。三尖杉酯碱的抑制作用与反应体系中的模板DNA量有关,过量的DNA可降低药物的抑制作用,但不能完全消除药物的抑制。并证明三尖杉酯碱与模板DNA对DNA聚合酶α是混合型抑制,当三尖杉酯碱浓度为10μM时,其K_i值为9.5μM,K_m值为13μg DNA/100μl。三尖杉酯碱抑制DNA聚合酶α的能力不受反应体系中四种脱氧核苷三磷酸底物浓度的影响,通过同时改变四种底物浓度,或固定三种底物浓度只改变其中一种底物的量,或采用限制性DNA合成系统(Limited DNA Synthesis)即在完全体系中省略去某一底物,均证明三尖杉酯碱与四种底物对DNA聚合酶α为非竞争性抑制,当三尖杉酯碱浓度为4μM时,对dCTP、dGTP和dTTP的K_i值分别为12μM、11μM和12μM。本文也比较了三尖杉酯碱衍生物——高三尖杉酯碱、异三尖杉酯碱和表三尖杉酯碱对DNA聚合酶α的抑制作用。结果表明,当药物浓度相同时,高三尖杉酯碱的作用较三尖杉酯碱和异三尖杉酯碱强,而三尖杉酯碱和异三尖杉酯碱的作用相近;表三尖杉酯碱本身对DNA聚合酶α无抑制作用,也未见其在无细胞系统中对三尖杉酯碱的抑制能力有加强作用。以上药物对E.coli DNA聚合酶Ⅰ也有相似的抑制作用。     

三十年磨一剑———2006年诺贝尔化学奖得主Roger Kornberg关于真核基因转录机制的研究

2006年的诺贝尔化学奖授予了美国斯坦福大学的科恩伯格（Roger D．Komberg）教授,以表彰他在真核基因转录的分子机制研究方面做出的卓越贡献。在细胞中,DNA的复制、RNA的转录和蛋白质的翻译是生命活动的核心过程。因此,研究遗传信息如何从DNA到RNA再到蛋白质的传递过程一直是分子生物学研究的核心课题。科恩伯格的工作则在分子水平上向我们展示了RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ）及各种蛋白因子在DNA模板上合成作为蛋白质合成模板的信使RNA（mRNA）的过程,为在转录水平阐明真核基因的表达调控奠定了分子结构基础。     

质粒DNA的构型变化对转录的调控作用

本文以重组质粒pZmS 51 DNA为转录模板,在无细胞离体转录系统中研究了质粒DNA的构型变化与其模板活性的关系。结果表明:(1)质粒DNA的构型变化对其模板活性有明显影响;(2)超螺旋化对于质粒DNA在转录水平上的表达是必需的。这些结果对于离体转录的研究有其生物学意义。     

组蛋白与hAMFR基因启动子的结合对体外转录活性的影响

采用从鸡血红细胞中分离纯化的组蛋白,从ＨｅＬａ细胞核中萃取的含有ＲＮＡ聚合酶Ⅱ和多种Ⅱ类基因转录因子的可溶性抽提物,以及从非洲爪蟾卵细胞核中撮以的萃取物热处理物上清用于核小体构建,以含有人自泌移动因子受体基因启动子序列的ＤＮＡ片段为模板进行体外转录实验,结果表明,组蛋白和转录因子在ｈＡＭＦＲ基因启动子序列上的竞争性结合对转录活性具有重要的影响作用,在启动子区域预先构建的核小体能够抑制转录活性;     

大肠杆菌中依赖于DNA的RNA聚合酶的提取

在细菌和其他动植物细胞中都普遍存在着一种以DNA作为模板,利用四种核糖核苷三磷酸作为底物来合成RNA的酶,这种酶叫做依赖于DNA的RNA聚合酶[E.C.2.7.7.6]。从细菌中提取这种酶的方法不少,但以Cham-berlin和Berg以及Burgess的方法使用最为普遍。我们主要参照Burgess氏的方法以大肠杆菌K12(E.coli K 12)中提取RNA聚合酶,并稍加改变。     

依赖于DNA的RNA聚合酶的研究 Ⅲ.615小鼠和白血病615小鼠(L615)肝细胞RNA聚合酶B的比较研究

研究了正常的615小鼠和白血病615小鼠(L615)肝细胞的RNA聚合酶B,发现两种肝细胞的RNA聚合酶B都可能存在着结合状态和游离状态的形式。在电泳图中L615 RNA聚合酶B有两条电泳区带是615 RNA聚合酶B所没有的。两种B酶的最适铵离子浓度都是90mM;最适锰离子浓度为2mM;镁离子的激活作用在10mM以下时,酶活性随镁离子浓度增高而增强。两种RNA聚合酶B对α-鹅膏蕈碱的抑制作用都非常敏感,而L615 B酶更敏感一些。两种RNA聚合酶B都适于利用变性的单链DNA作转录模板。     

DNA聚合酶Polι的研究进展

Y家族DNA聚合酶是一种跨损伤复制酶,即能以损伤的DNA为模板进行复制。Y家族DNA聚合酶广泛分布生物界,人类细胞中Y家族DNA聚合酶至少包括Rev1、Polκ、Polι、Polη四种,Polι在以DNA为模板进行复制时错配率很高而不同于其他跨损伤DNA聚合酶,Polι是目前发现的所有DNA聚合酶中保真性最低的DNA聚合酶。很高的错配率导致很高的突变率,最后基因的突变导致癌症的发生,因此Polι在各个国家被广泛的研究,并且对Polι的各个不同的特性进行了研究,取得了一系列成果,现对Polι的研究进展予以综述,并展望了未来的研究趋势。     

DNA聚合酶Polι的研究进展

Y家族DNA聚合酶是一种跨损伤复制酶,即能以损伤的DNA为模板进行复制。Y家族DNA聚合酶广泛分布生物界,人类细胞中Y家族DNA聚合酶至少包括Rev1、Polκ、Polι、Polη四种,Polι在以DNA为模板进行复制时错配率很高而不同于其他跨损伤DNA聚合酶,Polι是目前发现的所有DNA聚合酶中保真性最低的DNA聚合酶。很高的错配率导致很高的突变率,最后基因的突变导致癌症的发生,因此Polι在各个国家被广泛的研究,并且对Polι的各个不同的特性进行了研究,取得了一系列成果,现对Polι的研究进展予以综述,并展望了未来的研究趋势。     

小鼠HepA腹水型肝癌细胞核转录活性的研究

本文对小鼠HepA腹水型肝癌(简称HepA,下同)细胞核与正常小鼠肝细胞核的转录活性进行了一些比较研究,发现HepA细胞核的转录活性比正常肝细胞核升高约80%,其中,依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅱ(简称RPase Ⅱ,下同)的活性比RPase Ⅰ有更显著的增加,转录活性的升高以起始速率的增强为主。两种细胞核内的RPase Ⅱ的性质有明显的差别。     

小鼠HepA腹水型肝癌细胞核转录活性的研究

本文对小鼠HepA腹水型肝癌(简称HepA,下同)细胞核与正常小鼠肝细胞核的转录活性进行了一些比较研究,发现HepA细胞核的转录活性比正常肝细胞核升高约80%,其中,依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅱ(简称RPase Ⅱ,下同)的活性比RPase Ⅰ有更显著的增加,转录活性的升高以起始速率的增强为主。两种细胞核内的RPase Ⅱ的性质有明显的差别。     

利用PCR技术构建体外高效转录系统

设计并合成了一对 PCR 反应引物,其5′端引物除含有目的基因5′端序列外,还外加 T7 RNA 聚合酶启动子的17个核苷酸.3′端引物则按常规设计.以染色体 DNA为模板,通过 PCR,可扩增出带有 T7 RNA 聚合酶启动子的目的基因 DNA 片段.以此 PCR 产物为模板,在体外成功实现了高效转录.这是一种快速、简便构建体外高效转录系统的好方法.     

肝癌细胞AFP基因高水平的转录是受核蛋白成分的促进

利用大鼠甲胎蛋白(AFP)基因片段作为模板,分析大鼠肝癌细胞核蛋白成分对体外转录活性的影响,发现大鼠肝癌含有促进AFP基因体外转录的核蛋白。作为对照．没有发现任何成年大鼠肝核蛋白可以促进AFP基因的体外转录。为了确定促进AFP基因体外转录的核蛋白作用部位,对AFP基因模板5＇端上游序列进行了不同程度的删除,进一步分析核蛋白对删掉5’端上游序列后的模板体外转录的影响,结果表明,AFP基因转录的起始点到255bp这段DNA序列是大鼠肝癌核蛋白促进AFP基因转录必不可少的。以SV40DNA经Pst I酶酶切所得的DNA片段(1216bp和4027bp)代替AFP基因片段作为模板,不存在核蛋白促进体外转录的现象。用AFP基因转录的起始点到 255bp这段的DNA为探针,进行Southwestm印迹分析,结果发现了8种与探针结合的核蛋白。     

真核转录因子TFⅡD研究进展

结合转录因子 TFⅡD 结构与功能,论述了 RNA 聚合酶Ⅱ是如何从一个特异基因的转录起始点起动转录的.转录因子 TFⅡD 是一种序列特异的 DNA 结合蛋白因子,它首先与含 TATA 的启动子形成前起始复合物,后者指导 RNA 聚合酶Ⅱ和其它基本转录因子最终组装成转录起始复合物.很多转录激活因子均通过与 TFⅡD 相互作用,控制转录起始复合物的组装或影响其稳定性,调节基因转录.因此,TFⅡD是一种极其重要的基本转录因子.     

DNA聚合酶与引物/模板的相互作用对PCR效率的影响

PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。传统的PCR引物设计软件基本上忽略了DNA聚合酶与引物/模板的亲和性对PCR效率的影响。为揭示DNA聚合酶与引物/模板的相互作用是否对PCR的效率有影响,通过构建Taq DNA 聚合酶与不同序列引物/模板DNA相互作用的三维结构模型,采用MM/GBSA方法计算复合物的结合自由能,以结合自由能为参数,为人血清白蛋白基因(Human Serum Albumin gene,HSA gene)和结核杆菌pyrF基因(Mycobacterium tuberculosis pyrF gene)设计了PCR引物。PCR实验结果表明,引物的PCR效率与结合自由能相关：引物与聚合酶的结合自由能越低,PCR实验的效率相对越高。这说明DNA聚合酶与引物/模板的相互作用对PCR效率有重要影响。因此,引物/模板DNA与聚合酶的结合自由能可以作为PCR引物设计的新参数。     

多胺在体外转录中的作用

多胺(包括精胺、精脒及腐胺等),广泛存在于动物、植物、微生物及病毒中。许多研究表明,多胺在生命过程中起重要作用。从分子生物学角度看,多胺对于DNA复制,基因表达的转录和翻译有重要的调节作用。不少人研究过多胺对DNA体外转录的调节作用,并企图了解它们影响转录的机理。本文试比较多胺对不同来源的RNA聚合酶进行体外转录的影响,以及用不同的RNA聚合酶转录不同构象的DNA模板时多胺的调节作用,以便