携带PTEN基因的重组腺病毒表达载体构建的研究

构建携带抑癌基因PTEN(Phosphatase and temin homolog deleted on chromosome ten)的重组腺病毒表达裁体,为研究PTEN的功能和作用机制奠定基础.采用RT-PCR法从大鼠海马神经元扩增目的基因PTEN,克隆人含绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein),GFP基因的pAdTrack-CMV穿梭质粒,在含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌内进行同源重组;获得重组腺病毒质粒,经Pacl线性化后,转染AD293细胞.结果表明,感染腺病毒载体的AD293细胞表达GFP基因,随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE),经PCR对传代的Ad-PTEN分析证实得到目的基因.成功构建了携带PTEN基因的腺病毒表达载体,为研究PTEN的功能和作用机制奠定了基础.     

脂肪储存小滴蛋白5重组腺病毒的制备

目的：利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5（LSDP5）基因的重组腺病毒。方法：从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果：LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论：成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。     

HAX1和EGFP共表达重组腺病毒载体的构建、鉴定

目的构建和鉴定HAX1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体。方法采用DNA重组技术,将目的基因HAX1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒pAdTrack—CMV中,并转化于大肠埃希菌DH5a;筛选出重组质粒pAdTrack—CMV—HAX1,并在BJ5183细菌中与pAdEasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体;用lipofectamine将其转染HEK293细胞,包装携带全长HAX1的重组复制缺陷型腺病毒pad—HAX1-EGFP,酶切和序列测定鉴定;用制备好的Ad—HAX1-EGFP感染HEK293细胞,流式细胞术检测其感染效率,RT—PCR、Western印迹鉴定外源基因HAX1的表达。BrdU检测感染了Ad—HAX1-EGFP的HEK293细胞增殖情况。结果pAdTrack—CMV—HAX1重组质粒构建成功。pAdTrack—CMV—HAX1质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后与预期结果相符。构建好的Ad—HAX1-EGFP能有效感染HEK293细胞;外源基因能在239细胞中有效表达。HAX1高表达的HEK293细胞其增殖率得以提高。结论成功构建了表达HAX1和EGFP共表达的重组腺病毒载体,HAX1能够促进结肠癌细胞HEK293细胞的增殖。     

脂肪储存小滴蛋白5 重组腺病毒的制备

目的:利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5(LSDP5)基因的重组腺病毒。方法:从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果:LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论:成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。     

构建MicroRNA-29a和microRNA-29c腺病毒并探讨其对膀胱癌细胞增殖能力的影响

构建miRNA-29a/c的重组腺病毒并观察其对膀胱癌T24细胞增殖能力的调控。以人全基因组DNA为模板,PCR扩增miR-29a、miR-29c,克隆至腺病毒穿梭载体pAdtrace-TO4-CMV。重组穿梭载体经pme I线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化感受态大肠杆菌BJ5183,通过同源重组获得重组腺病毒质粒pAdEasy-1-miR-29a、pAdEasy-1-miR-29c,pac I线性化后转染HEK-293细胞,进行包装和扩增。实时荧光定量PCR检测感染腺病毒的膀胱癌T24细胞中miR-29a、miR-29c的表达水平,并利用CCK-8实验检测细胞增殖能力。经DNA测序和限制性内切酶分析显示,重组腺病毒质粒pAdEasy-1-miR-29a、pAdEasy-1-miR-29c构建成功;感染腺病毒Ad-miR-29a和Ad-miR-29c后,经实时荧光定量PCR检测,膀胱癌细胞中miR-29a、miR-29c表达显著增高(P0.01);过表达miR-29a/c后的CCK-8实验显示,细胞增殖能力明显低于对照组(P0.05)。以上说明已成功构建miR-29a、miR-29c腺病毒,过表达miR-29a/c可抑制膀胱癌细胞的增殖。     

腺病毒介导重组hKGF基因转染HaCat细胞及其表达

将PCR扩增得到的人角质细胞生长因子（hKGF）基因片断插入穿梭载体pAdTrack-CMV,产生重组质粒pAdTrack-CMV-hKGF,经Pme I线性化后,通过电转法导入含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183进行同源重组,得到重组腺病毒质粒pAdEasy-hKGF。采用Lipofectamine 2000将pAdEasy-hKGF转染到HEK-293细胞,在HEK-293细胞中包装并扩增出大量的腺病毒,经PCR鉴定含有hKGF基因。获得的重组hKGF腺病毒感染颗粒可高效感染HaCat细胞。Western-blot结果显示,重组腺病毒感染的HaCat细胞可分泌表达hKGF蛋白。     

丙型肝炎病毒重要编码蛋白重组腺病毒载体的构建

旨在构建含HCV core、E1、E2、F、NS3、NS5a和NS5b基因的重组腺病毒载体。运用PCR技术扩增目的基因片段,通过酶切连接方法将上述7种基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-TO4中,然后将重组质粒用PmeⅠ线性化后与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌中同源重组。用PacⅠ酶把重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞后产生重组腺病毒颗粒。利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP对其感染效率进行监测。结果显示,酶切鉴定和测序结果均证实含core、E1、E2、F、NS3、NS5a和NS5b基因的重组腺病毒构建成功,在感染的Huh7细胞中观察到绿色荧光蛋白GFP。成功制备了高滴度的腺病毒Ad-core、Ad-E1、Ad-E2、Ad-F、Ad-NS3、Ad-NS5a和Ad-NS5b,为后续研究奠定了基础。     

H5N1禽流感病毒HA和NA基因重组腺病毒共表达载体的构建

利用口蹄疫病毒(FMDV)2A蛋白具有自我裂解的功能,将其作为连接肽构建携带有H5N1亚型AIVHA和NA基因的重组腺病毒表达载体,进而为AIV基因工程疫苗的开发以及相关诊断试剂的开发提供依据。采用融合PCR的方法扩增出含有H5N1 AIV HA-2A-NA的基因,定向插入pAdtrack-CMV腺病毒穿梭质粒中,含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-HA-2A-NA与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在基因工程菌BJ5183中进行同源重组,获得腺病毒质粒pAdeasy-HA-2A-NA,将pAdeasyd-H5经PacI线性化后转染HEK293细胞株包装出含有HA-2A-NA基因的腺病毒pAd-HA-2A-NA。结果表明,构建的含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-HA-2A-NA和含有目的基因的腺病毒质粒pAdeasy-HA-2A-NA经PCR、双酶切及核苷酸测序测定无误。线性化后的pAdeasy-HA-2A-NA转染HEK293细胞包装成功获得腺病毒pAd-HA-2A-NA载体,经绿色荧光蛋白和RT-PCR分析证实,目的基因在该细胞中成功表达。本试验构建的含有AIV H5N1亚型HA-2A-NA基因的重组腺病毒表达载体,将为进一步研究开发基因工程疫苗提供病毒模型。     

人RARα基因重组腺病毒表达质粒的构建及其对人白血病NB4细胞的影响研究

利用AdEasy系统构建携带人RARα基因的重组腺病毒表达质粒,感染人白血病NB4细胞后用生理浓度的维甲酸诱导,观察其对NB4细胞增殖和分化的影响。以急性早幼粒细胞株NB4的cDNA为模板,PCR扩增RARα基因,克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TO4-RARα。用EcoR V和Sal I双酶切及测序鉴定,然后与骨架质粒AdEasy-1同时转化大肠杆菌BJ5183菌株的感受态,经同源重组获得重组腺病毒质粒Ad-RARα。酶切验证后,Pac I酶线性化后转染AD293细胞,包装出重组腺病毒Ad-RARα,经3轮扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。流式细胞术测定病毒感染效率,Western blot法检测重组腺病毒感染的人NB4细胞中RARα蛋白和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达,CCK-8法检测重组腺病毒感染对NB4细胞增殖的影响,Annexin V/PI双染法测定细胞周期,PI测定细胞凋亡。重组腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TO4-RARα经双酶切及测序证明构建正确,病毒感染效率可达70%,与空载体感染及未感染的NB4细胞相比,重组腺病毒感染的NB4细胞内RARα蛋白的表达明显升高(P0.05),且经生理浓度全反式维甲酸ATRA处理后,能够有效地促进感染重组腺病毒细胞的分化成熟和凋亡。该研究成功构建了携带人RARα基因的重组腺病毒表达质粒,感染NB4细胞后可促进细胞增殖,经生理浓度维甲酸诱导后能促进NB4细胞分化成熟和凋亡,为进一步研究该基因在急性髓细胞白血病发生发展中的作用奠定了基础。     

应用Ad Easy载体系统构建人β2-AR基因重组腺病毒

目的:利用Ad easy腺病毒表达系统构建含人β2-肾上腺素能受体(β2-AR)基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒.方法:将β2-AR全长cDNA插入到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,构建pAdTrackCMV-β2AR重组质粒,经PmeI酶切线性化后经电击法转入含Ad easy质粒的电感受态菌BJ5183进行重组.挑选同源重组质粒,Pac I酶切线性化转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒.将重组病毒和SD大鼠心肌细胞共培养,western-blot检测β2-AR的表达.结果:琼脂糖凝胶电泳显示在1242bp处有特异性条带后被克隆至腺病毒穿梭质粒.重组穿梭载体经Hind Ⅲ和Xba Ⅰ限制性酶切可以得到目的条带并经测序证实.电击法转化BJ5183所得候选重组子经PacⅠ酶切后得到30Kb腺病毒基因组片段和4.5Kb氨苄抗性片段,证实获得同源重组质粒.转染293细胞可以看到绿色荧光蛋白,以MOI100转染SD大鼠心肌细胞发现携带β2-AR的腺病毒可以在心肌细胞中过表达.结论:利用新型腺病毒载体在短时间内成功构建了携带有人β2-AR基因的腺病毒,为进一步研究人β2-AR基因治疗奠定了基础.     

I型单纯疱疹病毒胸苷激酶真核表达载体的构建及其表达鉴定

为构建单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV1TK)的真核表达载体pcDNA3.1-EGFP/HSV1TK,鉴定其在真核细胞中的表达和功能.以pORF-HSV1TK为模板,PCR扩增的目的基因HSV1TK片段与pMD18-T载体相连接构建重组克隆pMD18-T/HSV1TK.再双酶切出HSV1TK片段,插入pcDNA3.1-EGFP多克隆位点,构建pcDNA3.1-EGFP/ HSV1TK真核表达载体并进行酶切、测序鉴定[1].分别用荧光显微镜观察和RT-PCR方法检测脂质体介导pcDNA3.1-EGFP/ HSV1TK在卵巢癌细胞SKOV3的表达;分别用MTT法和光镜检测胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV1TK/GCV)系统对SKOV3体外杀伤作用及旁观者效应.结果表明,重组载体酶切鉴定结果与预期结果一致,基因序列与GenBank上报道的HSV1TK基因序列完全一致.荧光显微镜观察转染后的细胞发出绿色荧光;RT-PCR结果表明HSV1TK基因能在SKOV3内有效表达.MTT和光镜结果显示转染HSV1TK基因的SKOV3细胞,加入前体药物丙氧鸟苷(GCV)处理后对其有明显的杀伤作用和旁观者效应.成功构建的真核表达载体pcDNA3.1-EGFP/ HSV1TK能在SKOV3细胞中稳定表达,且HSV1TK对卵巢癌细胞株SKOV3体外有强大的杀伤作用和旁观者效应.     

TMV复制酶基因靶向的RNA干涉载体构建

以TMV复制酶基因作为RNAi的靶向序列,应用RT－PCR法获得目的DNA序列。依据RNAi机制,以酶切后连接的方法将目的DNA序列正向、反向锚定连接到pUCCRNAi载体质粒,构建含目的序列反向重复结构的RNA干涉中间载体;反向重复结构酶切后插入含超强启动子的pC2300-35s-OCS表达载体,重组的表达载体质粒经冻融法转化到只含辅助质粒的根癌农杆菌中,完成双元载体系统的构建。每步的重组子经特异引物PCR验证和酶切验证有相应的特异条带存在,且测序鉴定序列正确。确认成功构建了TMV复制酶基因靶向的RNAi双元载体,为RNAi技术在植物病毒病害防治中的应用奠定基础。     

山梨糖脱氢酶基因在大肠杆菌染色体上整合及表达

以质粒pKF3为模板,扩增出两翼与ptsG基因上下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因的DNA片段,连至pMD18T载体,构建得到pMD18PC。以质粒pQE60SDH为模板,扩增山梨糖脱氢酶基因sdh,与pMD18PC连接,得到pMD18PCSDH。将其用PvuⅡ酶切,回收含ptsG1catsdhptsG2的目的片段,电转化至JM109/pKD46,在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与染色体上对应区域发生同源重组,将基因ptsG敲除,替换为catsdh基因,获得整合sdh基因的JM109s。经检测JM109s具有山梨糖脱氢酶活性。以 ptsG基因上下游序列为引物,JM109s基因组DNA为模板进行PCR,扩增产物测序结果表明sdh基因染色体整合成功。     

CBF4基因植物表达双元载体的构建

目的:对拟南芥CBF4基因序列进行克隆.方法:用限制性内切酶将CBF4基因从pMD18-T CBF4载体上切下,定向连接到含超强启动子的pC2301-35S-OCS表达载体上,成功构建了CBF4基因植物表达载体pC2301-35S-OCS-CBF4.利用冻融法将此表达载体导入只含辅助质粒的根癌农杆菌中,提取转化质粒,经PCR扩增和酶切验证鉴定表明.结果:CBF4基因植物表达双元载体构建成功.结论:转CBF4基因烟草的抗寒性比野生型烟草要高.     

胰蛋白酶抑制剂基因siRNA表达体系的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因KSTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654bp,与已发表的KSTI3基因序列同源性达99%。将反义 正义基因片段插入到pBI121 35S启动子下,构建重组质粒pBIKSTI3。通过冻融法将该重组质粒转入农杆菌EHA105中,获得了siRNA表达体系。利用农杆菌介导法将带有pBIKSTI3的菌株转化大豆,从2棵再生植株中得到2 100bp的特异性扩增条带,而未转化的植株中无该片段的产生。     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

甲酸脱氢酶在Klebsiella pneumoniae中的表达和功能分析

在甘油厌氧发酵生产1,3-丙二醇的过程中,需要消耗还原当量NADH,NADH的有效供给决定了1,3-丙二醇的产量和得率。采用PCR方法从Candidaboidinii基因组中克隆编码甲酸脱氢酶基因fdh,将fdh基因片段插入载体pMALTM-p2X中,构建表达载体pMALTM-p2X-fdh,并转入1,3-丙二醇生产菌Klebsiella pneumoniae YMU2,获得重组菌Klebsiella pneumoniae F-1。研究了重组质粒的稳定性和IPTG诱导fdh基因过量表达的条件。结果表明,重组质粒具有良好的稳定性;fdh基因表达的蛋白分子量为40.2kDa;IPTG诱导表达研究表明,在IPTG浓度为0.5mmol/L时,诱导4h后甲酸脱氢酶表达明显;发酵过程中甲酸脱氢酶比酶活达到5.47U/mg;与出发菌株K.pneumoniae YMU2相比,重组菌F-1合成1,3-丙二醇的浓度提高了12.5%。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因在毕赤酵母中克隆与分析

目的:克隆丙型肝炎病毒核心蛋白基因及其上游DNA序列,为此基因的表达研究作准备。方法:用反转录和PCR方法从HCV的总RNA中扩增得到核心蛋白基因及其上游DNA序列,连接到pMD18-T载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成重组质粒,测序证明正确后,再将目的基因在毕赤酵母中进行克隆,鉴定。结果:重组质粒转化毕赤酵母后,经PCR鉴定,证明形成了目的基因的克隆。结论:应用毕赤酵母作为受体菌,pPIC9K为载体,成功克隆了HCV核心蛋白基因。