EPSP合酶的研究进展

5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase,EPSP合酶)是莽草酸途径中的第六位酶,参与合成芳香族氨基酸以及部分次生代谢的产物,同时EPSP合酶不仅是除草剂草甘膦、抗菌素、抗寄生虫药物的作用靶酶,而且也是促进生物体内莽草酸积累的重要调控位点。近年来,随着分子生物学技术的快速发展和对EPSP合酶的深入研究,EPSP合酶基因在耐草甘膦转基因作物、医药卫生等方面被广泛应用。对EPSP合酶的研究进展进行综述及展望。     

植物遗传学的新进展

Calgene公司在植物遗传工作中连续取得突破性进展。Calgene公司的一个研究小组已经把耐草甘膦的aroA基因转入烟草中,并使它在再生的烟草中成功地获得表达。对经过转化的烟草的分析表明,由改造的aroA基因所产生的酶,其活性相当于在叶片提取物中所测得的EPSP合酶总活性的25％。当对这种转化了的烟草喷施草甘膦时,表现出对这种除草剂的耐受能力明显增强。在这一成功的基础上,Calgene的专家们正着手在更广泛的农作物中进行耐草甘膦的研     

水稻EPSP合酶基因的克隆、结构分析和定位

5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶是芳香族氨基酸合成途径中的一个关键酶, 该基因在植物抗除草剂基因工程中具有重要的应用价值. 根据水稻EPSP合酶基因的EST序列设计探针, 在水稻TAC基因组文库中筛选到16个阳性克隆. 对阳性克隆E11进行亚克隆, 由此获得了由3661核苷酸组成的水稻EPSP合酶基因全序列. 序列分析和同源性比较揭示, 该基因由8个外显子和7个内含子组成. 以窄叶青8号/京系17组合构建的DH群体和分子图谱将水稻EPSP合酶基因定位于水稻第6条染色体的上端.     

核盘菌5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的酶学性质

核盘菌5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSP合酶）是AROM多功能酶的活性之一.该酶催化莽草酸磷酸（S3P）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）产生5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸和无机磷酸的可逆反应,受除草剂草甘膦（N-（膦羧甲基）甘氨酸）抑制.纯化了核盘菌AROM蛋白并对EPSP合酶进行了酶学特征研究.结果显示,该酶反应的最适pH值为7.2,最适温度为30℃.热失活反应活化能是69.62 kJ/mol.底物S3P和PEP浓度分别高于1 mmol/L和2 mmol/L时,对EPSP合酶反应产生抑制作用.用双底物反应恒态动力学Dalziel方程求得的Km(PEP)为140.98 μmol/L,K _m(S3P)为139.58 μmol/L.酶动力学模型遵循顺序反应机制.草甘膦是该酶反应底物PEP的竞争性抑制剂（Ki为0.32 μmol/L）和S3P的非竞争性抑制剂.正向反应受K⁺激活.当［K⁺］增加时,K _m(PEP)随之降低,Km(S3P)不规律变化,而K _i(PEP)随［K⁺］增加而提高.     

菜豆幼苗EPSP合成酶的分离纯化和它的部分性质

利用硫酸铵分级沉淀,SephedexG-50凝胶柱层析,FPLCMono-Q和磷酸纤维素离子层析法从菜豆幼苗中分离提纯了EPSP合成酶。该酶被纯化2961.6倍,比活性达到6219.4nmolmg-1蛋白min-1。该酶分子量经SDS-PAGE检测为51kD,等电点为pH5.7,酶促反应最适pH7.5,最适温度45℃。6.2μmol/L的除草剂草甘膦能抑制EPSP合成酶活性的50%。     

甘薯草甘膦抗性基因EPSPS克隆和序列分析

EPSPS基因编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶,该酶是芳香族氨基酸合成的关键酶,该基因在细菌、真菌、藻类和植物中被广泛克隆和研究。EPSPS酶是草甘膦除草剂的靶点酶,过量表达EPSPS基因可以提高作物的草甘膦抗性。该研究根据甘薯基因组数据库设计引物,以‘广薯87’为材料提取RNA,通过RT-PCR方法扩增甘薯IbEPSPS基因,测序后进行生物信息学分析和表达分析。结果表明:(1)成功克隆获得甘薯IbEPSPS基因,该基因全长CDS为1569 bp,编码522个氨基酸,其中在第98~113、173~183位氨基酸序列具有2个EPSPS的保守结构域。(2)系统进化树分析结果表明,甘薯IbEPSPS基因与三裂叶薯(Ipomoea triloba)、打碗花(Calystegia hederacea)、田旋花(Convolvulus arvensis)和牵牛(Ipomoea nil)聚在一类,其中与三裂叶薯的亲缘关系最近。(3)实时荧光定量PCR分析结果表明,甘薯IbEPSPS基因在茎、叶和茎尖表达量较高,同时受到草甘膦胁迫后IbEPSPS基因表达量提高。该研究结果为进一步探讨甘薯IbEPSPS基因的功能及甘薯对草甘膦的耐药性机制奠定了基础。     

水稻EPSP合酶cDNA克隆、序列分析及其拷贝数测定

根据本室分离的水稻EPSP合酶基因的基因组序列设计一对引物 ,利用RT_PCR方法首次从水稻 (Oryzasati vaL .subsp .indica)叶片的RNA中扩增获得了水稻编码EPSP合酶的全长为 15 85bp的cDNA片段 ,它含有一个完整的开放读码框 ,编码 5 11个氨基酸 ,包括 44 4个氨基酸组成的成熟肽序列以及N端的 6 7个氨基酸组成的叶绿体转运肽序列。成熟肽氨基酸序列对比表明 ,除真菌来源的EPSP合酶变异较大外 ,其他来源的EPSP合酶同源性较高 ,均在 5 1%以上。而叶绿体转运肽氨基酸序列同源性较低。Southern杂交表明水稻EPSP合酶基因在水稻基因组中以单拷贝形式存在。RT_PCR分析表明 ,水稻EPSP合酶基因在根、未成熟种子和叶片中均有转录表达 ,在叶片中表达量最高     

水稻EPSP合酶cDNA克隆、序列分析及其拷贝数测定

根据本室分离的水稻EPSP合酶基因的基因组序列设计一对引物,利用RT-PCR方法首次从水稻(Oryza sativa L. subsp. indica)叶片的RNA中扩增获得了水稻编码EPSP合酶的全长为1 585 bp的cDNA片段,它含有一个完整的开放读码框,编码511个氨基酸,包括444个氨基酸组成的成熟肽序列以及N端的67个氨基酸组成的叶绿体转运肽序列.成熟肽氨基酸序列对比表明,除真菌来源的EPSP合酶变异较大外,其他来源的EPSP合酶同源性较高,均在51%以上.而叶绿体转运肽氨基酸序列同源性较低.Southern杂交表明水稻EPSP合酶基因在水稻基因组中以单拷贝形式存在.RT-PCR分析表明,水稻EPSP合酶基因在根、未成熟种子和叶片中均有转录表达,在叶片中表达量最高.     

耐草甘膦菌株Pantoea rodasii S1536全基因组测序及比较基因组分析

耐草甘膦菌株泛菌属S1536 (Pantoea rodasii S1536)是从草甘膦污染土壤中分离筛选出来的一种革兰氏阴性菌,对草甘膦的抗性能高达400 mmol/L。本研究首次通过PacBio RSII平台对泛菌属S1536进行全基因组测序,使用SMRT portal软件对reads进行组装,获得10个contigs,最终获得高质量且无间隔的泛菌属S1536基因组包含1条染色体和2个质粒,序列全长为5.16 Mb,其GC含量为55.16%。本研究进一步对基因组序列进行基因预测与功能注释、COG和GO聚类分析,预测了次级代谢产物合成基因簇及草甘膦抗性机制,最终得到编码基因有4 843个,4 656个蛋白获得COG功能注释,预测到2个NRPS类基因簇、1个thiopeptide类基因簇和1个hserlactone-arylpolyene类基因簇。莽草酸代谢途径关键酶EPSP合酶基因分析表明,泛菌属S1536中的EPSP合酶属于ClassⅠ型EPSPS。根据已报道的3株同一种Pantoea rodasii strain ND03、Pantoea rodasii strain DSM 26611和Pantoea rodasii strain LMG 26273的基因组信息进行全基因组关联比较分析,结果显示4株菌虽然属于同一种,但在进化中产生了较大差异。相关研究结果将为泛菌属S1536功能基因组学研究、耐除草剂机制的研究及耐除草剂基因的挖掘提供基础数据。     

草苷膦抗性新基因的克隆、序列分析及其蛋白高级结构预测

利用错误倾向PCR（error-prone PCR）突变技术,以可变盐单胞菌（Halomonas variabilis）HTG7的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶基因为模板进行随机PCR扩增,得到目的基因片段（约1.35 kb）.将该基因片段与pACYC184载体连接后转化EPSP合酶缺陷型菌株大肠杆菌ER2799.利用功能互补筛选法得到了2株不具有草苷膦抗性的EPSP合酶阳性克隆突变株,记为Pmu1和Pmu2.序列分析表明,突变体Pum1的EPSP合酶编码区与突变前基因相比,核苷酸有2处发生突变,导致氨基酸残基1处发生了改变;突变体Pmu2的EPSP合酶编码区与突变前基因相比,核苷酸有5处发生突变,导致氨基酸残基2处发生了改变.对突变前后EPSP合酶进行比较预测发现,其三级结构及蛋白中心骨架是大致相同的,但突变前后氨基酸位点肽平面和Cα相连的N键之间形成的扭转角度存在一定的差别.这些结果表明,酶的功能主要由蛋白的构象决定,二肽链形成后肽平面和N键之间角度的变化,造成高级结构构象细微的差别,致使草苷膦抗性功能丢失.     

植物莽草酸途径EPSPS蛋白的分子进化和基因结构分析

EPSPS既是植物、微生物和真菌等生物芳香族氨基酸生物合成途径——莽草酸途径中的关键酶,也是除草剂草甘膦的靶标酶。EPSPS的克隆能为草甘膦抗性转基因作物的研发提供候选基因。该研究运用比较基因组学方法,通过对41种不同植物的43条EPSPS蛋白序列进行进化分析,取得主要结果如下:(1)不同植物EPSPS蛋白的相似性很高,且具有相同的结构域、保守基序和保守位点,但是其叶绿体转运肽序列差异显著;(2)系统发育分析表明,EPSPS基因按照双子叶植物纲和单子叶植物纲分为2个大的分支,各个小的分支又按照植物的种属亲缘关系进行分支和聚类;(3)基因结构分析表明,植物EPSPS基因基本都含有8个外显子和7个内含子,且所对应外显子的长度相当,而内含子的长度差异很大,说明在植物基因组进化过程中造成EPSPS基因结构差异的主要因素是内含子的改变。研究结果将为揭示植物EPSPS蛋白的结构功能提供参考。     

棉花品系Ｙ18对草甘瞵应激反应机理的研究

5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase, EPSPS）是植物和微生物体内合成芳香族氨基酸所必需的一个关键酶,但此酶受广谱性除草剂草甘膦的强烈抑制。本试验对草甘膦胁迫下的棉花品系（Y18）研究发现：棉花品系Y18具有两个不同的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因epsps1和epsps2,两个基因的编码区与其他植物的epsps基因具有较高的同源性,在草甘膦胁迫作用下,棉花的epsps1基因表达较为稳定,epsps2基因表达提高了1.85-2.3倍,初步认为epsps基因表达量的提高是生物对胁迫作用的一种应激反应。     

低聚糖诱导小麦抗条锈性及相关酶活性变化的研究

用自行设计的方法从植物细胞壁中得到的低聚糖提取物5号对小麦浸种和苗期喷雾处理,均使接种条锈菌的小麦叶片产生了明显的过敏性坏死反应。对几种与抗病性密切相关的酶活性变化的分析表明,经低聚糖预先处理能显著提高小麦叶片的过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨基酸解氨酶(PAL)的活性。     

棉花品系Y18在草甘膦胁迫下的epsps基因表达分析研究

5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase,EPSPS）是植物或微生物体内合成芳香族氨基酸所必需的一个关键酶,但其受广谱性除草剂草甘膦的强烈抑制。通过对草甘膦胁迫下的棉花品系Y18进行研究发现：棉花品系Y18具有两个不同的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因epsps1和epsps2,并且两个基因的编码区与其他植物的epsps基因具有较高的同源性,在草甘膦胁迫作用下,棉花的epsps1基因中表达较为稳定,epsps2基因表达量却提高了1．85～2．3倍,初步认为epsps基因的表达量提高是生物在受到胁迫作用时的一种应激反应。     

植物几丁质酶的生物功能

几丁质酶(ＥＣ3.2.1.14)是一种能降解几丁质(Ｎ乙酰氨基葡萄糖线性聚物)的糖苷酶。已经发现多种微生物、动物、植物都可产生几丁质酶。就植物而言,几丁质酶不仅存在于被子植物的双子叶植物和单子叶植物,而且也存在于裸子植物及蕨类植物中[1]。在植株中,几丁质酶可分布于根、茎、叶、花器、果实、种子诸器官。种子、根、花器中的几丁质酶含量一般较其它器官高。在正常情况下,植物中几丁质酶活性较低,但经诱导因子诱导,活性会迅速升高。真菌、细菌、病毒的侵染,真菌和植物细胞壁的组成成分,多糖等诱导物,伤害,乙烯,有机分子如水杨酸、氨基酸类…     

Calgene公司遗传工程西红柿减少软化

Calgene 公司应用重组 DNA 技术生产了一种西红柿,使公司进一步扩展。在重组植物中,有效地阻碍了编码一关键酶(包括软化、多聚半乳糖醛酸酶)的基因表达。这种酶在水果成熟期一旦产生就开始分解水果组织。该研究是由 Campbell Soup 公司发起的。延长贮存期意味着西红柿加工厂家能省下一大笔钱。这是第一次遗传工程为加工者获取利润的一种蔬菜。但是,在将来,运用各种蔬菜时,获取的利润将更大。传统的植物育种     

沙田柚无机焦磷酸酶基因的cDNA克隆及序列分析

植物自交不亲和性是植物生殖过程中普遍存在的一种现象,是植物特异性识别并拒绝自身花粉或亲缘关系很相近的花粉的一种遗传机制。无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase,IPPase)在植物生长发育方面起重要作用。该研究根据沙田柚花柱消减文库中EST序列(无机焦磷酸酶基因内部片段),设计了2对特异引物5'-GSP1,5'-n GSP1,3'-GSP2 and 3'-n GSP2,通过SMART-RACE PCR技术从所构建的沙田柚花柱抑制性消减文库中克隆了沙田柚无机焦磷酸酶基因的c DNA全长序列,利用Blastn、DNAman和Expasy软件对所克隆的基因进行同源性分析,以及基因编码的氨基酸的分子量、等电点、疏水性等理化性质分析。结果表明:IPPase基因c DNA全长为1 136 bp(Gen Bank登录号为KF990474),开放阅读框(ORF)全长为654 bp,共编码217个氨基酸,包括170 bp 5'UTR和312 bp的3'UTR;编码的蛋白质的分子量为24.4 k Da,等电点为5.96;蛋白结构域分析显示沙田柚IPPase与焦磷酸酶具有相同的保守结构域;对沙田柚IPPase蛋白质序列进行疏水性分析,结果表明沙田柚IPPase基因编码的肽链中疏水性最大值约为3.21,最小值约为-2.98,属于亲水性蛋白,无跨膜区域;Blastn搜索的结果显示,沙田柚IPPase基因序列与多种植物的IPP基因高度同源;序列分析表明,沙田柚IPPase基因核苷酸的同源性与毛果杨(Populus trichocarpa)和橡胶树(Hevea brasiliensis)IPPase基因均为87%;氨基酸序列与克莱门柚(Citrus clementina)无机焦磷酸酶完全一致。该研究结果可为深入研究无机焦磷酸酶在沙田柚自交不亲和中的作用机理提供基础。     

豇豆几丁质酶N端序列测定及与其它植物的比较

通过自动 Edman降解程序 ,测定了经诱导、纯化的豇豆几丁质酶 N端 1 0个氨基酸的序列 ,并将该序列与其它植物几丁质酶 N端相应部分的氨基酸序列进行了比较分析。结果表明 ,该豇豆 ( Vigna sesquipedalis)几丁质酶 N端 1 0个氨基酸的序列为 EQCGSQAGGA,与 类几丁质酶同一部分同感序列同源性高达 1 0 0 % ;而与 、 及 类几丁质酶的相应序列均无同源性。结合考虑此酶的等电点 ( 8.3)及分子量 ( 33k D) ,可推测该豇豆几丁质酶属于 类几丁质酶。其 N端序列的高度保守性提示 ,该段序列可作为 类几丁质酶的一段主要特征序列 ,并可据其合成核酸探针 ,以分离、克隆其它 类几丁质酶编码基因。     

Calgene正在揭示植物对除草剂的抗性

<正> 通过遗传操作使植物对除草剂产生抗性已越来越接近现实。以Calgene公司(戴维斯,加利福尼亚)Luca Comai为首的研究人员为了使植物对除草剂草甘膦产生抗性,利用根癌土壤杆菌中的Ti质粒把aroA基因转移到烟草细胞中,并利用这些细胞再生出抗除草剂的植株。据Calgene公司的Robert Good man说,在农场发现的那些再生烟草植株中,实际上只     

草甘膦对茶树叶片主要生化成分的影响

以金观音茶树为试材,将草甘膦定量施于栽培基质,通过观察叶片的表观药害,并采用超高效液相串联质谱方法测定草甘膦施用前(0天)和施用后(7天和33天)叶片中的农药残留(草甘膦及氨甲基膦酸)及生化成分(游离氨基酸、儿茶素和生物碱)的含量变化,从而科学地评估草甘膦的使用对茶叶质量安全的影响。结果表明:草甘膦施用33天,茶树叶片未见明显药害表征,但可检测到草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸;草甘膦施用后,游离氨基酸和儿茶素总量降低,生物碱总量先升后降;多元统计分析表明,草甘膦施用前后样品组间的茶氨酸、咖啡碱、表没食子儿茶素没食子酸酯、谷氨酰胺、表儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和表没食子儿茶素含量存在显著差异。综上,茶园草甘膦的施用不易使茶树叶片产生明显的药害表征,但可在茶树叶片中残留较长时间,并显著改变茶树叶片中游离氨基酸、儿茶素和生物碱类化合物的含量。因此,建议茶园尽量不使用草甘膦除草剂。