供体特异输注及FK506对同种异体小鼠心脏移植急性排斥反应的影响

目的:探讨供体特异输注(donor-specific transfusion,DST)及不同剂量FK506对同种异体小鼠心脏移植的影响.方法:应用显微外科技术制作颈部移植心脏急性排斥反应小鼠模型,将移植受体小鼠分为4组:对照组(单纯移植组,未加DST),DST 移植组,DST 移植 FK506(2meg/(kg·d))组,DST 移植 FK506(0.3mg/(kg·d))组,比较各组移植心脏生存时间,心肌病理改变及外周血血清细胞因子水平:血清IL-2,IL-4,IL-10和IFN-γ水平.结果:术前1天应用DST与连续应用较小剂量FK506可显著延长移植物存活.术后第七天病理检查发现联合应用DST和FK506的两组移植物急性免疫排斥反应明显比其他两组减轻.血清中IL-2和IFN-γ水平在联合应用DST和FK506的两组明显低于其它两组,IL-4和IL-10水平在联合应用DST和FK506的两组高于对照组和DST 移植组.结论:术前DST及持续应用较小剂量FK506可有效抑制同种异体小鼠颈部心脏移植术后急性排斥反应,显著延长移植物的生存时间.     

抑制营养缺乏自噬因子1表达对肝癌LM3细胞增殖的影响

目的探讨以透明质酸-聚乙烯亚胺/透明质酸-聚乙二醇(HA-PEI/HA-PEG)作为基因载体传递NAF1-siRNA对人肝细胞LM3进行增殖能力抑制的效果。方法将纳米复合物HA-PEI/HA-PEG与NAF1-siRNA复合,转染LM3细胞建立HNS组,等量NAF1-siRNA转染建立NSI组,另设未转染对照对照组,等量HA-PEI/HA-PEG干预细胞建立HAH组。采用荧光实时定量PCR检测细胞NAF1 mRNA的表达水平,采用Western blotting法检测NAF1、cyclin D1蛋白表达。采用MTT实验和平板克隆形成实验检测细胞增殖抑制效果。4组比较采用单因素方差分析,两两比较采用t检验。结果以对照组NAF1 mRNA的相对表达量为100﹪进行检测。HNS组NAF1 mRNA的相对表达量为(2.12±0.17)﹪,与对照组相比,差异具有统计学意义(t=14.17,P=0.04)。HNS组LM3细胞的NAF1蛋白和Cyclin D1蛋白的相对表达量分别为0.07±0.01、0.06±0.00,而对应蛋白在对照组LM3细胞中的相对表达量分别为0.37±0.08、0.16±0.03,差异具有统计学意义(t=37.72,20.96,P=0.01,0.03)。HNS组细胞测得的细胞增殖抑制率为(73.20±0.43)﹪,与对照组的(0.49±0.02)﹪相比差异具有统计学意义(t=11.92,P=0.01)。HNS组LM3细胞的平板克隆形成率(8.35±0.33)﹪明显低于对照组的(23.61±0.10)﹪(t=17.75,P=0.00,0.02)。结论纳米复合物HA-PEI/HA-PEG可高效递送NAF1-si RNA,对肝癌LM3细胞进行转染,抑制NAF1表达,进而通过降低Cyclin D1表达水平抑制肝癌细胞LM3的增殖。     

蜡样芽胞杆菌在双歧杆菌四联活菌片治疗小鼠腹泻中的作用研究

目的研究双歧杆菌四联活菌片中的蜡样芽胞杆菌对小鼠腹泻治疗作用的影响。方法将SPF小鼠采用抗生素联合伤寒沙门菌和志贺菌诱导建立腹泻模型,取112只造模成功后的小鼠随机分为7组,其中三组分别喂养3种不同剂量的四联活菌片,三组分别喂养3种不同剂量的不含蜡样芽胞杆菌的三联活菌片,余下一组为对照组灌胃生理盐水。比较各组小鼠腹泻的治愈时间,测定粪便菌群、结肠组织耗氧能力及氧化还原电势、肠内sIgA含量及脾脏指数变化。结果相同剂量条件下,含蜡样芽胞杆菌的四联活菌片治愈腹泻时间比三联活菌片缩短48~72h。治疗48h后,四联活菌片组肠内sIgA水平明显增加,与三联活菌片组相比差异有统计学意义(t=5.5783,P=0.0002);治疗结束后,四联活菌片组的脾脏指数也显著高于三联活菌片组(t=18.8648,P=0.0001)。结论含蜡样芽胞杆菌的四联活菌片对小鼠腹泻的治疗及肠道菌群的恢复作用比三联活菌片效果更佳,能显著促进腹泻小鼠肠黏膜局部免疫力的提高。     

骨髓间充质干细胞对器官移植中记忆性T细胞的影响

探讨骨髓间充质干细胞在器官移植中记忆性T淋巴细胞功能的影响。通过同种异基因皮肤移植的方法诱导CD8~+记忆性T淋巴细胞的产生,在体外应用混合淋巴增殖实验观察骨髓间充质干细胞对经过刺激后的T细胞增殖情况的影响;另一方面,通过同种异基因小鼠心脏移植模型的建立,在体内验证和观察骨髓间充质干细胞对小鼠移植器官生存寿命的影响。骨髓间充质干细胞在混合淋巴增殖实验中,可以有效抑制CD8~+记忆性T淋巴细胞的增殖能力,实验组淋巴细胞增殖指数明显低于对照组(t=4.575,p0.05);在小鼠心脏移植模型中,输注骨髓间充质干细胞后移植心脏的生存寿命明显增加,差异有统计学意义(p0.05)。骨髓间充质干细胞能够有效抑制器官移植中CD8~+记忆性T淋巴细胞的增殖,诱导免疫耐受,延长异体器官存活时间。     

LC3基因沉默对小鼠肝癌细胞Heap1-6凋亡影响的研究

目的建立小鼠LC3基因沉默的Heap1-6稳定表达细胞系,探讨其对衣霉素诱导的肝癌细胞凋亡的影响。方法设计并合成一段针对小鼠LC3基因的shRNA及不针对任何基因的shRNA作为阴性对照,将它们退火后连接构建重组载体,转化扩增及酶切鉴定之后将重组质粒与病毒包装、包膜质粒共同转染293T,收集病毒上清转染Heap1-6细胞,嘌呤霉素筛选10 d,获得稳定的细胞株。以导入LC3基因shRNA的Heap1-6为实验组(Heap1-6 sh LC3),以导入shcoo2的Heap1-6为对照组(Heap1-6 shctrl)。衣霉素处理实验组和对照组的细胞,Western Blot检测LC3Ⅱ、c-Caspase3、Caspase9蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡。Western Blot条带灰度值之间两组比较采用独立样本的t检验。结果成功构建了pLKO.1-sh LC3重组慢病毒载体,与野生型的Heap1-6相比,LC3基因沉默之后,LC3Ⅱ蛋白表达水平降低了62.9﹪(P0.01);野生型的Heap1-6和LC3基因沉默之后的Heap1-6 sh LC3都经Tm处理12 h之后,后者LC3Ⅱ蛋白表达水平降低了58.6﹪(P0.01)。与对照组Heap1-6 shctrl相比,衣霉素作用12 h后实验组Heap1-6 sh LC3 c-Caspase3增加了37.7﹪(P=0.007),Caspase9增加了37.1﹪(P=0.023));衣霉素作用24 h后sh LC3组c-Caspase3增加了12.6﹪(P=0.04),Caspase9增加了14.3﹪(P=0.043)。药物干预12 h和24 h后,Heap1-6 sh LC3组比对照组Heap1-6 shcoo2凋亡比例分别增加22.8﹪和18.6﹪。结论成功建立小鼠LC3基因沉默的Heap1-6稳定表达细胞系,LC3基因沉默促进衣霉素诱导的小鼠肝癌细胞Heap1-6的凋亡。     

可溶性PD-1 和调节性T细胞在肺炎支原体感染和哮喘的实验研究

目的:探讨可溶性PD-1(soluble PD-1,s PD-1)和调节性T细胞(Regulatory T lymphocyte,Treg)在肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae,MP)感染与哮喘模型小鼠关系中的作用。方法:20只BALB/c小鼠随机分为4组(n=5),其中2组建立鸡卵白蛋白(ovalbumin,OVA)致敏哮喘模型,将MP菌液滴入其中1组OVA小鼠和1组对照小鼠,形成OVA致敏并MP感染组,OVA致敏组,MP感染组及正常对照组。采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法分别检测各组小鼠血清、肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid,BALF)中s PD-1的浓度;采用流式细胞术检测脾脏组织中Treg细胞的比例。结果:1与正常对照组相比,OVA致敏并感染MP组、单纯OVA致敏组和单纯MP感染组小鼠血清s PD-1的浓度均升高,差异有统计学意义(P0.05),BALF中的s PD-1的浓度亦增高,但无统计学差异;2与正常对照组相比,OVA致敏并感染MP组、单纯OVA致敏组小鼠的脾脏Treg细胞占淋巴细胞的比例下降,而单纯MP感染组Treg细胞的比例升高,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:s PD-1和Treg细胞可能参与了哮喘小鼠感染MP的发病。     

双歧杆菌对中国对虾原肌球蛋白致敏小鼠的免疫调控作用

【目的】比较研究婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis 13.085)对中国对虾原肌球蛋白致敏BALB/c小鼠预防与治疗过敏反应的差异,探究其对致敏小鼠Treg/Th17细胞平衡及相关细胞因子的影响。【方法】采用硫酸铵盐析及等电点沉淀法纯化中国对虾原肌球蛋白(TM),将中国对虾TM和弗氏佐剂混合液腹腔注射诱发BALB/c小鼠致敏,建立动物过敏模型。将实验小鼠随机分为正常对照组、治疗对照组、双歧杆菌治疗组、预防对照组和双歧杆菌预防组。观察分析小鼠过敏症状(腹泻、肺组织HE染色比较、称重法测定小鼠体重和脾脏脏器系数变化),采用ELISA测定小鼠血清中特异性IgE、IgG2a和组胺的含量,采用流式细胞术测定脾脏T淋巴细胞亚群(Treg、Th17)数量,采用荧光定量PCR测定脾脏中Treg型和Th17型细胞因子和转录因子的表达量。【结果】纯化得到中国对虾原肌球蛋白纯度为84.93%,得率为60.88%。体内试验表明,双歧杆菌治疗组和预防组相比于对照组,腹泻和过敏症状均有明显的缓解;不同时期的双歧杆菌干预均对过敏小鼠肺组织症状有明显的改善作用,且可降低过敏小鼠的脾脏脏器系数。第56天实验周期结束后发现,相比预防对照组和治疗对照组,双歧杆菌预防组和治疗组小鼠血清中特异性IgE和组胺含量显著降低(P0.05),脾脏Treg/Th17比值显著升高(P0.05),Th17型细胞因子IL-17A mRNA表达水平显著降低(P0.01);双歧杆菌治疗组相对于治疗对照组,Treg型细胞因子CD25mRNA表达水平显著升高(P0.01)。此外,双歧杆菌治疗组血清特异性IgE及IL-17A mRNA转录水平显著低于双歧杆菌预防组(P0.05),而Treg/Th17比值及CD25 mRNA转录水平显著高于预防组(P0.05)。【结论】双歧杆菌13.085能有效缓解小鼠过敏症状,且治疗免疫调控效果优于预防效果,其作用可能通过平衡Treg/Th17细胞亚群数量,促进Treg型细胞因子表达而抑制Th17型细胞因子分泌,从而阻断炎性抗体及组胺释放。     

外阴阴道念珠菌病患者血清及分泌物HMGB1、IL-17、IL-23表达水平及临床意义

目的探讨外阴阴道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis, VVC)患者血清及阴道分泌物中高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1,HMGB1)、白细胞介-17(interleukin-17,IL-17)和白细胞介-23(interleukin-23,IL-23)的表达水平及其临床意义。方法选取我院就诊的轻中、重度VVC患者及复发性外阴阴道念珠菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis, RVVC)患者为观察组,同期的正常体检者为对照组,采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测血清及阴道分泌物中HMGB1、IL-17和IL-23水平,并分析各指标之间及其与VVC临床症状严重程度间的相关性。结果本研究共纳入VVC患者105例,其中轻中度VVC组51例、重度VVC组21例、RVVC组33例;对照组39例。血清中,重度VVC组及RVVC组患者HMGB1水平均较对照组高(t=2.971,P=0.008;t=2.365,P=0.005),轻中度及重度VVC组IL-17水平均高于对照组(t=2.370,P=0.024;t=2.987,P=0.008),轻中度及重度VVC组、RVVC组IL-23水平均高于对照组(t=2.948,P=0.008;t=2.955,P=0.008;t=2.940,P=0.009);分泌物中,轻中度及重度VVC组、RVVC组IL-17水平均高于对照组(t=2.273,P=0.029;t=2.097,P=0.049;t=2.075,P=0.046),仅轻中度VVC组IL-23水平高于对照组(r=2.624,P=0.017)。对HMGB1、IL-17进行相关性分析发现,外周血中,HMGB1水平与IL-17、IL-23表达成正相关(r=0.328,P0.001,r=0.172,P=0.04),IL-23水平与IL-17表达成正相关(r=0.689,P0.001);分泌物中,IL-23水平与IL-17表达成正相关(r=0.268,P=0.001);对HMGB1、IL-17、IL-23表达水平与VVC疾病严重程度的相关性分析发现,外周血中,HMGB1水平与疾病严重度成正相关(r=0.286,P=0.001);分泌物中,IL-17水平与疾病严重度成正相关(r=0.273,P=0.001)。结论 VVC患者体内HMGB1、IL-17、IL-23水平上调,且与VVC的严重程度具有相关性,HMGB1、IL-17、IL-23可能参与VVC的发病。     

低聚果糖对溃疡性结肠炎模型小鼠肠黏膜屏障影响的研究

目的探讨低聚果糖对溃疡性结肠炎(UC)模型小鼠肠黏膜屏障的调节作用及可能机制。方法小鼠随机分成3组:正常对照(NC)组、模型(MD)组和低聚果糖(FOS)组,采用葡聚糖硫酸钠制作UC小鼠模型。造模7d同时给予干预治疗,停用造模药物并后续治疗7d。采用细菌定量测定法检测肠道菌群,放射免疫法检测肠黏膜sIgA,ELISA法检测小鼠肠黏膜IL-10、TNF-α和IL-6水平。结果模型组小鼠存在肠道菌群失调(t=2.088,2.036,2.203,2.109,P0.05),其TNF-α、IL-6水平高于正常对照组(t=1.734,1.801,P0.05),肠黏膜sIgA、IL-10低于正常对照组(t=1.820,1.806,P0.05);低聚果糖组肠道菌群失调状况较模型组有所改善,其TNF-α、IL-6水平低于正常对照组(t=1.980,1.816,1.936,1.920,1.969,1.893,P0.05),肠黏膜sIgA、IL-10高于正常对照组(t=1.801,1.796,P0.05)。结论低聚果糖可改善溃疡性结肠炎模型小鼠肠道菌群屏障功能,可以提高肠黏膜sIgA和抗炎细胞因子IL-10的水平并降低致炎细胞因子TNF-α和IL-6的水平,通过调节肠道过度的免疫反应,使免疫屏障功能得到一定恢复。     

丁苯酞联合神经节苷脂对急性重度一氧化碳中毒患者乳酸清除率及免疫T细胞的影响分析

目的探讨丁苯酞联合神经节苷脂对急性重度一氧化碳中毒患者乳酸清除率及免疫T细胞的影响。方法选自第三军医大学第一附属医院2014年6月至2016年6月期间收治的急性重度一氧化碳中毒患者94例,依据随机数字表法分为观察组47例与对照组47例。对照组给予神经节苷脂治疗,观察组在对照组基础上结合丁苯酞治疗。两组疗程均为4周。比较两组治疗疗效、24 h血乳酸清除率、一氧化碳中毒后迟发性脑病(DEACMP)发生率,治疗前后GCS评分和免疫功能指标变化。组间和组内计量资料两两比较采用t检验,等级计数资料的比较采用卡方检验。结果观察组治疗总有效率(93.62﹪)高于对照组(74.47﹪)(c~2=6.425,P0.05);两组患者治疗后GCS评分增加(P0.05);观察组患者治疗后GCS评分(14.23±1.69)分高于对照组(11.35±1.45)分,差异具有统计学意义(t=8.867,P0.05);观察组24 h血乳酸清除率(65.98±4.52)﹪高于对照组(41.39±3.67)﹪,差异具有统计学意义(t=28.954,P0.05);两组治疗后CD3~+、CD4~+、CD4(+CD8~+)增加,而CD8~+降低(P0.05);观察组治疗后CD3~+(62.30±4.19)﹪、CD4~+(62.30±4.19)﹪、CD4~+(CD8~+)(1.64±0.31)﹪高于对照组CD3~+(57.12±3.76)﹪、CD4~+(38.91±3.10)﹪、CD4~+(CD8~+)(1.34±0.24)﹪,而CD8~+(25.78±2.18)﹪低于对照组(29.08±2.31)﹪,差异具有统计学意义(t=6.308、4.755、5.246、7.123,P0.05);观察组DEACMP发生率(4.26﹪)低于对照组(23.40﹪),差异具有统计学意义(c~2=7.231,P0.05)。结论丁苯酞联合神经节苷脂对急性重度一氧化碳中毒患者疗效明显,可提高乳酸清除率,改善患者免疫功能,具有重要研究意义。     

人脐带间充质干细胞对小鼠实验性溃疡性结肠炎的疗效

目的探讨人脐带间充质干细胞移植术对溃疡性结肠炎(UC)小鼠的疗效,以及对血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)水平的影响。方法选用雄性小鼠48只,完全随机分为正常对照组、模型对照组、脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)治疗组,每组16只。模型对照组与hUC-MSCs治疗组通过口服5﹪葡聚糖硫酸钠诱导UC模型。对hUC-MSCs治疗组小鼠经尾静脉注射脐带间充质干细胞。观察各组疾病活动指数评分;采用酶联免疫吸附(ELISA)法测量各组小鼠血清中TNF-α、IL-8的表达水平,各组数据两组比较采用t检验,多组比较使用重复测量资料的方差分析对结果进行统计分析。结果模型对照组与hUC-MSCs治疗组DAI评分从第2天开始上升,直至实验结束分别为8.72±0.71、4.01±0.35均高于正常对照组0.21±0.20,且差异有统计学意义(F=1 300.66,P0.01);模型对照组与hUCMSCs治疗组比较,在造模期间及治疗的第4天DAI评分分别为7.95±0.71、8.01±0.73,差异无统计学意义(t=-0.24,P=0.08),在治疗的第5天hUC-MSCs治疗组DAI评分开始下降为7.23±0.82,且与模型对照组8.01±0.81相比,差异有统计学意义(t=-2.71,P=0.01)。造模第7天,模型对照组与hU C-MSCs治疗组两组TNF-α分别为(363.32±15.84)pg/ml、(375.52±16.21)pg/ml,均高于空白对照组(112.14±11.23)pg/ml(F=624.12,P0.01);模型对照组与hUC-MSCs治疗组两组IL-8分别为(65.32±10.12)pg/ml、(57.21±8.71)pg/ml均高于空白对照组(25.02±7.81)pg/ml(F=34.29,P0.01),但两组比较差异无统计学意义(P0.05);第2次干细胞注射7 d后即实验结束时,模型对照组与hUC-MSCs治疗组TNF-α分别为(453.23±15.63)pg/ml、(276.84±17.91)pg/ml,仍高于空白对照组(134.32±12.31)pg/ml(F=642.41,P0.01);模型对照组与hUC-MSCs治疗组两组IL-8分别为(75.23±6.72)pg/ml、(39.12±4.42)pg/ml仍高于空白对照组(27.12±5.91)pg/ml(F=113.90,P0.01),但hUC-MSCs治疗组水平较造模结束时有所下降,低于模型对照组(P0.05)。结论间充质干细胞移植术对UC小鼠有良好的治疗作用,且能降低血清中TNF-α、IL-8的水平。     

过敏性哮喘小鼠树突状细胞负荷Der p2后改变及与T细胞增殖分化的关系研究

目的:探讨哮喘小鼠与正常小鼠骨髓源性树突状细胞(DC)负荷Der p2抗原后表达表面分子(CD11c、CD86)和细胞因子(IL-10、IL-12p70)的差异及其对Th1和Th2型细胞因子平衡的影响,进一步研究过敏性哮喘发生中DC的可能作用。方法:分别从哮喘组和对照组提取骨髓培养DC,第五天负荷Der p2,24小时后吹打收集细胞,观察DC形态,用流式细胞仪检测孵育后细胞表面CD11c、CD86表达。并留取负荷Der f2前后培养上清,ELISA法检测IL-10及IL-12p70含量。同时以DC:反应细胞比例为1:10混合培养,72 h后ELISA法检测混合培养上清中IL-4、IL-5、IFN-γ的水平。结果:1负荷Der p2后,哮喘组CD86、CD11c表达比对照组高,分别为(t=11,P0.05)(t=4.9,P0.05),差异有统计学意义;2在细胞因子分泌方面,Der p2负荷前,两组DC均能分泌IL-10与IL-12p70,IL-10水平哮喘组高(t=9.5,P0.05),而IL-12p70水平对照组高(P0.05);负荷Der p2后,对照组IL-10、IL-12p7分泌量比负荷前明显增加(P0.05),哮喘组无明显差异(P0.05);3在DC刺激同种T细胞因子分泌方面,负荷Der p2后哮喘组DC刺激T细胞分泌IL-4、IL-5分泌能力明显增强(P0.05),而刺激INF-γ能力降低(P0.05)。结论:DC在过敏性哮喘中起着重要作用,异常DC通过增加CD86、CD11c的表达和减少IL-10及IL-12的合成,致使T细胞向Th2细胞优势分化。     

黄芪多糖对Lewis肺癌小鼠细胞因子及顺铂所致免疫功能低下的影响

目的观察黄芪多糖(APS)对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长、细胞因子及顺铂(DDP)所致免疫功能低下的影响。方法 90只小鼠,设空白对照组10只,余80只依次造模为荷瘤小鼠,并随机分为8组:模型组(等体积生理盐水),顺铂阳性对照组(6 mg/kg DDP),APS低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高剂量(200 mg/kg)组,联合用药低、中、高剂量组(DDP剂量减半,APS各剂量同上),于造模次日起各组分别腹腔注射等体积的药物0.3 mL。DDP每周一次,其余药物每天1次,连续20d。于第21天取血清采用ELISA法测定细胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α的水平,并观察各组抑瘤率及免疫器官指数。结果 DDP、APS低、中、高剂量及联合用药低、中、高剂量组对小鼠Lewis肺癌移植瘤的抑瘤率分别为49.30%、17.21%、39.68%、42.98%、51.02%、57.21%、65.11%(与模型组比较P0.05或0.01;联合用药组与DDP组比较P0.05)。与空白对照组比较,APS中、高剂量组和联合用药组脾脏指数显著升高;与模型组比较,APS高剂量和联合高剂量脾脏指数差异有显著性(P0.05);与DDP组比较,APS各剂量和联合用药组小鼠胸腺指数和脾脏指数均升高。结论 APS能提高Lewis肺癌小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α的水平;增强DDP所致免疫功能低下小鼠的免疫功能,对免疫器官有一定的保护作用;能抑制小鼠Lewis肺癌细胞的生长,在与DDP减半量联合使用时可使DDP抑瘤作用增强,且其机制可能与增强机体的免疫功能有关,说明APS对DDP有一定的增效减毒作用。此项研究在实体瘤的治疗中有潜在的应用前景。     

IL-10在输血相关性移植物抗宿主病小鼠模型中的免疫调节作用

目的:IL-10在输血相关性移植物抗宿主病小鼠模型中的免疫调节作用。方法:取BALB/c实验小鼠免疫活性淋巴细胞,分别输注于BALB/c小鼠(设为A组)及BALB/c裸鼠(设为B组),建立TA-GVHD模型,观察小鼠症状,HE染色判断小鼠肝、肺、小肠、皮肤病理变化情况;采用双夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测两组小鼠血清IL-10浓度;用逆转录聚合酶链反应法RT-PCR检测移植后外周血单个核细胞中IL-10的表达。结果:A组中2只死亡(12.5%),B组中3只死亡(18.75%),共5只死亡,29只存活,两组死亡率比较无明显差异(P>0.05)。B组小鼠累及肝、肺、小肠和皮肤病理损伤程度较A组严重;存活小鼠IL-10浓度较死亡小鼠明显升高(P2<0.05);存活小鼠IL-10 mRNA表达阳性率96.55%明显高于死亡小鼠(20.00%)。结论:IL-10在输血相关的移植物抗宿主病小鼠模型中发挥负向免疫调节--免疫抑制作用。     

miR-30a-5p对人肝癌干细胞增殖和凋亡的影响

目的采用mi R-30a-5p模拟物转染CD133~+MHCC97L肝癌干细胞,观察增殖和凋亡能力的变化,明确mi R-30a-5p对肝癌干细胞的基因治疗效果。方法采用免疫磁珠分选法分选CD133~+MHCC97L肝癌干细胞并采用流式细胞术检测分选效果。分别采用mi R-30a-5p模拟物或抑制物转染肝癌干细胞设为30 a M组或30 a I组,并设立空白对照NC组。采用RT-PCR法检测细胞mi R-30a-5p表达水平。采用CCK-8法检测细胞增殖能力。采用琼脂克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。采用流式细胞术检测细胞凋亡率。肝癌干细胞分选效率、mi R-30a-5p表达水平、CCK-8实验测得A值、克隆形成数量和细胞凋亡率实验数据的比较采用单因素方差分析和t检验。结果未进行磁珠分选的MHCC97L肝癌细胞CD133阳性率为(1.42±0.26)﹪,低于分选后的MHCC97L细胞中CD133的阳性率(94.48±2.32)﹪,差异具有统计学意义(t=-6.78,P=0.04)。RT-PCR实验结果显示,30a M组CD133~+MHCC97L肝癌干细胞中mi R-30a-5p的相对表达水平(20.21±1.92)较NC组(1.03±0.02)明显上调;30 a I组的相对表达水平(0.13±0.01)较NC组明显下调,差异均具有统计学意义(t=20.96,-6.22;P=0.01,0.03)。CCK-8实验结果显示,30 a M组细胞于24 h、48 h和72 h测得的A值分别为(0.40±0.00,0.68±0.03,0.75±0.02),明显低于NC组的(0.83±0.01,1.34±0.03,2.47±0.12),差异具有统计学意义(t=-12.15,-15.66,-6.42;P=0.01,0.02,0.01);30a I组细胞测得的A值分别为(0.95±0.05,1.64±0.03,3.28±0.07),明显高于NC组,差异具有统计学意义(t=9.45,18.97,7.58;P=0.00,0.01,0.03)。软琼脂克隆形成实验结果显示,30 a M组细胞的克隆形成数量为(61.81±1.76)个/孔,低于NC组的(131.96±8.15)个/孔,差异具有统计学意义(t=-8.31,P=0.00);30 a I组的克隆形成数量为(195.75±6.16)个/孔,高于与NC组,差异具有统计学意义(t=15.61,P=0.01)。流式细胞术结果显示,30 a M组的细胞凋亡率为(19.67±0.06)﹪,高于NC组的(10.65±0.12)﹪,差异具有统计学意义(t=15.90,P=0.02);30 a I组的细胞凋亡率为(4.85±0.03)﹪,低于NC组,差异具有统计学意义(t=-6.96,P=0.00)。结论 mi R-30a-5p对CD133~+MHCC97L肝癌干细胞的增殖具有明显的抑制效果,有望成为针对肝癌的有效靶向性治疗手段。     

变应性鼻炎模型小鼠鼻黏膜的形态学观察

目的:建立小鼠变应性鼻炎模型,观察小鼠鼻腔黏膜组织的重塑情况。方法:20只BALB/c小鼠被随机分为致敏组和对照组,使用卵清蛋白(OVA)诱导建立小鼠变应性鼻炎模型。通过HE染色观察小鼠鼻黏膜的大体重塑情况,吉姆萨染色观察嗜酸性粒细胞,阿辛蓝-过碘酸-希夫染色观察杯状细胞;酶联免疫吸附(ELISA)法检测小鼠血清中白细胞介素-4(IL-4)的水平。结果:小鼠变应性鼻炎模型的生物学行为评分为6.5±1.3,提示造模成功。与对照组相比,致敏组鼻腔黏膜出现上皮细胞脱落、坏死,杯状细胞增生,鳞状上皮化生,固有层和黏膜下层腺体增生、血管扩张,组织水肿,固有层内可见特征性的嗜酸性粒细胞浸润,造模后鼻腔黏膜结构存在重塑。致敏组小鼠鼻黏膜嗜酸性粒细胞计数及杯状细胞计数分别为(26.4±5.72)和(24.14±3.12),而对照组分别是(8.31±2.42)和(9.41±1.22),两组比较均具有统计学差异(P0.05);致敏组血清中白细胞介素4(IL-4)水平为(18.9±3.1)pg/ml,对照组为(8.3±1.4)pg/ml,致敏组显著高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:通过卵清蛋白诱导建立的小鼠变应性鼻炎模型鼻腔黏膜存在组织重塑。     

益生菌干预对肥胖小鼠肝脏miR-33 和miR-122表达的影响

目的探讨益生菌干预对高脂饮食诱导肥胖小鼠肝脏miR-33和miR-122表达的影响。方法 18只雌性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、肥胖组和益生菌干预组,每组6只,分别给予标准饲料、高脂饲料以及高脂饲料+益生菌合剂灌胃,自由采食及饮水,连续喂养6周。每周测量3组小鼠的体质量,6周后,留取小鼠血液样本采用全自动生化仪检测小鼠血脂,安乐法处死小鼠,留取小鼠肝脏样本Hair-pin RT-PCR法检测miR-33和miR-122的含量。结果与对照组小鼠相比,肥胖组小鼠体质量明显增加(t_(2周)=3.985,t_(3周)=4.751,t_(4周)=4.380,t_(5周)=4.728,t_(6周)=4.112,均P0.01);益生菌干预组小鼠体质量较肥胖组明显降低(t_(3周)=3.694,t_(4周)=4.415,t_(5周)=3.752,t_(6周)=3.392,均P0.01);肥胖组小鼠血清总胆固醇、低密度脂蛋白含量较对照组明显升高(t=10.850,t=7.024,均P0.01),益生菌干预组小鼠较肥胖组小鼠血清总胆固醇、低密度脂蛋白含量降低(t=3.034,t=2.881,均P0.05),但与对照组仍有差异。与对照组小鼠相比,肥胖组小鼠肝脏miR-122的表达升高(t=9.170,P0.01),miR-33的表达降低(t=3.420,P0.05),益生菌干预组小鼠较肥胖组小鼠miR-122的表达降低(t=3.204,P0.05),miR-33的表达升高(t=2.070,P0.05)。结论益生菌干预能够影响高脂饮食小鼠肝脏miR-33和miR-122的表达,这可能是益生菌干预改善高脂饮食小鼠肝脏脂代谢的机制之一。     

骨髓间充质干细胞对肾移植受者T淋巴细胞分化和miRNA-155表达的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）对肾移植受者T淋巴细胞分化和miRNA-155表达的影响。 方法选取2013年1月至2017年12月于福州总医院接受MSCs诱导+同种异体肾移植术的受者20例（MSCs组）,对照组为同期配对的异体肾移植受者20例。两组患者术后免疫抑制方案均为霉酚酸酯+他克莫司+强的松。两组患者分别于移植术前、术后第15天抽取静脉血,流式细胞仪检测外周血CD4⁺ CD25⁺ FoxP3⁺ Treg细胞/?CD4⁺细胞亚群比值;ELISA检测白细胞介素2（IL-2）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素10（IL-10）浓度;免疫磁珠分选外周血T淋巴细胞后,Rea1-time PCR法检测外周血T淋巴细胞中miRNA-?155的表达。两组间均数比较采用独立t检验,治疗前后均数比较采用配对t检验。 结果移植前两组肾移植受者外周血CD4⁺ CD25⁺ FoxP3⁺ Treg细胞/?CD4⁺细胞比值、IL-2、IL-?10、TNF-α、T淋巴细胞miRNA-155表达水平差异均无统计学意义（P均> 0.05）;术后第15天,与对照组相比,MSCs组外周血CD4⁺ CD25⁺ FoxP3⁺ Treg细胞/?CD4⁺细胞亚群比值（30.44﹪?± 4.23﹪? vs 26.06﹪?±4.77﹪,t = 2.365,P = 0.042）、IL-10水平（20.35?ng/?L?±?5.10?ng/?L? vs 16.63?ng/?L±6.26?ng/?L,t = 2.062,P?=?0.046）上升,而IL-2（27.47ng/?L±4.30 ng/?L vs 31.40?ng/?L±5.33 ng/L,t = 2.252,P = 0.015）、TNF-α（41.52?ng/?L±8.32?ng/L vs 46.67?ng/?L±6.71?ng/L,t = 2.157,P = 0.037）和T淋巴细胞miRNA-155表达水平（1.61±0.31 vs 1.89±0.15,t = 3.688,P?= 0.001）则降低。 结论MSCs能够升高肾移植受者外周血CD4⁺ CD25⁺ FoxP3⁺ Treg细胞/?CD4⁺细胞比值和IL-10水平,降低IL-2、TNF-α和T淋巴细胞miRNA-155表达水平,与MSCs的免疫耐受诱导有关。     

RNA干扰技术下调营养缺乏自噬因子1表达对肝癌细胞侵袭转移能力的影响

目的采用RNA干扰手段抑制营养缺乏自噬因子1(NAF1)在肝细胞癌MHCC-97H细胞中的表达,观察其对肝癌细胞侵袭转移能力的影响。方法采用NAF1-si RNA和空白对照NC-si RNA转染肝细胞癌MHCC-97H细胞,设为NAF组和NC组,同时设立未转染空白对照组(Blank组)。荧光实时定量PCR法检测MHCC-97H细胞NAF1m RNA表达。Western blotting法检测MHCC-97H细胞NAF蛋白和基质金属蛋白酶9(MMP9)蛋白表达。细胞划痕实验检测MHCC-97H细胞迁移能力。Transwell实验检测MHCC-97H细胞侵袭能力。荧光素酶报告基因实验检测MHCC-97H细胞核因子κB(NF-κB)信号通路的相对活性。多组间数据的比较用单因素方差分析,两组之间数据的比较采用t检验。结果 NAF组MHCC-97H细胞NAF1-m RNA的相对表达量为(6.50±0.23)﹪,低于Blank组的(100.80±0.60)﹪,且差异具有统计学意义(t=14.17,P=0.02)。NAF组MHCC-97H细胞NAF1蛋白和MMP9蛋白的相对表达量分别为0.12±0.01、0.07±0.01,均低于Blank组的0.79±0.05、0.81±0.02,且差异均有统计学意义(t=5.21、7.45,P=0.00、0.02)。NAF组MHCC-97H细胞的迁移距离明显小于Blank组。NAF组穿膜细胞的数量为(11.28±1.56)个/视野,少于Blank组的(197.87±3.18)个/视野,且差异有统计学意义(t=7.97,P=0.00),NAF组NF-κB信号通路的相对活性值3.25±0.53明显低于Blank组的26.69±7.41,差异具有统计学意义(t=13.33,P=0.01)。结论采用RNA干扰手段抑制NAF1的表达可能成为抑制肝细胞癌侵袭转移的有效手段。     

不同注射途径的脂肪间充质干细胞对大鼠肠炎疗效的实验研究

目的探讨脂肪间充质干细胞(ADMSCs)腹腔及静脉注射对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导肠炎疗效的影响。方法将32只大鼠完全随机分成正常组、腹腔注射组、静脉注射组及模型组,每组8只。用TNBS诱导炎症性肠病(IBD)动物模型,腹腔及静脉注入ADMSCs,记录大鼠的疾病活动指数(DAI)、观察结肠宏观损伤及微观变化、测定结肠的髓过氧化物酶(MPO)活性、检测结肠Ki-67^+细胞的表达、比较血液中IL-1β、TNF-α浓度及结肠TGF-β、IL-6、IL-17A、IL-10的基因表达水平。采用单因素方差分析及独立t检验进行统计学分析。结果 ADMSCs腹腔注射组(98.05±0.63)g高于静脉注射组[(94.32±0.48)g,t=12.281,P=0.000],同时腹腔注射组DAI评分1.71±0.75低于静脉注射组3.57±0.97,(t=-3.980,P=0.002)。另外发现腹腔注射组结肠组织内髓过氧化物酶MPO浓度(95.75±5.52)U/g低于静脉注射组(74.37±5.12)U/g,(t=-7.513,P=0.000),腹腔注射组结肠病理评分2.14±0.69低于静脉注射组3.57±0.76,(t=-3.612,P=0.004)。结肠免疫荧光检查发现腹腔注射组比静脉注射组有更多的Ki-67^+细胞。酶联免疫吸附测定(ELISA)发现腹腔注射组血浆中IL-1β的浓度(130.71±7.08)pg/ml比静脉注射组(163±9.09)pg/ml低,(t=-8.518,P=0.000),同样腹腔注射组血浆中TNF-α的浓度(201.71±6.75)pg/ml也比静脉注射组(242.28±8.30)pg/ml低,(t=-10.033,P=0.000)。此外,结肠组织实时定量聚合酶联反应(RT-qPCR)的结果显示腹腔注射组IL-6 mRNA的表达4.34±0.48比静脉注射低6.15±1.05,(t=-4.147,P=0.001),腹腔注射组IL-17A mRNA的表达2.61±0.53也比静脉注射低3.57±0.46,(t=-4.301,P=0.001)。然而,腹腔注射组IL-10 mRNA的表达水平37.75±4.46比静脉注射组高27.68±2.25,(t=5.327,P=0.001),腹腔注射组TGF-β mRNA的表达水平15.82±0.99也比静脉注射组高11.97±2.25,(t=3.740,P=0.003)。结论 ADMSCs腹腔注射优于静脉注射并可能成为ADMSCs治疗IBD的较好选择。