低温诱导型凡纳滨对虾DEAD-box RNA解旋酶基因的克隆与表达分析

为研究凡纳滨对虾耐寒性状的分子基础, 克隆鉴定了凡纳滨对虾DEAD-box RNA解旋酶的同源基因。根据差减文库中筛选到的一个低温上调表达的DEAD-box RNA解旋酶基因片段, 通过RACE PCR扩增获得两条高度相似的cDNA全长序列, 两条cDNA均为1430 bp, 包含139 bp 5'UTR、79 bp 3'UTR和1212 bp 开放阅读框, 编码403个氨基酸残基。Blast比对结果显示, 两条cDNA与其他物种的DDX5相似性最高, 推测为凡纳滨对虾DDX5基因的两个变异体, 分别命名为LvDDX5variant A (LvDDX5A)和LvDDX5variant B (LvDDX5B), 在系统进化树中, LvDDX5A和LvDDX5B聚为最近的一支, 并与虾类DDX5、文昌鱼DDX、贝类的DDX5距离较近。Real-time PCR分析结果显示, LvDDX5A和LvDDX5B都呈多组织遍在表达, 在精巢、鳃、肠、肌肉和卵巢中,LvDDX5B表达量高于LvDDX5A, 而在肝胰腺中LvDDX5A表达量高于LvDDX5B。在低温胁迫对虾肝胰腺和心中, LvDDX5A呈上调表达而LvDDX5B表达量无明显变化。进一步对LvDDX5A在不同低温条件胁迫对虾的肝胰腺中表达变化进行了分析。结果显示, LvDDX5A在18℃、15℃、13℃和11℃低温胁迫36h均被诱导表达,并随着15℃和13℃低温胁迫时间的增加呈先上升后下降的表达模式, 在48h达到峰值, LvDDX5A的低温诱导表达模式暗示其可能是在凡纳滨对虾低温适应中发挥作用的剪接体。     

碳酸盐碱度和pH值对凡纳滨对虾仔虾存活率的影响

采用静态急性毒理学方法,探讨了碳酸盐碱度和pH值对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)仔虾存活率的影响。结果表明:在pH值为7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0及10.5的试验组中,凡纳滨对虾仔虾存活率随着pH值的升高而下降,碳酸盐碱度在3mmol·L-1、pH值在9.0以上时,凡纳滨对虾仔虾的存活率受到影响显著;在碳酸盐碱度0～44.43mmol·L-1各试验组中,随着碳酸盐碱度升高,凡纳滨对虾仔虾的存活率下降,凡纳滨对虾仔虾对碳酸盐碱度的耐受性随着pH的升高明显下降;pH值为8.8时,碳酸盐碱度的48hLC50为36.81mmol·L-1,pH值为9.2时,碳酸盐碱度的48hLC50为33.05mmol·L-1,pH值为9.6时,碳酸盐碱度的48hLC50为5.55mmol·L-1;在本试验范围内,凡纳滨对虾对高碳酸盐碱度显示出较强的耐受性,是一种适宜移植到盐碱水域的养殖品种;碳酸盐碱度和pH对凡纳滨对虾的致毒作用是一个综合致毒效应,其中CO32-为主要致毒因子。     

实时荧光定量PCR检测凡纳滨对虾proPO基因标准曲线构建

酚氧化酶原(proPO)系统属于一种酶联级系统,在凡纳滨对虾抵抗病原菌侵袭过程中具有重要作用。Real-time PCR检测技术已经成为国际上检测基因表达通用的方法,能对低丰度mRNA水平进行定量,可在体外对细胞活性进行评估,选择该方法进行外界环境因子胁迫下的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)组织proPO表达分析。在实时荧光定量PCR中,标准曲线法是最为简单、准确的定量方法。为了快速、准确的定量proPO基因在逆境下的表达水平,构建了正确、可靠的proPO基因表达标准品质粒和标准曲线。结果表明,该法所构建的标准曲线能够保证数据的精确性,满足实时荧光定量试验的要求,完全可以作为proPO基因荧光定量检测的参照标准。     

高亚硝酸盐环境下不同生长速率凡纳滨对虾肠道微生物多样性研究北大核心

【目的】高亚硝酸盐环境中饲养的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei),在养殖结束时其生长速率和体重往往差异较大。本研究旨在探讨在高亚硝酸盐环境下饲养的对虾生长速率与肠道菌群结构和功能的相关性。【方法】本研究通过收集高亚硝酸盐条件下快速生长对虾(rapidly growing,RG)、正常生长对虾(normally growing,NG)和缓慢生长对虾(slowly growing,SG)的肠道和海水样品,通过16S rRNA基因测序、线性判别分析[line discriminant analysis(LDA)effect size,LEfSe]等进行分析。【结果】发现SG的细菌群落多样性与RG和NG不同。主坐标分析(principal coordinate analysis,PCoA)分析表明,NG的群落组成与RG比SG更相似。通过LEfSe差异分析发现,RG中火色杆菌科(Flammeovirgaceae)、黄杆菌科(Flavobacteraceae)和浮酶菌科(Planctomycetaceae)的丰度较高,而SG中脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、希瓦氏菌科(Shewanellaceae)和弧菌科(Vibrionaceae)的丰度显著增加。【结论】本研究发现,在高亚硝酸盐环境下,肠道微生物群落的氮代谢能力是造成对虾不同生长速度的原因。该研究将为虾的工业化养殖提供指导。     

凡纳滨对虾β-actin基因的克隆与表达

目的:克隆凡纳滨对虾肌动蛋白基因并在原核表达系统中表达.方法:根据GenBank上凡纳滨对虾β-actin基因序列设计引物,采用RT-PCR方法,从凡纳滨对虾肌肉组织中克隆出β-肌动蛋白基因cDNA部分序列,克隆序列连接到pBAD/gⅢA质粒,转化人大肠杆菌TOP10,筛选阳性克隆,进行温度诱导表达重组蛋白.结果:克隆序列长度为1300bp,测序结果与Gene-Bank序列同源性达99.91%;获得重组体诱导表达产物经SDS-PAGE分析,在约48kD处有表达的蛋白带,表达产物经Western Blotting鉴定为阳性.结论:获得β-actin基因在大肠杆菌中稳定表达产物.     

盐碱地渗水盐度与钠钾比对凡纳滨对虾生长的影响

为广泛利用滨海盐碱地渗水开展对虾养殖,本文研究了盐碱地渗水不同盐度及钠钾比（Na⁺/ K⁺）对凡纳滨对虾存活、生长、代谢及体内谷草转氨酶（GOT）、谷丙转氨酶（GPT）和Na⁺-K⁺-ATPase等3种酶活性的影响.试验用水盐度分别为5、10和15,各盐度组Na⁺/K⁺分别为20、40、50、60、70和90,试验周期为20 d.结果表明,盐度为15的条件下,凡纳滨对虾的存活、生长、代谢及酶活性表现最佳,在此盐度条件下,Na⁺/K⁺保持在40和50条件下,凡纳滨对虾存活、生长、代谢及酶活力较高.表明盐碱地渗水经适当调配可用于凡纳滨对虾的养殖.     

凡纳滨对虾低盐度高产虾池环境微生物生态研究

对广东珠三角地区,凡纳滨对虾低盐度高产虾池环境微生物调查结果,养殖水体异养菌平均数量为5.15×10⁴cfu·mL^-1,致病性弧菌为5.00×10³cfu·mL^-1,池底泥浆中异养细菌平均数量为2.41×10⁶cfu·mL^-1,致病性弧菌为1.45×10⁵cfu·mL^-1。不同虾池异养细菌的数量差别小而稳定,致病性弧菌的数量差别及波动大。淤泥较深的老化虾池,水体和泥浆中异养细菌平均分别为6.10×10⁴cfu·mL^-1和2.89×10⁶cfu·mL^-1,致病性弧菌为6.00×10³cfu·mL^-1和2.14×10⁵cfu·mL^-1;无淤泥虾池水体和泥浆中异养细菌平均分别为4.53×10⁴cfu·mL^-1和2.08×10⁶cfu·mL^-1,致病性弧菌为4.34×10³cfu·mL^-1和9.86×10⁴cfu·mL^-1。老化虾池底泥致病性弧菌明显偏高,成为老化虾池易爆发虾病的重要原因。低盐度虾池水体异养菌和致病性弧菌的数量变化,表现为养殖前期高,中后期低而稳定;池底泥浆中异养菌和致病性弧菌的数量变化,呈不规则波动。高的养殖水温对养殖环境异养菌和致病性弧菌表现抑制作用,养殖环境微生物与水体浮游藻类也有一定的关系。     

不同家系凡纳滨对虾对低盐度的适应能力及其适应机理

为研究不同遗传背景的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)在对盐度的适应能力上具有明显的差异的机理, 比较了30个凡纳滨对虾家系在3个不同盐度水体(5‰、20‰和30‰)中饲养30d后的生长性状。研究结果证实了不同家系对虾在不同盐度条件下的生长性能和适应能力存在显著差异。研究进一步对比分析了各盐度条件下不同家系间生理代谢、ATP含量及ATP合成关键酶酶活力的差异, 并检测了不同家系凡纳滨对虾鳃Na+/K+-ATPase、Ca2+-ATPase酶活水平。结果发现盐度适应力差的对虾家系的Na+/K+-ATPase、Ca2+-ATPase酶活力较弱, 这可能是由于其机体能量供给不足所导致。此外, 研究以血浆中皮质醇浓度为指标, 对比了不同盐度下不同对虾家系的机体应激水平, 结果显示盐度适应力差的对虾家系在经30d饲养后仍处于应激状态。综合研究结果得出, 不同遗传背景的对虾对盐度的适应能力不同, 可能是由其机体代谢、离子转运及能量合成能力所决定。     

凡纳滨对虾健康状态分化前后养殖水体浮游细菌群落的比较

养殖水体浮游细菌群落与对虾健康状态息息相关.本研究基于16S rRNA高通量测序技术手段比较了凡纳滨对虾病害发生前后病害趋向塘与健康塘的浮游细菌群落多样性、组成及关键类群互作关系的动态变化.结果表明:对虾发病前,病害趋向养殖水体浮游细菌群落Shannon指数显著低于健康养殖水体,且呈现持续下降的趋势;伴随疾病爆发,病害趋向养殖水体浮游细菌群落结构离散程度显著增大,群落稳定性较差;发病前,病害趋向塘养殖水体中绿弯菌门、δ-变形菌纲和Saccharibacteria平均相对丰度均显著高于健康水体,而拟杆菌门显著低于健康水体;部分病害指示OTU隶属于弧菌科及黄杆菌科,隶属于红杆菌科的OTU1是发病前健康塘的健康指示OTU.网络分析表明,大多数与OTU1存在相互作用的指示OTUs属于黄杆菌科,说明黄杆菌科在对虾养殖水体浮游细菌群落中扮演重要角色.鉴于以上结果,对虾发病可能与多种浮游细菌群落相关,当出现“生态位机会”时,条件致病菌快速繁殖进而导致对虾发病,而保持和恢复细菌群落平衡可以成为预防对虾发病的有效策略.     

凡纳滨对虾各月龄性状的主成分与判别分析

为了研究凡纳滨对虾各性状增长规律和判定最佳生长季节凡纳滨对虾的体格与月龄的关系,选择1～6月龄凡纳滨对虾各1000只,选择全长、体长、第一腹节背高、第三腹节背高、第一腹节背宽、头胸甲长和体重共7个性状,进行主成分与判别分析.结果表明:各月龄凡纳滨对虾性状之间均呈现显著的正相关(P<0.01), 其中以全长与体长的相关性最为明显,1月龄凡纳滨对虾体重与形态性状的相关系数较小.各月龄凡纳滨对虾的主成分有所不同,1～2月龄凡纳滨对虾的第一主成分为长度因子,第二主成分为宽度因子,第三主成分为高度因子;3月龄凡纳滨对虾的第一主成分与1～2月龄凡纳滨对虾一致,但第二主成分为高度因子,第三主成分为体重因子;4～6月龄凡纳滨对虾的第一主成分为体重因子,第二主成分为高度因子,第三主成分为宽度因子.1～3月龄凡纳滨对虾形态性状的增长优先于体重, 4～6月龄凡纳滨对虾体重优先于形态性状的增长.错过最佳生长季节的凡纳滨对虾的与体格大小相符的月龄可通过建立的判别式来判断,总的判别准确率为98.98%,其中2～4月龄凡纳滨对虾的判别准确率为100%.     

Acute toxicity of carbon dioxide to juvenile marine shrimp Litopenaeus vannamei (Boone 1931)

Elevated concentrations of dissolved carbon dioxide (CO₂) and reduced pH levels are observed during the culture and transportation of aquatic organisms. Studies on the toxicity effects of CO₂ in penaeid shrimp are scarce when compared to the amount of research in fish. The objective of the present study was to determine the lethal concentration and safety levels of CO₂ for juvenile white shrimp Litopenaeus vannamei. Juveniles (1.76 ± 0.36 g) were exposed for 96 h to one of six concentrations of dissolved CO₂ (14.5, 23.8, 59.0, 88.0, 115.0, and 175.0 mg/L) or a control condition (without the addition of CO₂), and their survival was monitored for 96 h. The LC₅₀ values with 95% confidence limits at 24, 48, 72, and 96 h were 130.05 (104.2–162.1), 77.2 (73.8–80.02), 69.65 (65.47–74.32), and 59.12 (53.08–66.07) mg/L of CO₂, respectively. The calculated safety level was 5.9 mg/L of CO₂, and the highest concentration that did not induce significantly higher mortality than that observed in controls (NOEC) was 23.8 mg/L of CO₂. We recommend that CO₂ levels should be kept below the safety level obtained in this study.     

凡纳滨对虾卵母细胞卵黄发生的超微结构

利用电镜研究凡纳滨对虾卵母细胞卵黄发生的全过程。结果表明 :凡纳滨对虾卵黄的发生是双源性的。卵黄发生早、中期是内源性卵黄大量合成的阶段 ,卵黄发生中、后期则以外源性卵黄的合成为主。内源性卵黄主要由内质网、线粒体、核糖体、溶酶体、高尔基器等多种胞器活跃参与形成。其中数量众多的囊泡状粗面内质网是形成内源性卵黄粒的最主要的细胞器 ;部分线粒体参与卵黄粒的合成并自身最终演变为卵黄粒 ;丰富的游离核糖体合成了大量致密的蛋白质颗粒并在卵质中直接聚集融合成无膜的卵黄粒 ;溶酶体通过吞噬、消化内含物来形成卵黄粒和脂滴 ,且方式多样 ;高尔基器不直接参与形成卵黄粒。外源性卵黄主要通过卵质膜的微吞饮活动从卵周隙或卵泡细胞中摄取外源物质来形成     

凡纳滨对虾对吉林西部盐碱水的适应性

采用淡化虾塘水添加天然盐碱水的方法,进行盐碱水环境下凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生存能力实验,探讨吉林西部盐碱水域对虾养殖技术.结果表明,未驯化幼虾在碱度为515～19.24 mmol·L^-1的盐碱水体存活时间大于96 h,在23.41～38.78 mmol·L^-1的盐碱水体生存时间小于0.75 h;驯化幼虾在碱度为5.15～38.78 mmol·L^-1的盐碱水体存活时间大于24 h.未驯化幼虾适应的盐碱水碱度上限在10 mmol·L^-1左右,对递增碱度差的适应能力小于8 mmol·L^-1.提高驯化水平,可增强幼虾对盐碱水环境的综合适应能力.碱度驯化至30 mmol·L^-1的幼虾对递增碱度差和递减碱度差的适应能力分别为2～4 mmol·L^-1及3～25 mmol·L^-1,可以在吉林西部碱度小于32 mmol·L^-1的盐碱水域养殖凡纳滨对虾.     

Effect of dissolved carbon dioxide on oxygen consumption in the Pacific white shrimp,Litopenaeus vannamei (Boone 1931)

A failure in the aeration system of Litopenaeus vannamei rearing with biofloc technology can decrease the oxygen concentrations rapidly and also increase the carbon dioxide (CO₂) concentrations at the same rate. We report here an evaluation of the effect of CO₂ on the oxygen consumption of L. vannamei. We used a continuous-flow respirometer with water recirculation equipped with a digital fiber-optic oximeter. Eight juveniles of L. vannamei (12.1 ± 1. 4 g) were used in each treatment with one per respiratory chamber (0.6 L). The shrimp were exposed to six concentrations of CO₂ (5, 30, 60, 95, 150, and 300 mgCO₂/L) with an acute exposure time of six hours. Upon treatment with 5–30 mgCO₂/L, we observed a consumption of oxygen of 0.233 ± 0.129 and 0.33 ± 0.072 mgO₂/g/h, respectively. Upon treatment with 60 mgCO₂/L, an increase was observed in the oxygen consumption (0.521 ± 0.098 mgO₂/g/h). Upon treatment with 95, 150, and 300 mgCO₂/L however, the shrimp decreased their oxygen consumption and lost their equilibrium. The CO₂ should therefore be maintained at a maximum of 5 mgCO₂/L during shrimp rearing.     

凡纳滨对虾优势腐败菌鉴定及其群体感应现象

为了鉴定凡纳滨对虾的优势腐败菌并研究其是否存在以N-酰基高丝氨酸内酯类化合物(AHLs)介导的群体感应系统,采用16S rRNA序列鉴定凡纳滨对虾的优势腐败菌,并采用紫色杆菌CV026对优势腐败菌的AHLs活性进行检测.结果发现凡纳滨对虾优势腐败菌菌株1(Aci-1)和菌株2 (Aci-2)均为不动杆菌属,均存在以AHLs为信号分子的群体感应系统.添加外源信号分子AHLs能促进Aci-1菌株生物膜的形成,且呈浓度依赖性.在一定的贮藏范围内,凡纳滨对虾腐败菌信号分子AHLs浓度与细菌总数、挥发性盐基氮含量存在正相关性,其相关系数r分别为0.846 6和0.986 7,分别在P＜0.05与P＜0.01水平上显著,结论是凡纳滨对虾优势腐败菌不动杆菌菌株存在以AHLs介导的群体感应系统,且与凡纳滨对虾的腐败密切相关.     

Acute effects of extreme pH and its influences on the survival and biochemical biomarkers of juvenile White Shrimp,Litopenaeus vannamei

The White Shrimp (Litopenaeus vannamei) is reared in several types of systems. Changes in pH in some can produce sub-lethal effects that result in poor growth and survival. The aim of the present study was to determine the acidic and basic pH 50% lethal limits after 96 h exposure (pH_50–96 h) and to evaluate the sub-lethal effects of pH on oxidative stress parameters in juvenile L. vannamei. The experimental design comprised nine treatments with three replications of each. The nine treatments consisted of pH 10.5, 10.0, 9.5, 9.0, 7.0, 5.0, 4.5, 4.0 and 3.5. The treatment at 7.0 was used as the control. The sub-lethal pH tests were: basic pH 9.5, neutral pH 7.0 (control) and acidic pH 4.5. For each experimental pH and sampling point, the hemolymph of six shrimp was collected to determine catalase and glutathione S-transferase’s activities and total antioxidant capacity. The values of lethal pH₅₀ at 24, 48, 72 and 96 h for juvenile L. vannamei had basic pH values equal to 9.82, 9.62, 9.59 and 9.58 and acidic pH values of 3.86, 3.92, 3.94 and 4.04, respectively. The shrimp exposed to basic and acidic pH levels showed antioxidant responses with changes in antioxidant activity.     

海水和淡化水养殖凡纳滨对虾饲料蛋白需求量的比较研究

本研究从生长、饲料利用和体成分等指标综合评价饲料蛋白质含量对凡纳滨对虾的影响。研究发现,在海水养殖环境下,饲料蛋白水平对凡纳滨对虾的存活率、增重率、特定生长率、饵料系数、蛋白效率和虾体粗蛋白含量均有显著性影响(p<0.05)。摄食饲料蛋白含量38%的海养凡纳滨对虾有较高的存活率、增重率以及最高的特定生长率。饵料系数随蛋白含量的增加而减小,虾体粗蛋白含量随饲料蛋白水平升高而增加,而蛋白含量38%和41%实验组饵料系数和虾体粗蛋白含量均没有显著性差异(p>0.05)。淡化水养殖条件下,凡纳滨对虾的存活率随饲料蛋白水平的增加而提高,而增重率和特定生长率均在饲料蛋白含量35%实验组最高,饵料系数随蛋白含量的增加先减小后增大,蛋白含量35%实验组饵料系数显著小于其他实验组。海水养殖条件下,凡纳滨对虾的存活率、末体重、增重率、特定生长率和蛋白质效率均高于淡水养殖的对虾。对虾虾体粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量均随盐度升高而升高,而虾体水分随着盐度的升高而降低。     

凡纳对虾对虾素基因的克隆与抗菌性质分析

目的:抗菌肽分子在无脊椎动物的先天免疫系统中,发挥着重要的抗菌作用;为了不断完善无脊椎动物先天免疫系统的抗菌机制,作者以凡纳对虾的对虾素基因作为研究对象,进行分子生物学方面研究。方法:以凡纳对虾的对虾素基因———penaeidin 4抗菌肽基因(Lva-pen 4)作为研究对象,主要进行了基因克隆、氨基酸序列比对、系统进化关系分析以及分子结构初步预测等研究内容。结果:Lva-pen 4的cDNA序列全长624bp,开放阅读框包括204bp,演绎67个氨基酸残基;在Lva-pen 4分子一级结构的氨基酸序列中,存在一个对虾素结构域,其中包括8个保守存在的半胱氨酸残基和6个脯氨酸残基。结论:根据分子结构的分析结果,推测Lva-pen 4是一个重要的免疫反应相关基因,在先天免疫系统中发挥着重要作用。