乙型肝炎病毒S-preS1-C融合基因在酵母中的表达及抗原性分析

以HBV全基因组质粒为模板,扩增出目的区段S(1-222AA),preS1(10-50AA)和C(2-30AA),以酶切-PCR的方法进行连接,克隆入表达载体pPIC3.5k,电穿孔转化后利用G418加压筛选出多拷贝整合菌株,诱导表达并对表达产物进行检测.结果显示融合后的基因为ss1c,长度约为906bp.在酵母中成功地进行了表达,表达产物(SSIC)的大小约为31kDa,并形成直径约为22nm的病毒样颗粒.表达产物与HBs抗体、preS1抗体和HBc抗体均有特异反应.为进一步研究治疗性疫苗提供了重要的基础.     

乙肝病毒S抗原和preS1抗原表位融合蛋白(S/preS1) 在CHO细胞中的稳定高效表达

含前S蛋白的重组乙型肝炎疫苗是第3代乙肝疫苗研发的重点,有望替代现在广泛使用的基因工程疫苗。构建表达乙肝病毒S抗原和preS1抗原表位 (21-47位氨基酸) 融合蛋白 (S/preS1) 的真核表达载体HMRCHEF53u/Neo-S/preS1并转染CHO-S细胞,经ELISA和有限稀释克隆筛选获得了S/preS1表达效率高、体外培养生物学性状好的CHO细胞系10G6。Western blotting分析证实10G6表达的S/preS1同时保留S和preS1的天然免疫原性。10G6细胞在以活细胞密度和preS1/S浓度为评价指标的连续批次培养过程中保持着稳定的目的产物表达效率和良好的生长特性。采用无血清流加培养工艺,10G6细胞的活细胞密度和preS1/S浓度分别达到7×106～10×106 cells/mL和17～20 mg/L。     

人赖氨酸乙酰基转移酶7结构域蛋白的原核表达及纯化

目的:克隆人赖氨酸乙酰基转移酶7(KAT7)的2个功能结构域基因,获得其原核表达产物,并纯化蛋白。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增人KAT7基因的2个功能结构域(1-330aa)和(331-611aa)编码片段,将其克隆到p ET28a载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,对原核表达产物进行纯化,以SDS-PAGE和Western印迹鉴定表达与纯化产物。结果:从人乳腺文库中分别扩增获得约990和840 bp的DNA片段,并克隆至p ET28a载体,测序结果表明与目的序列完全一致;在大肠杆菌Rossate中诱导表达出相对分子质量分别约为42 000和36 000的目的蛋白,经纯化后获得了纯度较高的重组蛋白KAT7(1-330aa)和(331-611aa)。结论:获得了重组蛋白KAT7(1-330aa)和(331-611aa),为后续研究KAT7与肿瘤调控奠定了实验基础。     

H-Ras结构域的原核表达及纯化

目的:克隆人H-Ras部分片段基因,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化。方法:采用PCR技术从质粒Myc-H-Ras中扩增H-Ras(1-165)和H-Ras(165-189)结构域片段,将其克隆到p GEX-KG载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,以SDS-PAGE和Western印迹鉴定表达与纯化产物。结果:从Myc-H-Ras质粒中分别扩增获得约500和100 bp的DNA片段,并克隆至p GEX-KG载体,经测序与目的序列完全一致;在大肠杆菌Rossate中诱导表达出相对分子质量分别为46×103和29×103的目的蛋白,经纯化后获得了纯度较高的重组蛋白GST-H-Ras(1-165)和GST-H-Ras(165-189)。结论:获得了重组蛋白GST-H-Ras(1-165)、GST-H-Ras(165-189),为后续深入研究H-Ras影响肿瘤细胞生长的机制奠定了实验基础。     

乙型肝炎病毒表面抗原preS1在大肠杆菌中的表达与鉴定

本文报告利用pWR590质粒为载体,构建了含1ac启动子、β-半乳糖苷酶(1—590)基因、Xa因子的四肽识别位点和HBV preS1、preS2编码序列的表达质粒,并成功地在大肠杆菌中获得稳定表达。融合蛋白经Xa因子消化和高效液相层析,得到了preS1(1—91)纯肽。此肽特异性地与人肝细胞质膜结合,从而为肝细胞上存在preS1受体提供了直接的实验依据,也为分离和鉴定肝细胞上preS1受体打下了良好的基础。     

汉滩病毒核蛋白的分段表达及抗原表位分析

在大肠杆菌中对汉滩病毒S基因4种不同长度片段的重组表达质粒进行诱导表达.结果表明表达的4种GST-NP融合蛋白均以不溶性包含体形式存在于菌体细胞内,表达量分别占菌体蛋白总量的29-36%,分子量分别约为72 kD、66 kD、54 kD和44 kD.Western blot显示54 kD和72 kD融合蛋白用酶标抗汉滩病毒NP McAb 1A8和抗GST McAb 3C11染色呈阳性反应.66 kD和44 kD融合蛋白仅与酶标3C11呈阳性反应.用凝血酶切去GST,获得4种汉滩病毒重组核蛋白(rNP),分子量分别约为44 kD、40 kD、26 kD和16 kD.用19株McAb对表达产物做抗原位点分析,结果完整的rNP可与19株McAb中的13株反应,McAb反应谱与天然NP相同;S1.1 kb表达产物(N-端1-37和C端402-429位aa缺失)和S 0.5 kb表达产物(N-端1-274位aa缺失)与19株McAb均不发生反应;S0.7 kb表达产物(C-端275-429位aa缺失)可与5株组特异性McAb反应.表明汉坦病毒核蛋白上的抗原位点主要存在于N-端1-37位aa区段内.     

抗人胎盘酸性铁蛋白单链抗体的构建、表达与鉴定

目的:制备人胎盘酸性铁蛋白(PAF),构建、表达并鉴定抗人PAF单链可变区抗体片段(scFv)。方法:设计以SfiⅠ、NotⅠ为酶切位点、以(Gly4Ser)3为linker的2对引物,从抗人PAF单克隆抗体可变区基因的克隆载体中扩增VH和VL基因,用重叠延伸PCR在VH和VL基因间引入连接短肽,构建VH-linker-VL的scFv基因。经SfiⅠ、NotⅠ酶切后克隆到原核分泌型表达载体pUC19/119上,转化大肠杆菌TG1和筛选后测序验证,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定其相对分子质量(Mr)。以人PAF为抗原,scFv为一抗,抗His单克隆抗体为二抗,间接ELISA鉴定其抗体活性。结果:重叠延伸PCR扩增产物经凝胶电泳可见约700bp的条带,DNA序列分析证明2株抗体具有完整的scFv序列,并含有c-myc和His。IPTG诱导阳性菌表达产物经SDS-PAGE鉴定有Mr约27000的显示条带,符合scFv与表达标签融合蛋白的理论值;间接ELISA证明表达产物可与PAF结合。结论:成功构建并表达了抗人PAF单链抗体,为进一步建立检测PAF的间接ELISA奠定了基础。     

拟南芥蛋白磷酸酶TOPP4的原核表达和多克隆抗体纯化

以拟南芥野生型Col-0为材料,对其I型蛋白磷酸酶(TOPP)家族进行序列分析,对家族成员之一的TOPP4进行原核表达及多克隆抗体的制备和纯化。结果显示:(1)该研究构建出原核表达载体pEGM-4T-3-TOPP4和pET-28a-GFP-N150并转入大肠杆菌BL21(DE3)中。(2)经IPTG诱导,表达出分子量约为62kD的GST-TOPP4和分子量约为34kD的His-GFP-N150可溶性重组蛋白。(3)纯化的重组蛋白GST-TOPP4作为抗原免疫新西兰兔后,获得了效价大于1∶400 000的多克隆抗体血清。(4)抗体血清经连接了His-GFP-N150蛋白的溴化氢活化的树脂纯化,得到特异性较高的anti-TOPP4多克隆抗体。研究认为,该研究纯化出了特异的TOPP4蛋白多克隆抗体。     

G145R突变后乙型肝炎病毒表面抗原在酵母系统的表达及其免疫学特性分析

为了研究乙型肝炎(乙肝)病毒表面抗原(HBsAg)发生G145R突变后的免疫学特性改变情况,首先利用Pichia pastoris酵母表达系统分泌表达G145R突变后的HBsAg的preS2 S(中蛋白),用重组表达产物免疫小鼠,酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot实验等研究其抗原性和免疫原性与野毒型HBsAg的异同。从150个阳性表达克隆中筛选出一株表达量最高的克隆株MC23,Western blot检测显示,表达的HBsAg中蛋白单体主带分子量在34kD、37kD左右,表达量约为200μg／L。用不同的HBsAg检测试剂检测其抗原性发现,G145R突变后的HBsAg,用绝大多数试剂都不能很好地检出,检出能力只有野毒型HBsAg的50％或更低,但用美国雅培公司的试剂检出能力可达野毒的98％。G145R突变后的HBsAg中蛋白免疫小鼠后,血清中可检测到1：1600的特异性表面抗体,该抗体与G145R突变后的HBsAg“a”决定簇合成肽P2—145R也能发生交叉反应,反应滴度为1：80。但该抗体和野毒型HBsAg蛋白以及野毒“a”决定簇合成肽P1-wt均不反应。上述结果表明,G145R突变后的HBsAg中蛋白在Pichia pastoris酵母系统得到了分泌表达,表达产物仍具有较好的免疫原性,但和野毒HBsAg相比,其抗原性和免疫原性发生了明显改变。     

乙型肝炎病毒全长PreS蛋白基因在酵母中的表达

应用直接提取法从武汉地区乙型肝炎病人患者阳性血清中提取HBV基因组,以此作为模板,用引物PCR方法获得全长preS基因,该片段的DNA大小1 203bp.克隆到pUCm-T载体中,应用M13通用引物进行序列测定,与中国HBV标准株序列比较,证实基因型为Adr亚型.有24个核苷酸不同,preS基因包含3个起始密码ATG分别为preS1,preS2,和S的翻译起点.然后将preS基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,将Sal I线性化的pPIC9K-preS质粒用电击法导入巴斯德-毕赤酵母GS115His-中.通过MD-G418平板筛选和5'AOX1和3'AOX1引物PCR鉴定获得稳定重组HBV全长preS基因的His+Mut+酵母工程菌株.此酵母菌株在合适的培养条件和甲醇诱导下高效表达产生全长PreS蛋白并可分泌到培养液中,SDS-PAGE显示培养液中含有分子量约为48kDa的带;微孔ELISIA法证实表达并分泌到培养液中的PreS蛋白能够与HBV抗体阳性血清发生特异性反应.     

Immunogenicity of recombinant hepatitis B virus surface antigen fused with preS1 epitopes expressed in rice seeds

To test the possibility of producing a novel hepatitis B vaccine in plants, the modified hepatitis B virus (HBV) surface antigen (HBsAg) gene SS1 was expressed in rice under the control of the seed-specific Glub-4 promoter. The SS1 gene encodes a fusion protein consisting of amino acids 21-47 of the hepatocyte receptor-binding presurface 1 region (preS1) fused to the truncated C-terminus of the major HBV surface (S) protein. The production of antibodies against the preS1 region acts to protect humans against HBV infection by preventing HBV from binding to hepatocytes. The presence of SS1 in the genome of transgenic rice was confirmed by PCR and Southern blot analysis, and RNA dot blot analysis indicated that the fused SS1 gene was specifically expressed in rice seeds, with the highest expression level being about 31.5 ng/g dry weight grain. Western blot analysis revealed that the recombinant SS1 protein could be specifically recognized by both an anti-S protein antibody and an anti-preS1 antibody. The recombinant SS1 protein was also observed to form virus-like particles with a diameter of about 22 nm and a density of 1.25 g cm(-3). Furthermore, immunological responses against both the S and preS1 epitopes were induced in BALB/c mice immunized with the recombinant SS1 protein, indicating that this rice-derived SS1 protein could be a promising candidate as an alternative HBV vaccine for preventing hepatitis B.     

修饰的含前S1、前S2免疫决定簇乙肝表面抗原融合多肽在毕赤酵母中的共表达

用BamHⅠ和BglⅡ双酶切含SS2嵌合基因片段的重组质粒pAO815-SS2,分离含AOX1启动子区、SS2嵌合基因和AOX1转录终止序列的表达盒。将分离的BamHⅠ-BglⅡ表达盒与经BamHⅠ线性化的pAO815-SS1质粒连接,转化大肠杆菌Top10F′,提取质粒,用BamHⅠ和BglⅡ双酶切分析重组质粒并筛选正向插入SS2表达盒的重组子。将该重组质粒用电转化法导入PichiapastorisGS115细胞,经表型筛选、小试表达和产物鉴定,构建了重组表达菌株GS115-SS1S2。重组菌株经甲醇诱导后制备抗原粗提液,进一步进行ELISA和Westernblot鉴定。ELISA结果显示,产物同时具有S、前S1和前S2抗原性。Westernblot分析进一步表明,表达产物既能与S抗体结合,也能与前S1和前S2抗体结合。工程菌经高密度发酵,表达量达到300~600mg/L。抗原经纯化后进行电镜观察,形成直径20~35nm的球形颗粒。纯化抗原经SDS-PAGE分析,SS1和SS2多肽仍然保持完整,基本无降解。     

人源Cdc25C蛋白的融合表达及纯化

目的:表达并纯化有活性的GST-Cdc25C融合蛋白,以用于Cdc25C功能研究。方法:利用RT-PCR克隆MCF-7细胞的cdc25c全长基因;在大肠杆菌中表达GST-Cdc25C融合蛋白;利用GSH交联的琼脂糖珠纯化GST-Cdc25C融合蛋白;通过体外磷酸酶活性分析检测GST-Cdc25C融合蛋白的磷酸酶活性。结果:克隆获得1465 bp的人源cdc25c全长基因,并克隆至pGEX-4T-1原核表达载体;在原核系统中可溶性表达了相对分子质量约87×103的GST-Cdc25C融合蛋白;通过亲和纯化获得的GST-Cdc25C融合蛋白具有较好的磷酸酶活性。结论:得到了有磷酸酶活性的GST-Cdc25C融合蛋白,可用于后续的Cdc25C功能研究。     

水稻cDNA c73片段在大肠杆菌中的表达及其产物的纯化

曾以水稻蜡质基因５’调控区内一段３１ ｂｐ 片段为探针,用酵母单杂交法从水稻ｃＤＮＡ 文库中筛选出若干个其编码的蛋白可能与此３１ ｂｐ 片段结合的ｃＤＮＡ克隆,现将其中的ｐＣ７３ 克隆中的插入片段ｃ７３ 连接到含Ｈｉｓ６ 的表达载体ｐＥＴ２８ｃ（ ＋ ） 上,在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３） 中进行诱导表达,并用ＮｉＮＴＡ 树脂纯化得到预期的融合表达产物。在合适的诱导表达条件下,融合表达产物主要以可溶形式存在于大肠杆菌细胞内;表达量占到大肠杆菌总蛋白的１０ ％ 左右;经ＮｉＮＴＡ 树脂亲和层析纯化得到的产物纯度达９５ ％ ,可供进一步研究之用。     

Cloning of ODAP Degrading Gene and Its Expression as Fusion Protein in Escherichia coli

A gene responsible for the degradation of ß-N-Oxalyl diaminopropionic acid (ODAP) was fused to the maIE gene, which codes for maltose binding protein, by cloning into an expression vector pMAL c2. The gene has been expressed as fusion protein of mol wt approximately 62 kD. It has been purified by affinity chromatography. The fusion protein has been cleaved by an endoprotease factor Xa and the presence of maltose binding protein and the product of the cloned gene confirmed. SDS-PAGE has shown that the product of the ODAP degrading gene is a single polypeptide of mol wt of about 20.7 kD.     

C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆与表达

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了1．2kb的α毒素基因,将纯化的PCR产物与载体pGEM-T连接,转化至受体菌JM109中,经NcoI／EcoRI和BamHI／EcoRI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,重组质粒pXCPAl中含有α毒素全基因。随后用NcoI／EcoRI酶切质粒pXCPAl,回收α毒素基因片段,插入到事先经同样酶切处理的载体pET-28c中相应酶切位点,构建了表达质粒pETXAl,经NcoI／EcoRI和BamHI／EcoRI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,表达质粒含有α毒素基因且基因序列和阅读框架正确。重组菌株BL21(DE3)(pETXAl)表达产物经ELISA检测和SDS-PAGE分析,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别,其表达量占菌体总蛋白相对含量的16．28％。     

乙肝PreS_2抗原决定簇和霍乱毒素B亚基基因的融合与表达

本研究通过全化学法按大肠杆菌密码偏性合成了HBV PreS_2抗原决定簇基因,与ctxB基因的3’端融合。重组质粒转化大肠杆菌后融合基因得到高效表达,表达量达30μg/ml,表达产物95％以上分泌到胞外。表达的融合蛋白能与神经节苷脂GM1结合,说明融合蛋白保持了CTB的基本高级结构和生物学功能;ELISA实验证明融合蛋白具有CTB和HBV PreS_2的抗原性;应用亲和层析纯化后得到了电泳纯融合蛋白制品,为研究融合蛋白的免疫原性并进一步构建基因工程肽苗奠定了基础。     

A plasmid vector system for the expression of a triprotein consisting of beta-galactosidase, a collagenase recognition site and a foreign gene product

A plasmid-cloning vector system has been constructed which allows the production of fusion proteins with beta-galactosidase at the N terminus, followed by a recognition sequence for the site-specific protease, collagenase, and the foreign protein at the C terminus. A multicloning site allows the insertion of foreign genes in any translational reading frame. Fusion proteins were isolated by affinity chromatography on APTG-Sepharose. The foreign protein was released from the fusion product by collagenase cleavage. The vector was successfully utilized for the production of Escherichia coli single-stranded (ss) DNA-binding protein (SSB protein). The proteolytically released SSB protein resisted elution from an ss DNA-cellulose column with 1 M NaCl.     

凋亡抑制因子Survivin在大肠杆菌TB1中的表达纯化及鉴定

 本文旨在克隆凋亡抑制因子Survivin基因,并在大肠杆菌中进行可溶性表达与初步纯化. 采用RT-PCR法,扩增人凋亡抑制因子survivin cDNA,并克隆入原核表达载体pMAL p2X中,转化TB1大肠杆菌感受态细胞.经0.3 mmol/L IPTG诱导2 h后,收集菌体蛋白,进行SDS-PAGE、ELISA及Western 印迹鉴定. 实验获得凋亡抑制因子survivin编码区cDNA,以构建的原核表达载体pMAL-p2X survivin转化菌株后,可表达凋亡抑制因子survivin和麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白,相对分子质量(Mr) 为58 000.并成功利用Factor Xa将融合蛋白裂解开.ELISA和Western 印迹表明,融合蛋白能与抗凋亡抑制因子survivin单克隆抗体特异性结合.获得的凋亡抑制因子survivin全长cDNA可在大肠杆菌TB1中以MBP survivin融合蛋白的形式表达,成功地将survivin目的蛋白和MBP蛋白分离,为深入研究survivin的结构和功能奠定了基础.     

猪链球菌2型溶血素基因的表达及其免疫原性

【背景】猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是一种重要的人兽共患病原菌,有35种血清型,其中以猪链球菌2型(SS2)危害最为严重。研究发现,各种血清型SS分泌的溶血素(Suilysin,SLY)可能具有较好的免疫保护作用,因此,SLY作为SS基因工程亚单位疫苗的成分具有较大优势。【目的】获得SS2安徽强毒株(AH10-8株)溶血素基因(sly)的表达产物,并对其免疫原性进行测定分析。【方法】根据GenBank数据库中登录号为DQ443533.1的全长sly序列,设计合成一对分别带有Bam HI、XhoI酶切位点的特异性引物,利用PCR从AH10-8株中扩增sly基因,构建pET-30a-sly原核表达重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,进行IPTG诱导表达和His-Tag镍柱纯化蛋白,SDS-PAGE检测SLY,Western blotting鉴定SLY的反应原性;利用昆明鼠和斑马鱼进行SLY免疫攻毒保护试验,间接ELISA方法检测昆明鼠血清IgG抗体效价,观察比较病理组织变化及其免疫保护率。【结果】重组质粒pET-30a-sly在大肠杆菌中实现高效表达,获得大小为60kD的目的蛋白,与预期大小的SLY分子质量一致,能与SS2阳性血清发生特异性反应。SLY和AH10-8株灭活全菌体3次免疫昆明鼠后的血清IgG抗体效价分别为1:6 400、1:204 800 (以AH10-8株全菌体的超声裂解物为包被抗原)和1:102 400、1:51 200 (以SLY为包被抗原);SLY和AH10-8株灭活全菌体对昆明鼠和斑马鱼的免疫保护率分别为40%、80%和84%、92%;病理组织变化与攻毒对照组之间差异明显。【结论】成功表达的SLY具有良好的反应原性和免疫原性,可诱导机体产生保护性免疫反应,有望成为研制SS2新型疫苗的候选成分。