结核分枝杆菌组合DNA疫苗的免疫效果

以编码结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B、ESAT 6和MPT6 3的基因为插入片段 ,构建核酸疫苗联合免疫小鼠。以原核表达纯化的抗原为检测物 ,检测了抗原特异性的抗体和γ 干扰素的形成。研究表明 ,组合核酸疫苗第 3次免疫后 2 1天 ,实验小鼠血清中Ag85B抗体滴度达到 10 5以上 ,Ag85B抗原刺激产生的特异性γ 干扰素达到 (17.0± 7.0 )u/ml。组合疫苗虽然没有提高小鼠血清中ESAT 6及MPT6 3蛋白的特异性抗体滴度 ,但仍显著刺激产生了两种特异性的 γ 干扰素。攻毒实验表明 ,经组合疫苗免疫后小鼠肺部结核杆菌数量显著下降。肺部切片显示 ,免疫小鼠病理状况较对照组有明显改善。因此 ,研究提示Ag85B等组合核酸疫苗具有较好的结核病预防效果。     

结核分枝杆菌核酸疫苗的构建及其小鼠免疫效果观察

将结核杆菌ＥＳＡＴ－６和ＭＰＴ－６４的编码基因分别插入真核表达载体ＪＷ４３０３构建重组质粒,用重组擀凿对４周龄的ＢＡＬＢ／Ｃ和Ｆ１代小鼠进行肌肉和皮内地末次免疫后１０天采血交分离血清,进行ＥＬＩＳＡ检测。结果表明,小鼠能产生较强的体液免疫,特异性ＩｇＧ平均水平分别为参考血清的２．２０倍３．１９倍,且对两种品系小鼠进行的相同途径的免疫,其抗体水平差异不显著,而不同途径的重组质粒免疫,抗体水平略有差异     

IL-12增强HBV融合抗原DNA疫苗在小鼠诱导的细胞免疫应答

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)极易形成慢性感染,主要机制在于感染者不能产生强有力的细胞免疫应答以清除病毒[1].慢性HBV感染者体内虽然存在HBV抗原特异性T淋巴细胞,但对HBV抗原的反应性较低.研究发现,增强这类T淋巴细胞的反应性,可以促进HBV的清除[2].     

结核分枝杆菌免疫优势抗原研究进展

结核病是当今影响人类健康、流行性最广、病死率最高的感染性疾病之一。结核病的诊断和疫苗的构建成为当前的研究热点,筛选出结核分枝杆菌免疫优势抗原是快速准确的诊断结核病及研制安全有效的疫苗的关键。拟对近年来国内外学者发现的结核分枝杆菌免疫优势抗原的分子生物学特性研究进展进行综述。     

结核分枝杆菌ESAT-6抗原鼠单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备重组结核分枝杆菌ESAT-6抗原鼠单克隆抗体.方法:采用杂交瘤技术,获得了12株针对结核分枝杆菌ESAT-6抗原的鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株,对其中的5株进行了小鼠腹水的制备及相关鉴定.结果:5株单克隆抗体的腹水效价达到1:512 000～1:1 024 000,纯化后纯度高于90%,抗体亚类(型)均为IgGl...     

结核分枝杆菌抗原重组酿酒酵母免疫诱导小鼠特异性免疫应答

近年来基于重组酿酒酵母全细胞的新型疫苗研究报道不断出现。以结核杆菌重要保护抗原ESAT6和Ag85B为对象,采用pHR酿酒酵母表达系统,构建了两种分别表达ESAT6-Ag85B(EA)和IFN-γ-ESAT6-Ag85B(IEA)融合抗原的重组酿酒酵母Yeast-EA和Yeast-IEA。重组酵母以皮下注射方式免疫小鼠后,小鼠产生高水平Ag85B特异性抗体,淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2等细胞因子,无IL-4产生,发生Th1型细胞免疫应答,其中Yeast-IEA效应更强,优于传统的BCG疫苗。实验证实重组酵母能够刺激树突状细胞的成熟分化。研究结果显示结核分枝杆菌抗原重组酿酒酵母全细胞疫苗具有发展成为新型抗结核疫苗的潜力。     

白细胞介素6与结核分枝杆菌感染和诊断的研究进展

结核病仍然困扰着人类健康,我国是22个结核病高负担国家之一,早期正确的诊断以及及时有效的治疗对于控制我国结核病流行是必不可少的。传统的结核病实验室诊断方法都存在着许多不足,新的诊断方法由于没有良好的生物标志物而受到了限制。国内外许多研究表明,白细胞介素6(IL-6)在结核病中具有潜在的诊断价值。在此就IL-6与结核分枝杆菌感染和诊断的研究进展做一综述。     

结核分枝杆菌早期分泌蛋白ESAT-6家族的研究进展

ESAT-6家族蛋白是结核分枝杆菌早期分泌蛋白中具有较强免疫原性的成分之一。卡介苗中缺乏该家族的一些重要成分。近年对其分布。结构,免疫学特征以及生物学用途方面的研究较多。该蛋白在作抗结核分枝杆菌亚单位疫苗的候选抗原,DNA疫苗的候选基因以及作为结核分枝杆菌感染的免疫学诊断试剂等领域体现出良好的研究及应用前景。     

结核分枝杆菌的后基因组研究和新型疫苗

结核病仍然是全球人类健康的威胁。全球人口的 1 /3(约 2 0亿人 )感染过结核分枝杆菌 ,每年 30 0万人死于结核病 ,死于结核病的人数是其他传染病死亡人数的总和[8] ,因此 ,世界卫生组织在 1 993年和1 997年两度发出警告。去年 3月 ,我国卫生部的专家也宣布中国进入结核病的紧急状态 ,中国是除印度外的世界第二大结核病重灾区 ,如果不予以足够的重视 ,采取切实可行的措施 ,结核病将严重影响我国的现代化进程。造成结核病重新在世界抬头的原因很多 ,除了社会经济的因素外 ,结核分枝杆菌的耐药性和当前唯一可用的疫苗 卡介苗ＢＣＧ的免疫效果下…     

牛分枝杆菌单基因及双价融合基因DNA疫苗免疫效果的研究

利用PCR技术和SOE技术扩增牛分枝杆菌ag85b、esat-6、hsp65、mpb64基因和ag85b-esat-6、hsp65-esat-6和mpb64-esat-6融合基因,连接真核表达载体pCDNA3.1(+),构建重组质粒pCA、pCE6、pCH、pCM、pCAE、pCHE和pCME。转染SP2/0细胞,检测目的基因的表达。以各重组质粒和pCDNA3.1(+)及PBS免疫BALB/c小鼠后检测血清特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖情况和IFN~γ分泌情况。结果表明,七种重组质粒免疫后小鼠血清抗体水平持续上升,与 pCDNA3.1(+)对照组和PBS对照组相比差异显著 （P<0.05）,其中pCA组血清抗体水平明显高于其他六种DNA疫苗免疫组 （P<0.05）;三免两周后,融合基因免疫组的刺激值（SI值）与单基因免疫组相比差异显著（P<0.05）,其中以pCME组的SI值最高;PPD刺激后融合基因DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞分泌的IFN~γ高于单基因DNA疫苗组（P<0.05）,而两对照组则未检测到IFN~γ的产生。本试验成功构建了牛分枝杆菌ag85b、esat-6、hsp65、mpb64单基因和ag85b-esat-6、hsp65-esat-6、mpb64-esat-6双价融合基因DNA疫苗,从而为牛结核病新型疫苗的研制奠定了基础。     

结核分枝杆菌抗原蛋白的研究及其应用新进展

结核病(tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染引起的慢性传染病,是仅次于正在暴发的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的第二大单一感染致死病因。COVID-19的大流行对TB的诊断及治疗造成了破坏性的影响,全球实现终结TB目标的进展偏离了轨道。因此,早诊断、早治疗依然是防控TB蔓延的关键。TB精准诊断一直受MTB抗原特异性、检测技术特异性和灵敏度的影响,因此亟需挖掘高特异性新抗原、开发新检测技术。随着蛋白质基因组学(proteogenomics)和质谱技术的快速发展,从临床体液、组织样本中高效、精准靶向检测MTB特异性已知、甚至新抗原的表达,以及监测治疗过程中的抗原表达量的动态变化,是TB诊断及治疗的发展趋势。在MTB标准菌株H37Rv的4 008个注释基因中(NC＿000 962.3, NCBI),国内外报道的已注释抗原虽有140多个,但仅有极少的抗原应用于TB的筛查及辅助诊断,离世界卫生组织(World Health Organization, WHO)的诊断标准尚远。本文通过对MTB已报道抗原以及基...     

共表达结核杆菌Ag85A-ESAT-6融合抗原与IL-21核酸疫苗的构建及免疫效果研究

目的：构建结核杆菌Ag85A-ESAT-6融合抗原与细胞因子IL-21共表达核酸疫苗pIRES-IL-21-Ag85A-ESAT-6,研究其对小鼠免疫功能的影响。方法：用PCR方法分别扩增出Ag85A和IL-21编码基因,并先后插入质粒pIRES-ESAT-6中,构成共表达核酸疫苗pIRES-IL-21-Ag85A-ESAT-6;免疫小鼠后,通过CTL和NK细胞杀伤活性和脾细胞增殖试验,以及小鼠血清抗体、IFN-γ和IL-4的检测,评价该核酸疫苗的免疫效果。结果：pIRES-IL-21-Ag85A-ESAT-6核酸疫苗免疫鼠的CTL活性、脾细胞增殖反应、IFN-γ水平及血清抗体产生明显高于对照组,差异有显著性意义。结论：pIRES-IL-21-Ag85A-ESAT-6核酸疫苗能够诱导小鼠产生有效的免疫反应,可作为新型结核疫苗的候选组分。     

Transcriptional analysis of ESAT-6 cluster 3 in Mycobacterium smegmatis

Background  

The ESAT-6 (early secreted antigenic target, 6 kDa) family collects small mycobacterial proteins secreted by Mycobacterium tuberculosis, particularly in the early phase of growth. There are 23 ESAT-6 family members in M. tuberculosis H37Rv. In a previous work, we identified the Zur- dependent regulation of five proteins of the ESAT-6/CFP-10 family (esxG, esxH, esxQ, esxR, and esxS). esxG and esxH are part of ESAT-6 cluster 3, whose expression was already known to be induced by iron starvation.     

结核分枝杆菌基因组学与基因组进化

在后基因组时代,特别是在新的测序理论和设备大发展的背景下,一些重大传染性致病微生物基因组序列正在被逐一测定,并且随后的基因功能注释,蛋白质三维结构重建等工作也正在开展,以期对致病微生物的生物学特性、诊断策略和治疗方法等有突破性的认识.作为对人类健康一直存在严重威胁的结核分枝杆菌,其基因组在进化中所发生的各种遗传事件对其生物学性质、致病能力和抗药性等各方面有重要作用.本文旨在阐述结核分枝杆菌的起源及其基因组特征,论述其基因组进化的研究进展.     

CFP-10/ESAT-6特异性IFN-g释放反应诊断活动性肺结核的研究

前期研究已经建立了基于结核分枝杆菌特异性抗原CFP-10/ESAT-6融合蛋白刺激外周血单核细胞IFN-γ释放反应,本研究旨在证实该方法在活动性肺结核及结核菌潜伏感染诊断中的意义。实验对象包括111例当地医院收治的活动性肺结核病人(病例组)及283例某大学入学新生(健康对照者)。采集肝素抗凝血,分别加入含结核菌抗原CFP-10/ESAT-6、植物血凝素及无刺激物(PBS)的细胞培养孔中,培养过夜,次日收集血清,进行IFN-γ检测。同时,对其中58位病人志愿者及46位健康对照志愿者进行了结核菌素(PPD)皮内变态反应。病例组与健康对照组的PPD皮内变态反应阳性率分别为79.3%(46/58)和76.1%(35/46),无显著差异(P>0.05),表明PPD皮内变态反应不能用于活动性肺结核的检测。病例组IFN-γ体外释放反应的阳性率为95.5%(106/111),而健康对照组阳性率为16.3%(46/283),两组间均存在极显著差异,表明IFN-γ体外释放反应诊断活动性肺结核具有很高的灵敏度(95.5%)与良好的特异性。在健康组中,IFN-γ体外释放反应与PPD皮内变态反应的总符合率为50.0%,且IFN-g体外...     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的重组表达及膜定位研究

从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出ESAT-6基因,克隆入pET21a(+)载体.将成功构建的pET21a(+)-ESAT-6重组质粒转化入感受态BL21(DE3)中,经诱导表达后,使用SDS.PAGE和Western blot鉴定.超声破碎后发现目的蛋白以可溶性表达形式存在,经过Ni-NTA柱和DEAE-Seph...     

Insights into battles between Mycobacterium tuberculosis and macrophages

As the first line of immune defense for Mycobacterium tuberculosis (Mtb), macrophages also provide a major habitat for Mtb to reside in the host for years. The battles between Mtb and macrophages have been constant since ancient times. Triggered upon Mtb infection, multiple cellular pathways in macrophages are activated to initiate a tailored immune response toward the invading pathogen and regulate the cellular fates of the host as well. Toll-like receptors (TLRs) expressed on macrophages can recognize pathogen-associated-molecular patterns (PAMPs) on Mtb and mediate the production of immune-regulatory cytokines such as tumor necrosis factor (TNF) and type I Interferons (IFNs). In addition, Vitamin D receptor (VDR) and Vitamin D-1-hydroxylase are up-regulated in Mtb-infected macrophages, by which Vitamin D participates in innate immune responses. The signaling pathways that involve TNF, typeI IFNs and Vitamin D are inter-connected, which play critical roles in the regulation of necroptosis, apoptosis, and autophagy of the infected macrophages. This review article summarizes current knowledge about the interactions between Mtb and macrophages, focusing on cellular fates of the Mtb-infected macrophages and the regulatory molecules and cellular pathways involved in those processes.     

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6的表达、纯化和鉴定

目的：克隆结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法：用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出ESAT-6基因片段,克隆至pMD18一T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T－1并在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白经SDS—PAGE及Westem—blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。结果：成功克隆了ESAT-6基因,并对其在E．coli中进行了表达,SDS—PAGE及Western—blot分析表明表达产物正确。通过GST纯化系统获得34kD纯化蛋白,与文献报道相符。结论：成功获得了纯化的ESAT-6蛋白,为进一步研究ESAT－6蛋白的致病机理提供了实验依据。     

稳定表达结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的RAW264.7细胞系的建立

为研究结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis分泌蛋白ESAT-6 (Early secreted antigenic target of 6 kDa) 对巨噬细胞相关功能的影响,将正确构建的重组质粒pEGFP-C1-ESAT-6和空载体pEGFP-C1以脂质体介导的方法转染至小鼠巨噬细胞RAW264.7中,经过G418筛选后建立稳定表达EGFP-ESAT6融合蛋白以及EGFP的细胞系,并通过RT-PCR、荧光显微镜及Western blotting方法,在基因和蛋白两个水平对所建立的稳转细胞系进行鉴定。结果证实EGFP-ESAT6融合基因成功整合入RAW264.7细胞基因组并能够稳定表达,为后续的ESAT-6调控巨噬细胞机理研究提供了平台。