两种色型黄粉虫酚氧化酶原的cDNA克隆、生物信息学分析及表达水平检测

酚氧化酶是黑色素合成和昆虫免疫的关键酶, 通常以无活性的酚氧化酶原形式存在。为给黄粉虫Tenebrio molitor遗传分化和免疫防御研究提供参考, 本研究采用PCR和RACE技术克隆了黄、 黑两种色型黄粉虫幼虫的酚氧化酶原基因Tm-ppo, 对其cDNA序列及其推导的氨基酸序列进行生物信息学分析, 采用实时荧光定量PCR检测其在两种色型黄粉虫不同发育阶段mRNA表达水平上的动态变化。结果表明： 从黄、 黑两种色型黄粉虫幼虫中克隆出的两个Tm-ppo cDNA序列全长均为2 199 bp, 碱基序列一致性为99%, 包含一个2 055 bp的开放阅读框, 编码684个氨基酸, 它们的编码蛋白有3个氨基酸差异： 第176位（P→A）、 256位（V→A）和648位（I→M）。这两个基因分别被命名为Tm-ppo-1和Tm-ppo-2 （GenBank登录号分别为JX987235和JX987234）。 Tm-ppo-1和Tm-ppo-2编码的酚氧化酶原异构体蛋白（分别为Tm-PPO-1和Tm-PPO-2）存在一个可能的酚氧化酶原水解活化位点（R50~F51残基之间）和一个双铜结合中心（第196~239位残基和第344~411位残基）; 同时含有一个类似巯基酯区域的序列（第579~588位残基）及一个C 末端保守基序（第634~645位残基）; 但它们无氨基端疏水信号肽序列, 也不存在跨膜区域。Tm-PPO-1和Tm-PPO-2的二级结构由大量的α 螺旋、 β-折叠和无规则卷曲组成; 三级结构分为前导域（第16~66位残基）、 不相邻的功能域Ⅰ（第3~15位残基和第67~181位残基）、 功能域Ⅱ（第182~419位残基）和功能域Ⅲ（第420~679位残基）4部分。此外, Tm-ppo-1和Tm-ppo-2在黄、 黑两种色型黄粉虫的各发育期均有表达, 并且不同发育阶段的mRNA表达水平呈现明显的变化规律： 幼虫期﹥成虫期﹥蛹期。同时, 环境温度对Tm-ppo-1和Tm-ppo-2的mRNA表达具有显著影响： 与常温对照组（25~30℃）相比, 42℃暴露24 h和48 h的两种色型黄粉虫幼虫、 蛹和成虫的mRNA表达量明显下调。相同试验条件下, 黑色型黄粉虫幼虫和成虫的Tm-ppo-2 mRNA表达量明显高于黄色型幼虫和成虫的Tm-ppo-1 mRNA表达量, 但两种色型黄粉虫蛹的Tm-ppo异构体表达量无显著差异。本研究为进一步探讨黄粉虫的遗传分化和免疫防御提供了有益参考。     

黄粉虫热休克蛋白70基因的克隆、序列分析与表达（英文）

为给黄粉虫Tenebrio molitor抗逆机理研究提供理论依据, 本研究采用PCR和RACE法从黄粉虫幼虫中克隆出一个热休克蛋白70基因Tmhsp70, 并运用半定量RT-PCR法检测其在黄粉虫不同发育阶段的mRNA表达水平。结果表明： 克隆出的Tmhsp70 序列全长2 282 bp, 具有一个富含A的115 bp 5′ 非翻译区和一个1 935 bp的开放阅读框及一个富含A、 T的232 bp 3′-非翻译区。5′-非翻译区含有7个热休克元件nGAAn, 3′-非翻译区末端有长22 bp的Poly(A)尾。Tmhsp70编码的黄粉虫热休克蛋白（TmHSP70）具有3个典型的HSP70特征基序（IDLGTTYS, IFDLGGGTFDVSIL和IVLVGGSTRIPKIQQ）和1个胞质HSP70末端特征基序（EEVD）, 无信号肽和跨膜区域, 包含2个主要的结构域, 即： N-端42 kDa的高度保守ATPase功能域和C-端18 kDa的保守多肽结合功能域。ATPase功能域的三级结构由2个大球形亚功能域组成, 具有1个核苷酸结合中心; 多肽结合功能域形成1个双层4股β-折叠片样的三明治结构和2个α-螺旋, 内含1个多肽结合通道。此外, 黄粉虫Tmhsp70 mRNA的表达具有热激诱导和发育调控的特征。半定量RT-PCR分析表明, 42℃热激1 h的黄粉虫各发育阶段Tmhsp70 mRNA的表达量上升了1.4~26.9倍。25℃下1日龄黄粉虫蛹中的Tmhsp70 mRNA 表达量要高于其余各发育阶段的累积表达量; 42℃热激1 h 后90日龄幼虫中的Tmhsp70 mRNA 表达量最丰富, 既高于30日龄和60日龄幼虫中的累积表达量, 也高于15日龄和30日龄成虫中的累积表达量。这些结果为进一步研究黄粉虫热休克蛋白的结构、 功能和表达调控及其与抗逆性的关系奠定了基础。     

拟黑多刺蚁雌激素相关受体基因cDNA的克隆及生物信息学分析

雌激素相关受体（estrogen related receptors, ERRs）能够直接与类固醇激素受体共激活子（steroidhormone receptor coactivator,SRC）结合,激活靶基因的表达,与众多生理和发育过程有关.采用RT-PCR、RACE等方法从拟黑多刺蚁Polyrhachis vicina Roger克隆得到了雌激素相关受体基因的cDNA克隆,命名为pvERR （GenBank 登录号为EF474463）,并采用生物信息学方法对其cDNA和编码的蛋白质的理化性质、蛋白质二级及三级结构、分子系统进化关系等进行了预测和推断.结果表明：pvERR基因cDNA全长1 935 bp,包含一个1 305 bp的开放阅读框、245 bp的5′-UTR 和385 bp的3′-UTR,编码一个由434个氨基酸组成的蛋白质.pvERR的配体结合区（ligand binding domain,LBD）主要由两个β折叠和11个α螺旋（H1, H3～H12, 缺少H2）构成,这与哺乳类动物已知晶体结构的ERR_γ的配体结合区结构非常相似.pvERR氨基酸序列与其他昆虫ERRs氨基酸序列同源性很高,它与西方蜜蜂Apis mellifera雌激素相关受体amERR氨基酸序列相似性达到89.9 %;在进化关系上,pvERR与人类Homo sapiens ERRs的关系比果蝇Drosophila melanogaster雌激素相关受体dERR与人类的更近.本文可为进一步研究pvERR在昆虫发育中的功能提供有价值的信息.     

黄粉虫不同抗冻蛋白基因家族成员的低温应激表达

黄粉虫Tenebrio molitor L.抗冻蛋白基因家族有多个成员,其氨基酸数量和蛋白结构存在差异。尽管有报道发现冷驯化后这些抗冻蛋白的表达量会升高,但不同家族成员是否存在功能分化尚不清楚。本研究中,检测了冷驯化对低温死亡率的效应和对不同类型的抗冻蛋白家族成员基因表达量的影响。结果表明,冷驯化可以显著降低黄粉虫幼虫的低温死亡率和提高不同类型抗冻蛋白基因的表达量。其中,长的抗冻蛋白和低温死亡率的相关关系最为明显。说明不同的抗冻蛋白家族成员的功能有明显的分化,为进一步理解抗冻蛋白的活性和利用抗冻蛋白提供了新的认识。     

两种色型黄粉虫的生长发育、存活与饲料利用效率比较研究（英文）

黄粉虫Tenebrio molitor L.是一种重要的资源昆虫, 根据60日龄幼虫的体壁颜色, 通过连续12代的自然选育, 获得了黄、 黑2种色型黄粉虫。为进一步给黄粉虫优良品种培育提供科学的理论依据, 本实验首先对选育出的2种色型黄粉虫的生长发育、 存活及饲料利用效率进行了比较研究。结果表明： 2种色型黄粉虫的孵化率和化蛹率均约为83%和97%, 无显著差异; 但黄色型成虫的羽化率（♀：95%, ♂：91%）却明显高于黑色型成虫的羽化率（♀： 82%, ♂： 83%）。2种色型黄粉虫的卵和蛹历期均约为7 d和10 d, 亦无显著差异; 但黑色型幼虫较黄色型幼虫发育更快、 更整齐。黑色型幼虫共历经12~15龄, 黄色型幼虫历经12~17龄, 并且2种色型黄粉虫幼虫均以历经14龄居多, 历经14龄的黄、 黑2色型黄粉虫幼虫的比例分别为27%和53%。以14龄计, 黄、 黑2色型黄粉虫从卵至成虫的总历期分别为171 d和151 d。此外, 黄色型幼虫对饲料的平均利用效率明显高于同日龄黑色型幼虫, 黄色型幼虫的平均饲料消化率（AD）、 转化率（ECD）和利用率（ECI）分别为66.5%, 50.6%和33.6%, 而黑色型幼虫的平均饲料消化率（AD）、 转化率（ECD）和利用率（ECI）分别为62.1%, 46.8%和29.1%; 但2种色型黄粉虫同日龄幼虫的生长率和存活率差异不显著。综合上述结果可知, 黑色型黄粉虫较黄色型黄粉虫发育更快、 更整齐, 而黄色型黄粉虫对饲料的平均利用效率明显高于黑色型黄粉虫。这为进一步培育黄粉虫优良品种提供了有益参考。     

Gene expression of different antifreeze proteins of Tenebrio molitor in response to cold acclimation

黄粉虫Tenebrio molitorL.抗冻蛋白基因家族有多个成员,其氨基酸数量和蛋白结构存在差异.尽管有报道发现冷驯化后这些抗冻蛋白的表达量会升高,但不同家族成员是否存在功能分化尚不清楚.本研究中,检测了冷驯化对低温死亡率的效应和对不同类型的抗冻蛋白家族成员基因表达量的影响.结果表明,冷驯化可以显著降低黄粉虫幼虫的低温死亡率和提高不同类型抗冻蛋白基因的表达量.其中,长的抗冻蛋白和低温死亡率的相关关系最为明显.说明不同的抗冻蛋白家族成员的功能有明显的分化,为进一步理解抗冻蛋白的活性和利用抗冻蛋白提供了新的认识.     

二色补血草硫氧还蛋白(Trx)的克隆和表达分析

从二色补血草cDNA文库中分离出1个硫氧还蛋白基因全长cDNA序列。基因全长1138bp,其中,5’非翻译（UTR）区128bp,3＇非翻译区212bp,开放阅读框（ORF）全长798bp,编码265个氨基酸,编码蛋白的分子量为28．58kDa,理论等电点（pI）为9．68。BlastP分析表明二色补血草Trx与拟南芥Trx序列同源性为52％,与葡萄7h序列同源性为76％,从11个物种的氨基酸多序列比对可以看出Trx氨基酸序列保守性较高。实时定量RT-PCR方法检测低温、NaCl和PEG胁迫不同时间后的基因在二色补血草中表达模式的结果表明,NaCl能诱导Trx基因在二色补血草叶中表达,胁迫24h后达到高峰,而聚乙二醇和低温处理则抑制Trx在二色补血草根和叶的表达。     

棘孢木霉（Trichoderma asperellum）几丁质酶基因的克隆与生物信息学分析

几丁质酶作为木霉菌防治植物病虫害的主要因子,在生物防治和环境保护等领域发挥着重要的作用.为了研究棘孢木霉（Trichoderma asperellum）的生防机制并获得与其相关的功能基因,本研究通过RT-PCR、3′-RACE及5′-TAIL- PCR技术克隆了T. asperellum 1个几丁质酶基因Tachi1,对该基因进行了生物信息学分析,并利用毕赤酵母表达系统进行表达验证. Tachi1的DNA序列长1 635 bp,含有3个内含子,包含1 275 bp的开放阅读框,编码424个氨基酸;Tachi1属于糖基水解酶18家族内切几丁质酶,包含SIGGW底物结合位点和FDGIDXDWE活性中心位点,信号肽长度为22个氨基酸,成熟肽分子量为44 kD,二级结构以α-螺旋 、β-折叠和无规则卷曲为结构元件,三级结构为(α/β)8的圆桶形结构. 转Tachi1基因酵母工程菌可高效分泌表达几丁质酶Tachi1,甲醇诱导培养8 d几丁质酶酶活可达9.25 U/mL.     

家蝇抗菌肽Attacin-2基因的克隆、序列分析和诱导表达

攻击素(attacin)作为昆虫抗菌肽之一, 在昆虫的先天免疫中起着重要作用。本研究通过家蝇Musca domestica EST序列筛选并结合RACE技术克隆了家蝇的Attacin-2基因(Mdatta2) cDNA序列。其全长819 bp, 包含一个726 bp的完整开放阅读框(open reading frame, ORF), 以及42 bp的5′末端非翻译区(5′-UTR)和51 bp的3′末端非翻译区(3′-UTR), 编码241个氨基酸残基, 推导的多肽N端22个氨基酸残基为信号肽序列。同源性分析表明, 其氨基酸序列与嗜凤梨果蝇Drosophila ananassae的Attacin一致性最高(46%)。以邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建的系统关系表明, 家蝇的Attacin-2与其他双翅目昆虫的Attacin起源于共同的祖先, 属于Attain_C超家族。应用实时荧光定量PCR的方法研究家蝇幼虫在受到外源细菌刺激时Mdatta2基因的表达, 结果显示, 在大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus分别刺激后3 h和6 h, 家蝇幼虫Mdatta2表达量出现显著上调。Mdatta2基因在家蝇幼虫体内呈诱导型表达, 表达水平随诱导时间的不同而变化, 提示Mdatta2基因可能在家蝇免疫防御过程中起着重要作用。     

二色补血草OEE2基因的克隆和表达

从二色补血草中分离出一条含有完整开放读码框（ORF）序列的OEE2基因。该基因全长994bp,其中5’非翻译区27bp,3’非翻译区160bp,ORF全长807bp,共编码264个氨基酸,编码蛋白的分子量为28．2kDa,理论上的等电点为7．66。BlastP分析表叽二色补血草OEE2与马铃薯OEE2序列同源性最高,与喇叭水仙OEE2序列同源性最低,从9个物种的氨基酸多序列比对中可以看出,OEE2的氨基酸序列保守性较高。实时定量RT．PCR方法检测该基因对低温、NaCl和聚乙二醇（PEG）胁迫的基因表达模式的结果表明,PEG和低温能诱导OEE2基因在二色补血草叶中表达,这两种处理的OEE2基因表达量于胁迫48h后都达到高峰,而在NaCl胁迫下OEE2在二色补血草根和叶中表达都受抑制。     

应用差示扫描量热法检测昆虫总蛋白的热滞活性

产生抗冻蛋白是寒带昆虫抵御低温的重要机制之一, 但检测其活性仍存在一些困难, 尤其对于个体较小的昆虫样品。为了探索差示扫描量热法是否适于检测昆虫总蛋白的热滞活性, 本研究利用差示扫描量热法对黄粉虫Tenebrio molitor幼虫的总蛋白和血淋巴分别进行了热滞活性检测。结果表明： 黄粉虫总蛋白的热滞活性（0.49~0.98℃）要低于血淋巴（2.54~4.34℃）。通过这种方法, 进一步检测了3种在内蒙古大兴安岭林区采集到的越冬昆虫： 稠李巢蛾Yponomeuta evonymallus幼虫、 舞毒蛾Lymantria dispar卵和落叶松八齿小蠹Ips subelongatus成虫。结果发现, 它们都存在热滞活性, 其中稠李巢蛾的热滞活性为0.34~0.43℃, 舞毒蛾的热滞活性为0.35~0.42℃, 落叶松八齿小蠹的热滞活性为0.37~0.40℃, 说明这3种昆虫能以产生抗冻蛋白的方式作为越冬策略之一。本研究表明通过差示扫描量热法检测昆虫总蛋白是否存在热滞活性来判断抗冻蛋白的存在是可行的。     

A complex family of highly heterogeneous and internally repetitive hyperactive antifreeze proteins from the beetle Tenebrio molitor.

We have previously identified a Thr- and Cys-rich thermal hysteresis (antifreeze) protein (THP) in the beetle Tenebrio molitor that has 10-100 times the freezing point depression activity of fish antifreeze proteins. Because this 8.4 kDa protein is significantly different in its properties from THP preparations previously reported from this insect, a thorough search was undertaken for other antifreeze types. Many active proteins were observed, but all appeared to be isoforms of the THP that differed in their number of 12-amino acid repeats (consensus sequence CTxSxxCxxAxT), amino acid substitutions, and N-linked glycosylation. Mass spectral analysis has matched most of these isoforms with cDNA sequences of 17 different clones from a larval fat body library that encode eight different mature THPs containing 84, 96, or 120 amino acids. Genomic Southern blots suggest there may be 30-50 tightly linked copies of the gene, which is a signature consistently seen with unrelated fish antifreeze protein genes, and one that has been associated with the need to rapidly increase gene product in response to climate change. A three-dimensional model is proposed for the fully disulfide-bonded structure of T. molitor THP, which can accommodate addition or deletion of 12-amino acid repeats. The structure is a beta-helix that places most of the Thr in a regular array on one side of the protein to form a putative ice-binding surface.     

黄粉虫胰蛋白酶样酶基因TMTLSP全长cDNA的克隆和序列分析

以黄粉虫(Tenebrio molitor)幼虫全RNA逆转录得到的cDNA为模板,参照地鳖（Eupolyphaga sinensis）纤溶酶（fibrinolytic enzyme）简并引物,进行温度梯度PCR．以得到的扩增产物为基础,采用RACE得到基因全长cDNA,命名为黄粉虫胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(Tenebrio molitor trypsin-like serine protease,TMTLSP)．TMTLSP全长869 bp(GenBank No. JN662461),开放阅读框为777 bp,编码258个氨基酸,并具有蛋白酶样特有的起始位点、活性中心预计底物结合位点．经过比对分析,该基因编码的氨基酸序列与赤拟谷盗、谷蠹、光亮扁角水虻、美洲大蠊等多种昆虫的胰蛋白酶或丝氨酸蛋白酶有较高的相似性．本研究将为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的提取及研究提供更为广泛的材料及研究依据．     

优雅蝈螽水溶性和类膜结合型海藻糖酶编码cDNA的鉴定及其在体内的表达

海藻糖酶是一种二糖水解酶,催化海藻糖转换为葡萄糖,为昆虫包括发育、壳多糖合成及飞翔代谢在内的多种生理过程所必需。尽管某些昆虫的海藻糖酶基因已被鉴定,但优雅蝈螽的海藻糖酶编码序列尚未见报告。本研究采用RACE结合多重PCR技术,分离鉴定优雅蝈螽的水溶性海藻糖酶（GgTre1）和类膜结合型海藻糖酶（GgTre2-like）的全长编码序列（cDNA）,包括携带不同长度3′-非翻译区（3′-UTR）的3个GgTre1 cDNA 亚型（GenBank：No.KY400001-KY400003）和3个GgTre2-like cDNA 亚型（GenBank：No.KY400004-KY400006）。 3个GgTre1 cDNA序列分别为2 107,2 021和1 914 bp,具有相同长度的5′-UTR（33 bp）,但3′-UTR 长度不同,分别为322,248和129 bp。GgTre1-2 cDNA含1 740 bp,编码579 个氨基酸残基组成的多肽链,分子量为67.29 kD;与之不同,根据cDNA演绎的GgTre1-1和GgTre1-3序列较GgTre1-2多4个氨基酸残基,多肽链的分子量为67.88 kD。3个GgTre2-like cDNA（GgTre2-like-1,-2和-3）序列全长分别为2 491,2 460 和2 381 bp。5′-UTR 均为284 bp,3′-UTR 分别为398,367和285 bp。GgTre2-like cDNA开阅读框为1 809 bp,编码602 氨基酸残基组成的多肽链,分子量为67.88 kD。实时定量PCR, 分析GgTre1和GgTre2-like基因在雌、雄个体（各20个）的组织特异性表达。结果显示,GgTre1 在卵巢和附腺表达量最高;GgTre2-like 主要在卵巢表达,在雄性肌肉和马氏管的表达量高于其他组织。上述结果表明,本研究从优雅蝈螽分离到3′-UTR长度不同的3个水溶性和3个类膜结合型海藻糖酶cDNA序列。结果还提示,GgTre1 在各组织的表达差异较大,而GgTre2-like 在各组织的表达相对稳定。不同长度3′-UTR的GgTre1 和 GgTre2-like 亚型的存在,以及不同长度的3′-UTR在翻译过程中的特殊作用,尚待今后研究证实。     

Tenebrio molitor抗冻蛋白基因家族cDNA片段的克隆、序列分析及原核表达

利用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)的方法, 克隆黄粉甲虫(Tenebrio molitor)抗冻蛋白基因cDNA片段并进行序列分析和原核表达。同源性分析表明, 获得9条新cDNA片段, 与黄粉甲虫抗冻蛋白基因家族的其他基因序列具有较高的同源性。重组质粒pGEX-4T-1-tmafp-XJ430, 转化E.coli BL21进行原核表达, SDS-PAGE分析结果表明, 抗冻蛋白基因以可溶性融合蛋白表达, 相对分子量为38 kDa。构建真核表达载体pCDNA3-tmafp-XJ430, 免疫小鼠, 获得的抗血清滴度为1:2 000。Western blotting 结果为单一的条带, 证明该抗血清具有针对抗冻蛋白TmAFP-XJ430抗原的专一性。     

准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因Mpafp149的生物信息学分析

利用生物信息学方法对准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因Mpafp149所编码蛋白MPAFP149进行分析,分别从氨基酸组成、理化性质、二三级结构和功能、进化关系等方面进行预测。结果表明MPAFP149与其他昆虫抗冻蛋白在氨基酸水平上具有79％的相似性,二级结构上预测其为水溶性蛋白,含有信号肽和跨膜区。三级结构上与黄粉虫抗冻蛋白YL-1具有较高的相似性,并且具有昆虫抗冻蛋白所特有的结构域。本研究为准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白功能的研究鉴定了基础。     

Cloning, sequencing and prokaryotic expression of cDNAs for antifreeze protein family from beetle Tenebrio molitor

Partial cDNA sequences coding for antifreeze proteins in Tenebrio molitor were obtained by RT-PCR.Sequence analysis revealed nine putative cDNAs with a high degree of homology to Tenebrio molitor antifreeze protein genes published in GenBank.The recombinant pGEX-4T-l-tmafp-XJ430 was introduced into E.coli BL21 to induce a GST fusion protein by IPTG.SDS-PAGE analysis for the fusion protein shows a band of 38 kDa.pCDNA3- tmafp-XJ430 was injected into mice to generate antiserum which was later detected by indirect ELISA.The titer of the antibody was 1:2000.Western blot-ting analysis shows that the antiserum was specifically against the antifreeze protein.Our results laid the founda-tion for further studies on the properties and functions of insect antifreeze proteins.