两种色型黄粉虫酚氧化酶原的cDNA克隆、生物信息学分析及表达水平检测

酚氧化酶是黑色素合成和昆虫免疫的关键酶, 通常以无活性的酚氧化酶原形式存在。为给黄粉虫Tenebrio molitor遗传分化和免疫防御研究提供参考, 本研究采用PCR和RACE技术克隆了黄、 黑两种色型黄粉虫幼虫的酚氧化酶原基因Tm-ppo, 对其cDNA序列及其推导的氨基酸序列进行生物信息学分析, 采用实时荧光定量PCR检测其在两种色型黄粉虫不同发育阶段mRNA表达水平上的动态变化。结果表明： 从黄、 黑两种色型黄粉虫幼虫中克隆出的两个Tm-ppo cDNA序列全长均为2 199 bp, 碱基序列一致性为99%, 包含一个2 055 bp的开放阅读框, 编码684个氨基酸, 它们的编码蛋白有3个氨基酸差异： 第176位（P→A）、 256位（V→A）和648位（I→M）。这两个基因分别被命名为Tm-ppo-1和Tm-ppo-2 （GenBank登录号分别为JX987235和JX987234）。 Tm-ppo-1和Tm-ppo-2编码的酚氧化酶原异构体蛋白（分别为Tm-PPO-1和Tm-PPO-2）存在一个可能的酚氧化酶原水解活化位点（R50~F51残基之间）和一个双铜结合中心（第196~239位残基和第344~411位残基）; 同时含有一个类似巯基酯区域的序列（第579~588位残基）及一个C 末端保守基序（第634~645位残基）; 但它们无氨基端疏水信号肽序列, 也不存在跨膜区域。Tm-PPO-1和Tm-PPO-2的二级结构由大量的α 螺旋、 β-折叠和无规则卷曲组成; 三级结构分为前导域（第16~66位残基）、 不相邻的功能域Ⅰ（第3~15位残基和第67~181位残基）、 功能域Ⅱ（第182~419位残基）和功能域Ⅲ（第420~679位残基）4部分。此外, Tm-ppo-1和Tm-ppo-2在黄、 黑两种色型黄粉虫的各发育期均有表达, 并且不同发育阶段的mRNA表达水平呈现明显的变化规律： 幼虫期﹥成虫期﹥蛹期。同时, 环境温度对Tm-ppo-1和Tm-ppo-2的mRNA表达具有显著影响： 与常温对照组（25~30℃）相比, 42℃暴露24 h和48 h的两种色型黄粉虫幼虫、 蛹和成虫的mRNA表达量明显下调。相同试验条件下, 黑色型黄粉虫幼虫和成虫的Tm-ppo-2 mRNA表达量明显高于黄色型幼虫和成虫的Tm-ppo-1 mRNA表达量, 但两种色型黄粉虫蛹的Tm-ppo异构体表达量无显著差异。本研究为进一步探讨黄粉虫的遗传分化和免疫防御提供了有益参考。     

Tenebrio molitor抗冻蛋白基因家族cDNA片段的克隆、序列分析及原核表达

利用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)的方法, 克隆黄粉甲虫(Tenebrio molitor)抗冻蛋白基因cDNA片段并进行序列分析和原核表达。同源性分析表明, 获得9条新cDNA片段, 与黄粉甲虫抗冻蛋白基因家族的其他基因序列具有较高的同源性。重组质粒pGEX-4T-1-tmafp-XJ430, 转化E.coli BL21进行原核表达, SDS-PAGE分析结果表明, 抗冻蛋白基因以可溶性融合蛋白表达, 相对分子量为38 kDa。构建真核表达载体pCDNA3-tmafp-XJ430, 免疫小鼠, 获得的抗血清滴度为1:2 000。Western blotting 结果为单一的条带, 证明该抗血清具有针对抗冻蛋白TmAFP-XJ430抗原的专一性。     

利用细菌表达dsRNA介导黄粉虫抗冻蛋白基因的RNA干扰

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是研究基因功能的一种重要工具。为了利用RNAi技术对黄粉虫抗冻蛋白(Antifreeze protein,AFP)基因的非抗冻功能进行验证,将黄粉虫抗冻蛋白基因Tmafp433的相应干扰片段构建至L4440干扰载体并转化大肠杆菌HT115(DE3)菌株,利用IPTG诱导表达特异的afp基因相应dsRNA,纯化后注射黄粉虫幼虫,通过实时荧光定量PCR检测afp基因在mRNA水平的变化。结果显示含有L4440-Tmafp重组质粒的HT115菌株可以表达干扰afp基因的dsRNA,命名为Tmafp-dsRNA。用Tmafp-dsRNA注射黄粉虫24 h后,Tmafps的表达受到显著抑制,相比对照下降了60.8%。本研究表明通过注射dsRNA可有效抑制黄粉虫afp基因的表达。     

黄粉虫热休克蛋白70基因的克隆、序列分析与表达（英文）

为给黄粉虫Tenebrio molitor抗逆机理研究提供理论依据, 本研究采用PCR和RACE法从黄粉虫幼虫中克隆出一个热休克蛋白70基因Tmhsp70, 并运用半定量RT-PCR法检测其在黄粉虫不同发育阶段的mRNA表达水平。结果表明： 克隆出的Tmhsp70 序列全长2 282 bp, 具有一个富含A的115 bp 5′ 非翻译区和一个1 935 bp的开放阅读框及一个富含A、 T的232 bp 3′-非翻译区。5′-非翻译区含有7个热休克元件nGAAn, 3′-非翻译区末端有长22 bp的Poly(A)尾。Tmhsp70编码的黄粉虫热休克蛋白（TmHSP70）具有3个典型的HSP70特征基序（IDLGTTYS, IFDLGGGTFDVSIL和IVLVGGSTRIPKIQQ）和1个胞质HSP70末端特征基序（EEVD）, 无信号肽和跨膜区域, 包含2个主要的结构域, 即： N-端42 kDa的高度保守ATPase功能域和C-端18 kDa的保守多肽结合功能域。ATPase功能域的三级结构由2个大球形亚功能域组成, 具有1个核苷酸结合中心; 多肽结合功能域形成1个双层4股β-折叠片样的三明治结构和2个α-螺旋, 内含1个多肽结合通道。此外, 黄粉虫Tmhsp70 mRNA的表达具有热激诱导和发育调控的特征。半定量RT-PCR分析表明, 42℃热激1 h的黄粉虫各发育阶段Tmhsp70 mRNA的表达量上升了1.4~26.9倍。25℃下1日龄黄粉虫蛹中的Tmhsp70 mRNA 表达量要高于其余各发育阶段的累积表达量; 42℃热激1 h 后90日龄幼虫中的Tmhsp70 mRNA 表达量最丰富, 既高于30日龄和60日龄幼虫中的累积表达量, 也高于15日龄和30日龄成虫中的累积表达量。这些结果为进一步研究黄粉虫热休克蛋白的结构、 功能和表达调控及其与抗逆性的关系奠定了基础。     

两种色型黄粉虫的生长发育、存活与饲料利用效率比较研究（英文）

黄粉虫Tenebrio molitor L.是一种重要的资源昆虫, 根据60日龄幼虫的体壁颜色, 通过连续12代的自然选育, 获得了黄、 黑2种色型黄粉虫。为进一步给黄粉虫优良品种培育提供科学的理论依据, 本实验首先对选育出的2种色型黄粉虫的生长发育、 存活及饲料利用效率进行了比较研究。结果表明： 2种色型黄粉虫的孵化率和化蛹率均约为83%和97%, 无显著差异; 但黄色型成虫的羽化率（♀：95%, ♂：91%）却明显高于黑色型成虫的羽化率（♀： 82%, ♂： 83%）。2种色型黄粉虫的卵和蛹历期均约为7 d和10 d, 亦无显著差异; 但黑色型幼虫较黄色型幼虫发育更快、 更整齐。黑色型幼虫共历经12~15龄, 黄色型幼虫历经12~17龄, 并且2种色型黄粉虫幼虫均以历经14龄居多, 历经14龄的黄、 黑2色型黄粉虫幼虫的比例分别为27%和53%。以14龄计, 黄、 黑2色型黄粉虫从卵至成虫的总历期分别为171 d和151 d。此外, 黄色型幼虫对饲料的平均利用效率明显高于同日龄黑色型幼虫, 黄色型幼虫的平均饲料消化率（AD）、 转化率（ECD）和利用率（ECI）分别为66.5%, 50.6%和33.6%, 而黑色型幼虫的平均饲料消化率（AD）、 转化率（ECD）和利用率（ECI）分别为62.1%, 46.8%和29.1%; 但2种色型黄粉虫同日龄幼虫的生长率和存活率差异不显著。综合上述结果可知, 黑色型黄粉虫较黄色型黄粉虫发育更快、 更整齐, 而黄色型黄粉虫对饲料的平均利用效率明显高于黑色型黄粉虫。这为进一步培育黄粉虫优良品种提供了有益参考。     

昆虫抗冻蛋白基因的克隆与表达研究进展

产生抗冻蛋白(antifreeze protein,AFP)是许多昆虫抵御寒冷的一种重要机制。昆虫抗冻蛋白基因的克隆和表达是研究抗冻蛋白活性和功能的主要途径。文章归纳GenBank所登录的昆虫抗冻蛋白基因及其特点,总结昆虫抗冻蛋白基因的天然表达和基因工程表达方面尚未明确或需要克服的一些问题。目前在GenBank注册的昆虫抗冻蛋白基因约100个,集中于9种昆虫隶属鞘翅目3个科和鳞翅目1个科。昆虫抗冻蛋白基因具有多拷贝和多同种型(isoforms)的特点。昆虫抗冻蛋白的天然表达具有物种间和同种型间的多样性。基因工程表达昆虫抗冻蛋白需要克服表达量低活性不高的问题。对昆虫抗冻蛋白表达规律的研究有助于全面认识其功能。     

异育银鲫c型溶菌酶全长cDNA序列的生物信息学分析及其组织表达分析

利用RACE及克隆等方法获得了异育银鲫（Carassius auratus gibelio）c型溶菌酶基因全长cDNA序列．序列分析表明,所克隆的异育银鲫溶菌酶的cDNA全长751 bp,包括溶菌酶基因开放阅读框（ORF）438 bp,5′ 非编码区（UTR）为109 bp和3′ UTR为204 bp．438 bp ORF共编码146个氨基酸,其成熟肽的分子量预测值为14　543.6,理论等电点为8.86．通过ClustalW软件,将异育银鲫和其它多个物种c型溶菌酶的氨基酸序列进行多序列比对发现,所克隆的异育银鲫溶菌酶编码的氨基酸序列中存在c型溶菌酶的活性中心（Glu53和Asp69）,且与活性位点相邻的氨基酸序列高度保守．同时,8个保守的半胱氨酸残基也与其它物种的c型溶菌酶相一致．结合BLASTN分析的结果,可以确认所获得的异育银鲫溶菌酶cDNA序列属于c型溶菌酶．异育银鲫c型溶菌酶和人c型溶菌酶（pdb 1at6_）在蛋白质序列上有50%相似性,其三维（3-D）结构非常类似．通过氨基酸空间位置比较发现,两者具有类似的酶活中心,异育银鲫c型溶菌酶只能形成3个二硫键,比人少1个．荧光定量RT-PCR检测和溶菌酶活性测定显示,异育银鲫头肾和脾脏c型溶菌酶mRNA的表达量约为肝胰脏的2.9 倍和1.7 倍,异育银鲫头肾和脾脏的溶菌酶活性约为肝胰脏的6.2 倍和4倍．     

洛氏脊漠甲抗冻蛋白基因的克隆、表达和功能检测

为了研究抗冻蛋白基因是否在新疆荒漠昆虫洛氏脊漠甲 Pterocoma loczyi 中存在,利用 RT-PCR 技术克隆获得了洛氏脊漠甲抗冻蛋白的 cDNA 片段,命名为 Plafp743。测序结果表明洛氏脊漠甲 Plafp743 所编码的蛋白质由 94 个氨基酸组成,蛋白序列呈现规则结构 CTX₁X₂X₃X₄CX₅X₆X₇X₈X ₉。利用原核表达载体构建重组质粒 pGEX-4T-1-Plafp743,转化 Escherichia coli BL21 进行融合蛋白表达,SDS-PAGE 结果表明抗冻蛋白PLAFP基因以可溶性融合蛋白形式表达,相对分子质量 36 kD。用 Glutathione Sepharose 4B 亲和柱对表达蛋白进行纯化后,通过赤翅甲 Dendroides canadensis 抗冻蛋白的小鼠抗血清进行 Western blot 分析,结果表明纯化的 GST-PLAFP 融合蛋白与赤翅甲抗血清能够发生特异性的免疫反应。大肠杆菌的低温抗冻保护实验结果证明,30 μg/mL 的 GST-PLAFP 在-6℃ 对细菌具有显著的保护作用,且随着抗冻蛋白浓度的增加,抗冻保护作用的效 果也随之增加。本研究首次报道了从荒漠昆虫洛氏脊漠甲扩增得到抗冻蛋白基因,提示抗冻蛋白可能是荒漠昆虫普遍采取的过冬生存策略,为进一步开发利用昆虫抗冻蛋白奠定了基础。     

草鱼过氧化氢酶全长cDNA的克隆、序列同源分析与组织表达

过氧化氢酶(catalase,CAT)是生物体内抗氧化防御系统的关键酶之一,在清除过氧化氢而避免机体产生氧化应激的过程中起重要作用.本研究从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝胰脏中克隆了CAT完整编码序列(complete coding sequence,CDS).该CAT序列(GenBank登陆号:FJ560431)全长2 263 bp,包括完全开放阅读框(ORF) 1 575 bp、5'非编码区(UTR) 118 bp和3' UTR 570 bp.其ORF编码525个氨基酸残基,理论分子量为59.59 kD,等电点为7.02.在草鱼CAT cDNA的终止密码子附近,其3' UTR具有长且完整的AC重复序列,与斑马鱼、鲢鱼及啮齿类动物CAT的3' UTR AC重复序列相似.序列比较表明,草鱼CAT的核苷酸及推测氨基酸序列与其它多种物种的一致性均较高,其一致性分别为93.4%~43.0%和98.1%~63.3%.同时,草鱼CAT cDNA的推测氨基酸序列具有与其它动物高度保守的特征性基序,包括亚铁血红素结合信号序列"RLFSYPDTH"、酶活性中心序列"FDRERIPERVVHAKGA"及3个催化位点残基His74、Asn147和Tyr357.此外,草鱼CAT还具有保守的亚铁血红素结合口袋与NADPH 结合位点.根据草鱼CAT基因的上述特征,推测其属于CAT基因家族中的单功能或典型CAT基因亚群.采用实时荧光定量PCR (Q-PCR)检测草鱼CAT的组织表达特征.结果显示,草鱼CAT mRNA在所检测的11种组织器官中均有表达,其中在肝中表达水平量较高,在红肌、白肌和脂肪中表达量较低.本研究结果将有助于进一步探讨鱼类CAT基因的结构与功能,并为研究其抗氧化分子机理奠定基础.     

毛白杨COMT基因cDNA的克隆、序列与特异性表达分析

Ｌｉｇｎｉｎｉｓａｎａｂｕｎｄａｎｔｎａｔｕｒａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｎｌｙｓｅｃｏｎｄｔｏｔｈｅｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ,ａｓａｃｅｌｌｗａｌｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆａｌｌｖａｓｃｕｌａｒｐｌａｎｔｓｉｎｂｉｏｓｐｈｅｒｅ .Ｄｅｓｐｉｔｅｉｔｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｉｇ ｎｉｆｉｃａｎｃｅｉｎｐｌａｎｔｓ ,ｌｉｇｎｉｎｉｓａｎｕｎｄｅｓｉｒａｂｌｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｉｎｔｈｅｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓｏｆｐａｐｅｒｐｕｌｐｉｎｇ ,ａｎｄｉｔｈａｓｎｅｇａｔｉｖｅｉｍｐａｃｔｏ…     

Cloning, sequencing and prokaryotic expression of cDNAs for antifreeze protein family from beetle Tenebrio molitor

Partial cDNA sequences coding for antifreeze proteins in Tenebrio molitor were obtained by RT-PCR.Sequence analysis revealed nine putative cDNAs with a high degree of homology to Tenebrio molitor antifreeze protein genes published in GenBank.The recombinant pGEX-4T-l-tmafp-XJ430 was introduced into E.coli BL21 to induce a GST fusion protein by IPTG.SDS-PAGE analysis for the fusion protein shows a band of 38 kDa.pCDNA3- tmafp-XJ430 was injected into mice to generate antiserum which was later detected by indirect ELISA.The titer of the antibody was 1:2000.Western blot-ting analysis shows that the antiserum was specifically against the antifreeze protein.Our results laid the founda-tion for further studies on the properties and functions of insect antifreeze proteins.     

温度对黄粉虫幼虫生长发育及体液免疫防御能力的影响

【目的】探究饲养温度对黄粉虫Tenebrio molitor幼虫生长发育和体液免疫防御的影响。【方法】测定了不同温度（18, 22, 26和30℃）下饲养的黄粉虫幼虫的发育历期、蛹重、化蛹率;采用抑制区分析法测定了不同温度下饲养的免疫（用生理盐水将大肠杆菌Escherichia coli配制成1×104个菌体/μL悬浮液,用微量注射器将其注入虫体腹部的背面,每头幼虫注射1 μL）和非免疫(注射生理盐水)黄粉虫幼虫血淋巴的抑菌和溶菌酶活性,通过分光光度法测定了其酚氧化酶活性。【结果】结果显示,黄粉虫幼虫发育历期随饲养温度的上升而明显缩短（P<0.0001）,而不同温度下蛹重（P=0.067）与化蛹率（P=0.869）差异不显著。免疫组黄粉虫幼虫血淋巴的抑菌、酚氧化酶和溶菌酶活性随饲养温度上升而降低：抑菌和酚氧化酶活性随温度变化差异极显著（P<0.0001）,溶菌酶活性差异显著（P=0.013）。【结论】本研究结果表明,温度对黄粉虫的生长发育和免疫防御具有较大的影响,低温下黄粉虫幼虫的发育历期延长,但其体液免疫防御能力明显增强。     

黄粉甲抗冻蛋白AFP84a在大肠杆菌中的高效表达及活性检测

为表达和纯化黄粉甲Tenebrio molitor抗冻蛋白, 采用RT-PCR方法扩增得到黄粉甲抗冻蛋白基因afp84a cDNA, 将其连接到pMAL-p2X质粒上, 构建分泌型融合表达载体pMAL-p2X-afp84a, 并在大肠杆菌Escherichia coli TBI中表达; 进一步利用Amylose柱亲和纯化出该重组蛋白, 后利用细菌抗寒性检测重组蛋白的生物活性。结果显示: 融合蛋白含量占总可溶蛋白的40%。SDS-PAGE分析表明, 用MgSO4处理法与超声波细胞破碎法均可使融合蛋白从细胞中释放; 融合蛋白经Amylose柱亲和纯化, Factor Xa因子酶切, 电泳显示获得的目的蛋白呈单一条带。细菌抗寒性检测表明该重组蛋白具有较高的抗冻活性。黄粉甲抗冻蛋白基因afp84a cDNA的克隆、 原核表达为进一步研究抗冻蛋白的性质和应用提供了有用的实验材料。     

应用差示扫描量热法检测昆虫总蛋白的热滞活性

产生抗冻蛋白是寒带昆虫抵御低温的重要机制之一, 但检测其活性仍存在一些困难, 尤其对于个体较小的昆虫样品。为了探索差示扫描量热法是否适于检测昆虫总蛋白的热滞活性, 本研究利用差示扫描量热法对黄粉虫Tenebrio molitor幼虫的总蛋白和血淋巴分别进行了热滞活性检测。结果表明： 黄粉虫总蛋白的热滞活性（0.49~0.98℃）要低于血淋巴（2.54~4.34℃）。通过这种方法, 进一步检测了3种在内蒙古大兴安岭林区采集到的越冬昆虫： 稠李巢蛾Yponomeuta evonymallus幼虫、 舞毒蛾Lymantria dispar卵和落叶松八齿小蠹Ips subelongatus成虫。结果发现, 它们都存在热滞活性, 其中稠李巢蛾的热滞活性为0.34~0.43℃, 舞毒蛾的热滞活性为0.35~0.42℃, 落叶松八齿小蠹的热滞活性为0.37~0.40℃, 说明这3种昆虫能以产生抗冻蛋白的方式作为越冬策略之一。本研究表明通过差示扫描量热法检测昆虫总蛋白是否存在热滞活性来判断抗冻蛋白的存在是可行的。     

飞蝗谷胱甘肽S-转移酶基因克隆、 序列分析及表达特征

谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase, GST）是一类广泛分布的多功能超家族酶系, 其中Omega家族GST在昆虫体内担负重要生理功能。为探讨飞蝗Locusta migratoria Omega家族GST功能, 利用RT-PCR技术克隆得到1条飞蝗谷胱甘肽S-转移酶Omega家族基因全长cDNA, 命名为LmGSTo1 （GenBank登录号： JQ750592）。该基因开放阅读框长738 bp, 编码245个氨基酸。该酶含有N-端和C-端2个结构域, N-端结构域由5个β-折叠和3个α螺旋组成, 包括4个GSH结合位点; C-端结构域由8个α螺旋组成, 含有5个底物结合位点。Real-time PCR结果表明, LmGSTo1在飞蝗不同龄期均有表达, 在胃盲囊和中肠表达量较低, 在前肠、马氏管、肌肉和脂肪体表达量较高; 溴氰菊酯处理可导致LmGSTo1表达水平显著下降。这些结果为进一步研究LmGSTo1基因功能提供了依据。