斜纹夜蛾线粒体复合物ⅢFe-S蛋白基因克隆、序列分析及在不同发育阶段的表达特征

Fe-S蛋白(rieske iron-sulfur protein, RISP)是线粒体复合物Ⅲ的关键蛋白亚基之一, 在呼吸链电子传递中起着重要作用。本文利用RT-PCR技术和RACE方法获得了斜纹夜蛾Spodoptera litura (Fab.)线粒体复合物ⅢRISP基因, 该基因序列全长4 413 bp, 含有3个内含子; 开放阅读框长816 bp, 编码271个氨基酸。经氨基酸序列比对, 与鳞翅目家蚕Bombyx mori和小菜蛾Plutella xylostella的Fe-S蛋白一致性较高, 分别为83%和79%, 与其他目昆虫的RISP一致性较低。qRT-PCR分析结果表明, SlitRISP基因在斜纹夜蛾不同发育阶段的表达水平存在显著差异, 即幼虫期和成虫期的表达量显著高于卵期和蛹期, 其中幼虫期又以第4和5龄幼虫表达水平显著高于初孵幼虫以及第1, 2, 3和6龄幼虫。斜纹夜蛾SlitRISP基因的克隆成功为今后对其功能研究以及作为靶标设计新型高效杀虫剂提供了基础。     

核受体因子FTZ-F1在斜纹夜蛾响应虫螨腈及辛硫磷胁迫中的作用机制

【目的】本研究旨在揭示昆虫蜕皮激素信号通路上的关键核受体因子FTZ-F1在斜纹夜蛾Spodoptera litura响应虫螨腈和辛硫磷胁迫中的作用机制。【方法】使用生物信息学方法鉴定斜纹夜蛾FTZ-F1基因,并进行序列比对及系统发育树构建;将LC₃₀浓度辛硫磷和虫螨腈浸叶处理的桑叶分别喂食斜纹夜蛾3龄幼虫,并分别收集取食药叶后1, 12, 24, 36和48 h时存活的幼虫,使用qRT-PCR技术检测幼虫体内SlFTZ-F1的表达水平;使用RNAi技术沉默SlFTZ-F1基因,并使用qRT-PCR技术检测注射dsRNA后SlFTZ-F1的表达水平;将LC₃₀浓度虫螨腈和辛硫磷浸叶处理的桑叶分别喂食沉默了SlFTZ-F1的斜纹夜蛾3龄幼虫,喂食后24和48 h统计斜纹夜蛾幼虫死亡率;选取8个斜纹夜蛾谷胱甘肽S-转移酶(SlGST)基因,使用qRT-PCR技术检测沉默了SlFTZ-F1基因的斜纹夜蛾幼虫这些SlGST基因的表达水平。【结果】斜纹夜蛾SlFTZ-F1开放阅读框长1 665 bp,编码555个氨基酸,等电点为6.39,理论分子量61.77 kD,SlFTZ-F1具有DNA结合域、FTZ-F1 box及配体结合域;系统发育分析表明,SlFTZ-F1与草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的SfFTZ-F1聚为一个亚分支。与ddH₂O处理的对照相比,LC₃₀浓度虫螨腈处理后1, 24和36 h以及LC₃₀浓度辛硫磷处理后24和36 h,斜纹夜蛾3龄幼虫SlFTZ-F1的表达量均显著上调。与注射dsGFP的对照组相比,斜纹夜蛾幼虫在注射dsSlFTZ-F1后48 h SlFTZ-F1基因的表达量显著下降;分别将LC₃₀浓度虫螨腈和辛硫磷处理的桑叶喂食沉默了SlFTZ-F1的斜纹夜蛾3龄幼虫,48 h时与对照组相比斜纹夜蛾幼虫死亡率分别显著升高22%和28%;沉默SlFTZ-F1的斜纹夜蛾幼虫8个SlGST基因的表达量均显著下降。【结论】虫螨腈及辛硫磷显著诱导斜纹夜蛾幼虫SlFTZ-F1基因表达,沉默SlFTZ-F1后斜纹夜蛾幼虫对虫螨腈和辛硫磷的敏感性显著升高,解毒酶SlGST基因的表达受到显著抑制,说明发育相关的转录因子FTZ-F1在斜纹夜蛾响应常用杀虫剂胁迫中发挥了重要作用。     

番荔枝内酯化合物布拉它辛对斜纹夜蛾的杀虫活性及对SL细胞的致凋亡作用

为了明确番荔枝内酯化合物布拉它辛的杀虫活性和探索杀虫作用机理,本研究采用浸叶法测定该化合物对斜纹夜蛾Spodoptera litura幼虫的生物活性,采用MTT检测法和流式细胞术,研究该化合物对斜纹夜蛾离体培养卵巢细胞（SL细胞）的细胞毒力和致细胞凋亡作用,以及对SL细胞线粒体膜电位的影响。结果表明: 布拉它辛不仅对斜纹夜蛾幼虫具有良好的拒食活性,处理后24 h,对2龄和3龄幼虫的AFC₅₀值分别为60.25 μg/mL和86.73 μg/mL,还对幼虫生长有良好的抑制作用。布拉它辛处理SL细胞后24 h和48 h,IC50值分别为22.32 μg/mL和10.03 μg/mL。流式细胞仪检测结果表明,布拉它辛对SL细胞具有明显的致凋亡作用,可导致SL细胞线粒体膜电位显著下降。本研究表明布拉它辛对斜纹夜蛾幼虫具有良好的拒食活性与生长抑制作用, 并且该化合物能明显抑制SL细胞的增殖,诱导细胞凋亡,降低线粒体膜电位。因此,布拉他辛具有广阔的研究应用前景。     

UVA对斜纹夜蛾SL细胞损伤研究

目的:研究了不同剂量长波紫外光(UVA)对斜纹夜蛾细胞(Spodoptera litura,SL)活力的影响及其机理。方法:四唑盐比色实验(MTT)法测定UVA对离体培养的SL细胞的细胞毒力;流式细胞术(FCM)检测UVA处理后SL细胞内活性氧水平(ROS)和线粒体膜电位变化;1%琼脂糖凝胶电泳检测UVA处理后SL细胞DNA损伤情况。结果:48 KJ/m2剂量UVA处理细胞后,细胞增殖抑制率明显上升,且增殖抑制率与UVA剂量呈正相关。12 KJ/m2UVA处理后2 h细胞内ROS水平显著升高,且与UVA剂量呈正相关。与2 h相比,相同剂量UVA处理后24 h和48 h的ROS水平有所降低。在144 KJ/m2剂量UVA处理下,细胞线粒体膜电位呈降低-恢复-再降低趋势。DNA琼脂糖凝胶电泳表明,不超过144 KJ/m2剂量UVA对细胞DNA不出现细胞凋亡典型症状的DNA ladder。结论:24 KJ/m2UVA是进行SL细胞光活化研究的最佳实验剂量。     

DZNep诱导HL-60细胞凋亡和生长抑制

[目的]研究S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂DZNep(3-Deazaneplanocin A)对人早幼粒白血病细胞HL-60增殖的影响。[方法]细胞计数法分析DZNep(10~500 nmol/L)处理对HL-60细胞增殖的影响;以DNA片段化、Annexin-V/PI法和线粒体膜电位法检测DZNep处理对HL-60细胞凋亡的影响。Western Blot检测细胞凋亡相关基因Bax和细胞色素C的表达。[结果]50 nmol/L DZNep对HL-60细胞的24、48、72h增殖抑制率达18%、44.5%、81.7%。Annexin-V/PI法显示DZNep能诱导HL-60细胞发生剂量依赖性的细胞凋亡。进一步研究发现,DZNep(50nmol/L)处理24 h诱导23.8%的HL-60细胞发生线粒体途径介导的细胞凋亡,表现为细胞DNA片段化、线粒体膜电位下降和Bax基因表达上调,同时伴有细胞浆内细胞色素C增加。[结论]DZNep能在较低浓度下抑制HL-60细胞增殖并通过激发线粒体凋亡途径诱导HL-60细胞凋亡,具有抗人早幼粒细胞白血病治疗的潜在应用前景。     

大鼠心肌缺血再灌注损伤模型线粒体自噬变化的研究

目的:观察大鼠心肌缺血再灌注损伤模型不同时间点线粒体及线粒体自噬的变化。方法:成年雄性SD大鼠40只,随机分为假手术对照组(sham组):开胸不进行冠状动脉左前降支(Left anterior descending coronary artery,LAD)血流阻断;缺血再灌注组2h组(I/R 2 h组)、24 h组(I/R 24 h组)及48 h组(I/R 48 h组),以上3组均阻断LAD 30 min,分别于再灌注后2 h、24 h、48 h观察心肌ATP含量,线粒体膜电位水平变化,透射电镜下观察线粒体及线粒体自噬超微结构变化,western blot法测定线粒体自噬蛋白PINK1、Parkin、p62、LC3B及线粒体膜蛋白Tom20表达水平。结果:与对照组相比,线粒体膜电位水平及心肌组织ATP含量于再灌注2 h开始下降,24 h下降最显著,48 h有所改善,线粒体超微结构损伤再灌注24 h最为明显,48 h有所改善。PINK1、Parkin、p62蛋白表达于损伤后2 h增强,于再灌注后24 h升高最显著,持续至48 h,LC3BⅡ表达于损伤后24 h增强,同样持续至48 h。透射电镜下可见线粒体自噬体于再灌注后24 h明显增多,并持续至48 h。结论:大鼠心肌缺血再灌注损伤后,线粒体功能与形态损伤以损伤后24 h最为显著,至损伤后48 h后好转;线粒体自噬水平升高以损伤后24 h最为显著,且维持至损伤后48 h,提示两者之间可能存在关联。     

多种小分子干扰RNA联合抑制乙型肝炎病毒的体外研究

小分子干扰RNA(siRNA)能够在哺乳动物细胞中引起包括病毒基因在内的基因沉默。为了研究多种siRNA联合应用在体外抑制乙型肝炎病毒(HBV)复制中的效果,本研究设计了12种针对不同HBV靶点的siRNA,转染可稳定分泌HBV颗粒的HepG22.2.15细胞,并采用了酶联免疫法检测上清液中HBsAg和HBeAg的含量,实时定量PCR法检测细胞中HBV的DNA含量。结果发现这12种分子均能在不同程度上抑制病毒复制。进一步研究表明它们对HBV的抑制作用在一定程度上存在剂量效应和协同作用,单分子siRNA在80nmol/L处对HBsAg和HBeAg的抑制率分别可达到约80%和60%,而多分子siRNA组合在20nmol/L处对HBsAg就能达到90%的抑制率,但对HBeAg表达的抑制率提高不明显。单分子siRNA在80nmol/L处对HBVDNA复制的抑制率可达到90%以上,而多分子siRNA组合在20nmol/L处对DNA含量就能达到约90%的抑制率。本研究的结果为进一步开发新的联合应用多种siRNA治疗HBV的途径打下了基础。     

pcsk9 siRNA对oxLDL诱导的THP-1源性巨噬细胞凋亡的影响

为研究pcsk9基因沉默后对氧化型低密度脂蛋(oxLDL)诱导THP-1源性巨噬细胞凋亡的影响,用不同浓度oxLDL处理THP-1源性巨噬细胞48 h,Hoechst33258染色检测细胞凋亡,RT-PCR、Western blot分别检测pcsk9 mRNA、NARC-1蛋白的表达.应用Lipofectamine2000转染3对pcsk9 siRNAs进THP-1源性巨噬细胞中,筛选出最有效的siRNA再转染入THP-1源性巨噬细胞,24 h后加入oxLDL处理48 h,Hoechst33258染色观察细胞评价细胞凋亡,流式细胞术计数检测细胞凋亡率.结果发现,75 mg/L oxLDL处理THP-1源性巨噬细胞48 h后,Hoechst33258染色可见大量凋亡细胞.同时RT-PCR、Western blot检测发现,pcsk9 mRNA和NARC-1蛋白质表达量均随oxLDL浓度的增加而增加,75 mg/LoxLDL组增加最明显.不同浓度siRNA转染THP-1源性巨噬细胞后,RT-PCR筛选出3对siRNAs的终浓度为80 nmol/L均可出现明显的沉默效应.选取此浓度在蛋白质水平检测基因抑制情况,筛选出最有效的一对siRNA.将筛选出来的siRNA转染细胞24 h后,再用oxLDL处理48 h,Hoechst33258染色及流式细胞计数结果显示,转染siRNA组凋亡明显被抑制.结果表明,在本研究的浓度范围内,随着oxLDL浓度增加pcsk9的表达随之增加,同时,THP-1源性巨噬细胞凋亡也明显增加,75 mg/L oxLDL最明显,pcsk9 mRNA和蛋白质的表达也在该浓度最高.提示pcsk9 siRNA能有效抑制pcsk9基因的表达,从而有效抑制由oxLDL诱导的THP-1源性巨噬细胞的凋亡.     

斑点野生稻拒食活性组分的分离及其对斜纹夜蛾消化酶活性的影响

为了进一步评估斑点野生稻Oryza punctata的抗虫性,采用液 液分配萃取和硅胶柱层析的方法,从斑点野生稻甲醇提取物中分离获得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水的萃取物,测定了其对斜纹夜蛾Spodoptera litura 3龄幼虫拒食活性。结果显示,氯仿萃取物比其他4种萃取物具有更高的拒食活性,在25 mg/mL的浓度下,24 h和48 h的拒食率分别为55.62%和52.66%。氯仿萃取物经硅胶柱层析后,得到14个组分。比较14个组分的拒食活性,发现组分4和10为主要的活性组分。这两个组分对斜纹夜蛾幼虫中肠脂肪酶和α-淀粉酶的活性都具有一定的抑制活性,其中组分10对脂肪酶具有显著的抑制效果,以1 mg/mL的浓度活体处理48 h和72 h抑制率分别达19.82％和34.60％; 对α-淀粉酶的影响在48 h和72 h内都具有显著的抑制效果,随着处理时间的延长,其抑制率逐步提高,72 h的抑制率分别为25.06％和27.40％。结果提示斜纹夜蛾幼虫中肠脂肪酶和α-淀粉酶可能是斑点野生稻拒食活性成分的作用靶标。     

植物源物质诱导的斜纹夜蛾细胞凋亡

为了研究植物源物质对斜纹夜蛾Spodoptera litura离体培养细胞系SL-1的凋亡诱导作用,采用倒置相差显微镜观察了印楝素、喜树碱等9种物质各自对SL-1凋亡小体的浓度效应及时序性。结果表明：印楝素0.1～5.0 μg/mL和喜树碱0.5～20.0 μmol/L处理SL-1,24～48 h后均产生大量典型的凋亡小体;茶皂素、蓖麻碱、黄樟油、丹皮酚、烟碱、苦参碱和博落回碱0.1～20.0 μg/mL处理SL-1后,整个观察期72 h内均无明显凋亡小体出现,凋亡诱导作用不明显。印楝素0.75 μg/mL诱导SL-1 细胞凋亡,从凋亡小体判断,处理后0～36 h属细胞凋亡早期,36～60 h属细胞凋亡中期,60 h后为细胞凋亡晚期。喜树碱 5.0 μmol/L诱导SL-1细胞凋亡,处理后0～24 h属细胞凋亡前期,24～54 h属细胞凋亡中期,54 h后进入细胞凋亡晚期。初步认为印楝素和喜树碱对SL-1有凋亡诱导作用,并具有一定的浓度依赖性和时序性。     

杆状病毒诱导昆虫细胞凋亡的初步研究

细胞凋亡 (ａｐｏｐｔｏｓｉｓ)最早被定义为一种有秩序、受控制并按某种预定程序发展的生理性的自然死亡过程 (ｋｅｒｒｅｔａｌ1 972 ) ,其特征是细胞收缩 ,染色质凝聚成块状 ,形成凋亡小体[1] 。但其最主要的特征是细胞ＤＮＡ受到一种被激活的内源性核酸酶的降解 ,凝胶电泳时呈现出特征性的梯形带 (Ｗｙｌｌｉｅ,1 980 )。病毒感染是常见导致细胞凋亡的重要因素 ,杆状病毒同样诱导昆虫细胞凋亡 ,同时 ,作为打破宿主防御体系的一种策略 ,杆状病毒可通过自身编码抗凋亡基因的表达 ,抑制细胞凋亡以利于自己的增殖[2 ] 。细胞调亡和病毒抗凋…     

杀菌剂丙环唑对斜纹夜蛾的毒性

在研究比较了11种农药对斜纹夜蛾Spodoptera litura细胞（简称SL细胞）的毒杀活性基础上,选择毒杀活性最高的杀菌剂丙环唑,对其毒理学机理进行进一步研究。结果表明,丙环唑的细胞毒力最高,在100 μg/mL浓度下处理后48 h,SL细胞的死亡率为98.08％。处理后36 h,丙环唑对SL细胞的LC₅₀值为20.31 μg/mL。丙环唑能明显降低SL细胞的蛋白质含量。以0.5 μg/头的丙环唑注射斜纹夜蛾4龄幼虫,处理后72 h,试虫血淋巴总含量及血细胞数分别下降了26.80％和25.26％;在1.0 μg/头的剂量下,则分别下降了37.67%和36.32%。以0.5 μg/头和1.0 μg/头的丙环唑注射处理后,斜纹夜蛾幼虫体重显著降低。此外,丙环唑能降低斜纹夜蛾幼虫血淋巴含糖量及血淋巴蛋白质含量。在注射处理后96 h和120 h,丙环唑对斜纹夜蛾4龄幼虫的LD₅₀值分别为0.59 μg/头和0.45 μg/头。丙环唑对SL细胞和斜纹夜蛾幼虫均具有较好的毒杀活性,显示出丙环唑类似物控制害虫的可能性。     

闹羊花素Ⅲ对斜纹夜蛾细胞系的活性及作用机理

研究了闹羊花素Ⅲ对斜纹夜蛾Spodoptera litura离体培养细胞（SL细胞）的活性,并测定了对SL细胞Na⁺、K⁺和葡萄糖吸收以及对4龄幼虫血细胞数量的影响。结果表明：以400 µg/mL 和200µg/mL闹羊花素Ⅲ处理SL细胞,24 h后细胞的相对死亡率为79.00% 和56.69%,处理后8 h,16 h,24 h和48 h的LC₅₀分别为240.09 µg/mL,173.45 µg/mL,113.56 µg/mL和73.40 µg/mL;闹羊花素Ⅲ处理SL细胞后10 min,细胞对离子的吸收迅速增加,30 min后吸收作用逐渐减弱;处理后3天内细胞对葡萄糖的吸收迅速增加,4～5 天后,细胞对葡萄糖的吸收基本停止。以叶碟法和注射法处理4龄幼虫,8 h后幼虫血细胞数量显著降低,随处理时间增加,幼虫血细胞数量又逐渐增加。     

几种虫生真菌对斜纹夜蛾的致病性

用布氏白僵菌、球孢白僵菌、玫烟色拟青霉、绿僵菌和莱氏野村菌5种真菌的固体培养物,对斜纹夜蛾2、3龄幼虫进行了毒力测定.结果表明：布氏白僵菌和莱氏野村菌两种菌株对斜纹夜蛾幼虫有明显的致病效果,对2龄幼虫的致死中时(LT₅₀)分别为2.95 d和4.10 d,累计校正死亡率分别为100%和95.2%;对3龄幼虫的致病力低于2龄,致死中时(LT₅₀)分别为19.67 d和19.63 d,累计校正死亡率分别为56.6%和52.2%.玫烟色拟青霉、球孢白僵菌两菌株也有一定的致病力,对2龄幼虫的致死中时(LT₅₀)分别为4.89 d 和6.34 d,累计校正死亡率分别为85.7%和71.4%.     

Laboratory evaluation of flight activity of the common cutworm, Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae)

Abstract  The flight activity of Spodoptera litura in tethered conditions is evaluated using a computer-mediated flight-mill in the laboratory. The 3–4-day-old moths fly longer and farther than those of other ages. Male and female moths exhibit similar flight activity. Mating status does not influence the flight duration and distance of 2-day-old females. However, these two flight parameters with a 6-day-old mated female is significantly lower than that of unmated ones. The optimum temperature for flight ranged from 16–24°C, whereas the optimum RH ranged from 60%–100%. During 72-h period, the total flight duration and distance of 1-day-old male and female moths were 19.6 h (± 5.8) and 83.3 km (± 28.4), and 24.0 h (± 7.0) and 105.4 km (± 37.4), respectively. These results indicate that S. litura has a great potential to undertake long-distance migratory flights.     

绿僵菌素A和B对斜纹夜蛾SL-1细胞的增殖抑制和致凋亡作用

绿僵菌素A和B是生物活性分子,本研究用MTT法、相差显微观察、荧光倒置显微观察和流式细胞术比较了绿僵菌素A和B对斜纹夜蛾Spodoptera litura SL-1细胞的毒杀作用。结果表明：绿僵菌素A和B对SL-1细胞均具有明显的增殖抑制作用,且具有正比的时间-浓度-效应关系,绿僵菌素A和B处理细胞48 h后的IC50值分别为7.80和20.73 μg/mL。倒置相差显微观察发现,绿僵菌素A和B可以引起SL-1细胞变圆、胞膜收缩、有凋亡小颗粒形成。随着时间的延长,细胞悬浮致死并出现大量空泡和胞质外泄现象。但是在同样的处理浓度下,绿僵菌素A的作用较绿僵菌素B明显。用AO/EB染色后,荧光显微观察发现：绿僵菌素A 诱导的细胞荧光强度高于绿僵菌素B。流式细胞仪检测结果表明：绿僵菌素A和B对SL-1细胞具有明显的致凋亡作用。10 μg/mL绿僵菌素A和B作用细胞48 h后,SL-1细胞的总凋亡率分别达78.88%±0.97%和72.23%±2.29%。本研究从细胞水平肯定了绿僵菌素具有良好的增殖抑制和致凋亡作用,并且为它在害虫防治中的潜在应用提供了一些理论支持。