沙门菌- 斑马鱼感染模型用于Th1/Th2 免疫应答的研究

目的:通过构建斑马鱼成鱼感染模型,研究鼠伤寒沙门菌感染对机体Th1/Th2免疫应答的影响。方法:用不同剂量细菌口饲感染8月龄的斑马鱼成鱼,绘制3周生存率曲线。观察各剂量下对成鱼的感染情况,并用实时荧光定量聚合酶链式反应检测肝脏Th1、Th2型细胞相关基因和细胞因子的mRNA转录水平,计算Th2/Th1相对表达量比值。结果:用105 CFU感染2周斑马鱼全部存活,第15天开始出现死亡,且在3周后死亡率达到50%;感染后3周解剖发现,肝脏、脾脏和肠道有明显红肿和糜烂;肝脏Th1、Th2型细胞相关基因和细胞因子mRNA转录水平明显向Th2偏移。结论:用105 CFU鼠伤寒沙门菌口饲感染斑马鱼成鱼构建的模型,能反映机体感染和免疫功能变化,可用于研究体内Th1/Th2免疫应答,为进一步研究鼠伤寒沙门菌感染与免疫机制提供了很好的实验工具。     

异源反应性NK细胞对骨髓移植小鼠脾脏Th1/Th2细胞亚群的影响

目的:观察异源反应性自然杀伤细胞(NK细胞)对骨髓移植小鼠脾脏辅助性T细胞Th1/Th2亚群的影响。方法:以BALB/c和CB6F1小鼠为受体,在γ射线照射后通过尾静脉输入C57BL/6J小鼠的骨髓细胞和脾脏单个核细胞,建立移植物抗宿主病模型;然后输入供体的NK细胞,检测受体小鼠脾脏中Th1/Th2淋巴细胞亚群和外周血中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素10(IL-10)的变化。结果:与单纯输入骨髓细胞和单个核细胞组小鼠相比,输入异源反应性NK细胞后,BALB/c和CB6F1小鼠脾脏中Th1细胞比例均下降,Th2细胞比例均上升,CB6F1小鼠脾脏中Th2虽有升高但没有统计学意义;外周血中IL-10水平显著升高,IFN-γ的水平显著下降。结论:异源反应性NK细胞可能通过降低脾脏中Th1细胞亚群比例和升高Th2细胞亚群比例减轻移植物抗宿主病。     

益生菌对感染小鼠早期IFN-γIL-4的影响

目的研究口服益生菌对鼠伤寒沙门菌（STM）感染小鼠Th细胞因子的影响,以探讨益生菌抗沙门菌感染的免疫学机制。方法将95只Balb／c小鼠分为4组,分别为益生菌组（P）、益生菌对照组（Pc）、正常感染组（I）和对照组（C）。P组口服益生菌,I组口服生理盐水,均予等剂量STM口服感染,Pc组接种益生菌但不感染STM,C组不作任何处理。各组动物在11个不同时点处死,观察小肠、肝脏、脾脏病理改变,ELISA测量血清IFN-γ、IL-4表达。结果益生菌组器官组织的病理改变轻微,IFN-γ较正常感染组明显增加（Xp-1=66．52,P=0．001）,且其表达在感染最初的1h和后期的72h分别出现两个高峰;IL-4明显降低（Xp-1=-29．02,P〈0．001）,且较稳定。IFN-γ／IL4比值扩大（Xp-1=2．64,P〈0．001）。结论口服益生菌使小鼠保持有利于抗STM感染的Th1型反应,减轻了STM对机体的免疫损伤。     

粪菌移植对溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜Th1/Th2细胞及其细胞因子表达的影响

目的观察粪菌移植(FMT)对结肠炎小鼠结肠组织内Th1/Th2平衡及其细胞因子的影响。方法用葡聚糖硫酸钠(DSS)制备溃疡性结肠炎小鼠模型,共48只雄性C57BL/6小鼠,按3∶2∶1随机分为干预组、对照组和粪便供体组。其中干预组24只小鼠自由饮用2%DSS溶液,第6天时再次称重随机分为3组,每组6只:粪便滤液组(A组)、美沙拉嗪缓释颗粒组(B组)、生理盐水组(C组),并分别灌肠给予粪便滤液(500mg/mL,0.3mL/次)、美沙拉嗪缓释颗粒混悬液(25mg/mL,0.3mL/次)和生理盐水(0.3mL/次),每日2次,连续5d;对照组分为急性结肠炎组(D组)和正常对照组(E组),每组6只,分别自由饮用2%DSS溶液和蒸馏水7d后处死;粪便供体组(F组)正常进食饮水,采集新鲜粪便制作粪便滤液。评估疾病活动指数、脾脏指数、结肠长度和结肠组织病理评分。免疫组化法和酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测结肠组织Th1/Th2细胞及细胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10)的表达。结果 (1)粪菌移植治疗明显改善结肠挛缩和病理损伤(P0.05),而脾脏指数明显增加(P0.05);(2)粪菌移植使结肠炎小鼠结肠组织的T-bet阳性细胞和Gata-3阳性细胞表达升高,T-bet/Gata-3平衡右移;(3)粪菌移植使结肠炎小鼠结肠组织细胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10)水平下降。结论粪菌移植促进结肠炎小鼠的结肠黏膜修复,可能与调节结肠组织Th1/Th2细胞平衡,下调炎症因子,介导Th2免疫修复有关。     

含体内激活启动子的重组减毒鼠伤寒沙门菌诱导转基因鼠细胞免疫应答

以庚型肝炎病毒 (hepatitisGvirus ,HGV)转基因小鼠为模型 ,探讨逆转免疫耐受的方法及与HGV致病性的关系。首先采用鼠伤寒沙门菌pagC基因的启动子 (PpagC)为转录调控元件 ,构建宿主体内表达HGVNS3抗原的重组减毒鼠伤寒沙门菌 ,并口服接种免疫HGV转基因小鼠。结果证明对诱导转基因小鼠血清HGVNS3抗体无明显影响 ,但对小鼠血清HGV抗原含量、肝组织HGV抗原及HGVmRNA表达量有明显抑制作用。体外培养脾细胞表现出针对HGVNS3抗原的细胞免疫反应 ,并检测到Th1 型细胞因子IFN γ。过继转移实验证明T细胞可能是通过IFN γ介导的机制抑制转基因鼠体内HGV的表达及复制。组织病理学检查显示 ,转基因小鼠肝组织见淋巴细胞浸润等轻度炎性变。T细胞免疫耐受消除的结果提示 ,这种宿主体内激活目的抗原表达的口服疫苗有望成为治疗病毒性肝炎的新方法。     

沙门菌鞭毛蛋白增强新城疫病毒融合蛋白在小鼠中的免疫原性

目的：分析沙门菌鞭毛蛋白对新城疫病毒（NDV）融合蛋白（F蛋白）免疫原性的增强作用。方法：提取鼠伤寒沙门菌SL7207株鞭毛蛋白,将鞭毛蛋白与F蛋白以皮下注射的方式联合免疫C3H/HeJ小鼠,间隔2周免疫,共免疫3次。分别在第2次免疫后2周和第3次免疫后2周采集血清,应用ELISA法测定小鼠血清抗体;在第3次免疫后2周取免疫小鼠脾脏细胞,检测IFN-γ和IL-4特异性分泌细胞。结果：鞭毛蛋白与F蛋白联合免疫能诱导产生特异性的免疫应答,血清抗体水平显著高于F蛋白单独免疫组;在脾脏细胞中,检测到较高水平的IFN-γ和IL-4分泌细胞,免疫应答以Th1型为主。结论：鞭毛蛋白与F蛋白的联合免疫,可显著增强F蛋白的免疫原性,显示出鞭毛蛋白良好的免疫佐剂效应。     

TassC结合过氧化物酶体对早期受染巨噬细胞内的鼠伤寒沙门菌的影响

探讨鼠伤寒沙门菌在感染鼠巨噬细胞早期与细胞器的相互作用。用pTassC-GFP质粒转染鼠巨噬细胞RAW264.7,结合多抗的溶酶体标志物溶酶体相关膜蛋白-1用键合了Alexa594的羊抗鼠二抗显色,以观察标记了绿色荧光蛋白的TassC与溶酶体的关系;用pTassC-GFP和pDsRed2-Perxi质粒共转染RAW264.7细胞,以观察TassC-GFP与过氧化物酶体的关系;用SYTO42标记鼠伤寒沙门菌,感染用pTassC-GFP和pDsRed2-Perxi质粒共转染的RAW264.7细胞,以观察细菌与TassC和过氧化物酶体的关系。免疫荧光显示TassC-GFP不与鼠巨噬细胞RAW264.7中的溶酶体结合,但与标记了红色荧光的过氧化物酶体共定位;感染1 h的RAW264.7胞内SYTO42标记的鼠伤寒沙门菌吞噬泡可招募TassC-GFP和过氧化物酶体。这些发现提示在鼠伤寒沙门菌感染早期过氧化物酶体携带杀菌成分通过TassC介导可参与发挥一定的杀菌作用。     

鼠伤寒沙门菌感染巨噬细胞铁稳态相关基因mRNA表达谱

用荧光定量PCR法检测鼠RAW264.7巨噬细胞感染与未感染鼠伤寒沙门菌后18种铁穗态相关基因的表达,评估宿主与病原体相互作用中铁稳态效应。研究显示,活的鼠伤寒沙门菌感染巨噬细胞1 h后可以诱导转铁蛋白受体表达,引起细胞内动态铁池相关基因的mRNA水平上长。基因表达分析显示,沙门菌通过诱导铁氧还原酶(Steap3)、铁膜转运蛋白(Dmt1)、铁调节因子Tfr2/Hfe以及铁调节蛋白(Irp1和Irp2)的表达主动吸收铁,而经铁转运蛋白(Fpn1)的铁外流并无明显改变。沙门菌在感染后1h积极地驱动了转铁蛋白介导的铁吸收程序。     

鼠伤寒沙门菌rtsB基因缺失株的构建及其生物学特性

【背景】鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)是一种重要的人畜共患病原菌,严重危害养殖业及人类健康。调控蛋白在病原菌的生存及感染过程中发挥重要作用。【目的】构建鼠伤寒沙门菌调控基因rtsB缺失株和互补株,分析调控蛋白RstB对鼠伤寒沙门菌生物学特性和致病性的影响。【方法】利用Red同源重组的方法构建鼠伤寒沙门菌SAT52的rtsB基因缺失株,并利用互补质粒构建互补株。然后比较分析野生株SAT52、缺失株?rtsB和互补株C?rtsB的生长特性、运动性、生物被膜形成能力、黏附入侵能力、胞内存活能力及致病性的差异。【结果】缺失rtsB基因不影响SAT52的生长速度,但导致运动能力增强,生物被膜形成能力减弱。细胞感染试验结果表明,rtsB基因有助于鼠伤寒沙门菌对Hela细胞的黏附入侵及RAW264.7细胞内的存活。动物试验结果表明rtsB基因缺失显著降低鼠伤寒沙门菌的致病力。【结论】rtsB基因在鼠伤寒沙门菌感染过程中发挥重要作用,可为阐释鼠伤寒沙门菌的致病机制提供参考。     

假定调控蛋白STM14_3514可降低鼠伤寒沙门菌对上皮细胞的侵袭力

【目的】研究鼠伤寒沙门菌致病岛1(SPI-1)内部的假定调控蛋白STM14_3514的功能及其作用机制。【方法】以鼠伤寒沙门菌模式菌株ATCC 14028为亲本株,构建了STM14_3514基因的缺失突变体及互补菌株,通过小鼠实验、细胞侵袭实验、Western blot及实时荧光定量PCR(q RT-PCR)等实验技术,深入研究了STM14_3514基因对鼠伤寒沙门菌致病过程的影响。【结果】STM14_3514突变提高了细菌对小鼠的致病能力,突变体在小鼠肠道、肝和脾中的定殖能力均增强;细胞实验揭示,突变体致病力提升主要由于STM14_3514突变能显著增强细菌对上皮细胞的侵袭力(2倍,P0.05)。q RT-PCR及Western blot分析表明,STM14_3514显著抑制SPI-1内部主要调控因子hil A及侵袭相关基因的表达。此外,STM14_3514对hil A的抑制由Hil C介导。【结论】STM14_3514是鼠伤寒沙门菌SPI-1内部的负调控因子,能通过Hil C抑制hil A及SPI-1其他入侵基因的表达,该基因的生物学意义可能与细菌进入细胞后对SPI-1的负调控相关。     

轮状病毒致乳鼠肠道外感染Th1/Th2细胞因子变化的研究

目的通过复制轮状病毒（RV）肠道外感染乳鼠的动物模型,检测接种后乳鼠体内Th1/Th2平衡改变,对RV肠道外感染后机体免疫状态进行初步研究。方法48只乳鼠随机均分为3组：肠道外组、肠道内组和正常对照组。肠道外组通过腹腔注射猴RVSA11株,肠道内组灌胃等量RV悬液,对照组无特殊处理。分别在接种后第4天、第8天处死乳鼠,收集标本,观察心、肝、肾、肺等脏器病理变化,用ELISA法检测血清中IL-10和IFN-γ的表达。结果光镜下肠道外组乳鼠肾、肝、肺和脾脏出现病理改变。感染后第4天,肠道内、外组乳鼠血清IFN-γ水平均高于正常组,到第8天明显下降,基本达到基线水平;IL-10在肠道外组第4天增高,到第8天小幅下降,但仍然高于正常组;而肠道内组IL-10无明显改变。结论RV肠道外感染早期呈现Th1-Th2混合反应,而后期则以IL-10的表达为主,T细胞向Th2型免疫应答方向偏离,Th1/Th2细胞因子失衡机制可能是RV肠道外感染的重要因素。     

幽门螺杆菌感染者Th1/Th2细胞免疫应答变化

目的观察幽门螺杆菌(H.pylori)相关性胃病患者血清Th1/Th2细胞因子(干扰素-γ,IFN-γ、白细胞介素-4,IL-4)水平变化,以探讨其在发病中的可能免疫致病机制。方法采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定17例慢性浅表性胃炎、15例胃癌前病变和20例胃癌患者血清IFN-γ及IL-4的含量。比较H.pylori阳性3组患者之间、H.pylori阳性与阴性各相应组患者之间血清2种细胞因子的差异。结果 H.pylori阳性的浅表性胃炎组、胃癌前病变组及胃癌组血清IL-4含量随病变的进展有逐渐升高的趋势,但3组之间差异无统计学意义(P>0.05);H.pylori阳性的3组血清IFN-γ含量差异无统计学意义(P>0.05);H.pylori阳性与阴性的各相应组血清IFN-γ含量差异无统计学意义(P>0.05);H.pylori阳性的胃癌前病变组和胃癌组与H.pylori阴性的相应组血清IL-4含量差异无统计学意义(P>0.05);H.pylori阳性的浅表性胃炎组血清IL-4含量较H.pylori阴性的浅表性胃炎组明显降低(P<0.05)。结论 H.pylori感染可能抑制Th2型免疫应答,导致H.pylori感染持续存在;H.pylori感染相关胃部病变进展过程中,可能存在Th1型应答向Th2型应答漂移,与胃癌的发生可能有一定的相关性。     

轮状病毒致乳鼠肝脏IFN-γ/IL-10的变化研究

目的建立乳鼠感染的模型,检测轮状病毒（Rotavirus,RV）肠道内、外感染乳鼠肝脏IFN-γ和IL-10水平,比较肝脏IFN-γ和IL-10在轮状病毒肠道内外感染,以及不同时间点变化的差异性,进一步探讨IFN-γ和IL-10免疫自稳失衡与轮状病毒肠道外感染发病的关系,推测以恢复细胞因子平衡为目标的治疗策略可能是治疗轮状病毒肠炎的一种新方法。方法实验动物选用35日龄的清洁级BALB/C乳鼠,将54只乳鼠随机分为3组,每组18只,即实验组,包括肠道外组：通过腹腔注入0.10 mL（1×10-5）TCID50感染性滴度计量的SA-11株病毒;肠道内组：通过口腔灌入0.10 mL相同病毒;对照组无特殊处理。感染后,各组动物隔离饲养。观察乳鼠的活动、饮食、体型、毛色和大便变化情况等,收集大便经胶体金法检测其中RV抗原。在接种后的3、5和8 d处死乳鼠,留取肝脏,免疫组化方法检测IFN-γ和IL-10水平。结果对照组2种细胞因子表达量较少,肠道内组IFN-γ水平在接种RV后的第3天明显增多,第3天至第8天缓慢减少;IL-10水平较正常组增高但整个过程未见明显变化。肠道外组IFN-γ水平与肠道内组比较差异无统计学意义;IL-10水平在感染第3天也明显增多,第3天至第8天有所减少但仍存在且高于正常组。结论 BALB/C乳鼠肠道内外感染RV动物模型建立成功。乳鼠肠道外感染早期及后期肝脏内细胞因子呈现出不同改变。所以在肠道外组,肝脏细胞因子平衡机制失衡,进一步阐明这种失衡可能是RV肠道外播散的重要机制。     

L-精氨酸对实验性脑型疟疾的免疫调控机制研究

在疟疾流行区,L-精氨酸(L-Arg)被认为是一种对疟疾患者安全有效,能逆转内皮细胞功能紊乱的药物。实验主要研究L-Arg对实验性脑型疟疾的作用特点及其免疫调节作用。结果显示,与生理盐水对照组相比,在伯氏疟原虫(P.b ANKA)感染后给予L-Arg,C57BL/6小鼠的原虫血症水平降低,但存活时间却缩短。LArg处理后,脾脏中CD4+T-bet+IFN-γ+Th1细胞百分率显著性增加,同时脾细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α以及NO水平也显著性提高。然而,L-Arg处理后未见Treg细胞的百分率及IL-10的显著性变化。由此提示,L-Arg通过增加小鼠的Th1应答,在脑型疟疾发生时加速小鼠的死亡。因此,应重新评估L-Arg对脑疟的防治效果。     

幽门螺杆菌相关性胃癌患者血清白介素-4和干扰素-γ变化

目的观察幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)相关性胃癌患者血清白介素-4(IL-4)和干扰素-γ(IFN-γ)含量的变化,以探讨H.pylori感染时宿主TH1/TH2细胞的免疫应答变化。方法采用酶联免疫吸附测定法测定7例H.pylori阴性胃癌患者和13例H.pylori阳性胃癌患者血清IL-4及IFN-γ的含量。结果 2组患者血清IL-4及IFN-γ含量差异均无统计学意义(P=0.897)。结论 H.pylori感染对胃癌患者TH1/TH2细胞的免疫应答无明显影响。     

两种急性免疫性肝损伤小鼠模型的对比研究

目的比较两种急性免疫性肝损伤小鼠模型的肝功能及淋巴因子变化特点和规律,为研究抗肝炎药物提供理想的动物模型。方法选用BCG＋LPS和Con-a建立两种免疫性肝损伤模型。以小鼠血清转氨酶水平变化及肝脏病理学检查作为肝损伤判断标准,以ELISA法测定血清中IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-r的变化。结果与正常对照组相比,两组模型ALT、AST的活性均显著升高（P〈0.01）;BCG＋LPS组IL-2、IFN-r、TNF-α的含量明显高于正常对照组（P〈0.01）,但IL-4、IL-10的含量无明显变化;Con-a组IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-r的含量均高于正常对照组（P〈0.01）。两组模型均出现严重的肝组织病理改变。结论Con-a建立的免疫性肝损伤模型更适用于防治免疫性肝损伤药物的筛选和研究。     

原发性肝癌患者Th_1/Th_2亚群研究

目的：探讨原发性肝癌患者血清中淋巴细胞亚群中Th1/Th2的变化,为分析肝癌的发生发展状症和临床治疗提供免疫学指标。方法：应用放射免疫分析及酶联免疫分析法（ELISA）,测定46例肝癌患者,及43例正常对照组进行比较。以IL-2、INF-γ和TNF-α水平代表Th1型细胞因子,以IL-4,IL-6、IL-8、IL-10的水平代表Th2型细胞因子。结果：肝癌患者IL-2、TNF-γ、IL-6的水平明显低正常对照组,P〈0.01。IL-4、IL-8、IL-10、TNF-α的水平明显高于正常对照组,P〈0.01。结论：肝癌患者体内存在Th1/Th2细胞因子失衡,其中Th1亚群功能抑制,Th2亚群功能亢进,其与肿瘤在宿主体内生长密切相关。通过纠正这些免疫失调将成为肝癌治疗的重要手段。     

Th17细胞及白细胞介素-17在肝移植急性排斥反应中的意义

目的探讨Th17细胞及相关因子白细胞介素-17（IL-17）在肝移植急性排斥反应中的变化及意义。方法收集2011年1月至2012年12月大连医科大学附属第二医院肝移植手术患者28例,根据移植肝组织穿刺活检病理诊断结果将肝移植的28例患者分为急性排异反应组6例和无排斥反应稳定组22例,15名健康体检者作为对照组。急性排斥组及稳定组在移植术后3 d和7 d,行肝穿刺活检病理检查;同时检测受检者外周血Th17细胞,受检者血清中IL-17水平。结果移植肝穿刺活检病理诊断显示急性排斥组随着移植时间延长,排斥反应逐渐增强。肝组织出现典型的细胞免疫性病理损伤,术后7 d肝脏汇管区、肝实质、小静脉壁、胆管上皮内及小叶间胆管被大量的淋巴细胞及嗜中性粒细胞包绕及浸润,胆管上皮细胞内空泡形成、上皮细胞凋亡。病理改变明显比术后3 d严重;急性排斥组患者术后3 d和7 d外周血Th17细胞比例及血清中IL-17含量较稳定组和对照组均明显增多（P〈0.05）,且Th17细胞及IL-17在术后急性排斥期7 d值均明显高于3 d（P〈0.05）。结论 Th17细胞及IL-17在肝移植急性排斥反应的发生、发展中可能起着促进作用,外周血Th17细胞及IL-17的检测有可能成为肝移植急性排斥反应的早期诊断指标。     

常规实验操作对Wistar大鼠的影响

目的常规实验操作对Wistar大鼠的影响。方法采用Wistar大鼠,分别进行腹腔注射、肌内注射、灌胃、尾静脉切割采血、剪尾采血和固定操作,连续处理7d后,测定各组大鼠神经内分泌、免疫、血液系统主要指标及肝脏hsp72mRNA表达量,并与对照组比较,分析这些操作的影响。结果与对照组相比,腹腔注射组、肌内注射组和灌胃组的皮质酮(CORT)、γ-干扰素(IFN-γ)、γ-干扰素/白介素-4(IFN-γ/IL-4)比值极显著升高,白细胞总数(WBC)、中性粒细胞比例(WLCR)、C-反应蛋白(CRP)、β-内啡肽(β-EP)及白介素-2(IL-2)有不同程度的显著降低。与对照组相比,尾静脉切割采血组的CORT、IFN-γ、IFN-γ/IL-4比值极显著升高,WBC、β-EP有不同程度的显著降低;剪尾采血组的CORT、IFN-γ、IFN-γ/IL-4比值有不同程度的显著升高,β-EP、IL-2、CRP极显著降低;固定组的CORT、IFN-γ/IL-4比值、IL-2、CRP极显著升高,WBC、β-EP、IL-4有不同程度的显著降低。与对照组相比,所有实验操作均使热休克蛋白(HSP)hsp72mRNA表达极显著升高。此外,与对照组相比,肌内注射组的红细胞数(RBC)和血红蛋白含量(HGB)显著升高,尾静脉切割和剪尾采血组的HGB和红细胞压积(HCT)极显著降低,固定组的RBC、HGB和HCT均极显著升高。结论本研究中涉及的常规实验操作均引起了大鼠极显著的应激反应,并造成了大鼠神经内分泌系统的紊乱及免疫功能的抑制,从而对动物造成了恶性应激。同时这些操作可能会对涉及的神经内分泌及血液学指标的相关研究产生背景性干扰。