银染法观察铜绿假单胞菌生物被膜

目的 评估银染法鉴定铜绿假单胞菌生物被膜的效果.方法 体外平板法制备铜绿假单胞菌生物被膜模型,用银染法观察鉴定.结果 银染后普通光学显微镜和扫描电镜观察铜绿假单胞菌生物被膜.结论 银染法鉴定铜绿假单胞菌生物被膜简单可靠.     

群体感应对铜绿假单胞菌生物被膜形成的调控

生物被膜是一种与浮游细胞相对应的生长方式,由细菌和自身分泌的包外基质组成。铜绿假单胞菌是研究这一生长方式的模式生物。在过去十年,对铜绿假单胞菌生物被膜的研究已取得显著进展。群体感应(QS)的细胞沟通机制在铜绿假单胞菌生物被膜形成中发挥着重要作用。介绍生物被膜的特点,并重点讨论了QS和生物被膜之间的关系。     

铜绿假单胞菌生物被膜与宿主免疫的关系

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)是一种常见的革兰阴性条件致病菌,能引起严重的院内感染,可从支气管扩张、肺囊性纤维化(CF)等患者体内分离。机体免疫系统可以通过识别不同的病原体相关分子模式(PAMPs)来抵御P.aeruginosa的感染,但P.aeruginosa生物被膜(BF)的形成可以导致这些成分被遮蔽从而引起免疫逃逸,导致疾病的迁延难愈。BF是一种与游离细菌相对立的生活方式,能帮助细菌有效适应外部环境,其可以通过藻酸盐的屏障作用,抵抗吞噬细胞的吞噬,干扰多核白细胞(PMNs)的激活,从而逃避宿主免疫。研究P.aeruginosa-BF的免疫逃逸机制,发现有效清除P.aeruginosa-BF的方法,从而为临床治疗P.aeruginosa引起的感染性疾病提供科学依据。现以P.aeruginosa为例对近年来国内外BF的免疫逃逸机制的研究进展进行综述。     

铜绿假单胞菌生物被膜对抗菌药物作用影响的实验研究

细菌生物被膜形成在难治性感染中起重要作用,本实验在体外进行铜绿假单胞菌生物被膜与抗菌药物作用的研究。铜绿假单胞菌在生理盐水特氟隆系统孵育6d,可在特氟隆表面上形成细菌生物被膜(Biofilm),经扫描电镜证实,它包裹在微菌落表面。应用环丙氟哌酸,甲红霉素,罗红霉素,穿心莲作用于生物被膜细菌并观察结果。发现与2倍MIC环丙氟哌酸作用4h后,悬浮细菌存活率降至002%,但生物被膜细菌存活率则为41%,当10μg/mL甲红霉素,12μg/mL罗红霉素,005g/mL穿心莲分别与环丙氟哌酸联合应用时,生物膜细菌存活率分别降至02%,05%和27%。结果表明生物被膜细菌对环丙氟哌酸的抵抗力较悬浮细菌明显增强,而环丙氟哌酸分别与甲红霉素,罗红霉素,穿心莲联合应用则有明显抑菌作用。推测此种联合用药方式可能提高对难治性感染的治疗效果     

铜绿假单胞菌铁摄取与生物被膜形成研究进展

生物被膜是单细胞微生物通过其分泌的胞外多聚基质粘附于介质表面并将其自身包绕其中而成的膜样微生物细胞聚集物。生物被膜的形成使细菌具有更强的适应外界环境的能力,也是导致微生物产生耐药性及慢性感染性疾病难以治疗的重要原因之一。铜绿假单胞菌在肺部的定殖是肺囊性纤维化病患者发病和死亡主要原因,其造成的感染通常与形成抗生素抗性极强的生物被膜有关。铜绿假单胞菌生物被膜的形成受控于多种复杂的细菌调控体系之下,包括群体感应系统及参与调节胞外多聚基质合成的双组分调控系统等。此外,为了利用低浓度的环境铁来维持生存并完成各种生理功能,铜绿假单胞菌进化出了一系列铁摄取系统,这些系统对其毒力因子的释放和生物被膜的形成又起着重要的调控作用。本文主要对铜绿假单胞菌生物被膜的形成与调控机制及其铁摄取系统进行了综述,为进一步了解及清除铜绿假单胞菌引发的问题提供途径与思路。     

穿心莲内酯抗铜绿假单胞菌生物被膜及与阿奇霉素协同抗菌作用

目的研究穿心莲内酯抗铜绿假单胞菌生物被膜及与阿奇霉素协同抗菌作用。方法微量倍比稀释法测定穿心莲内酯对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度（MIC）,棋盘稀释法测定穿心莲内酯和阿奇霉素协同抗菌作用,MTT法测定穿心莲内酯对铜绿假单胞菌生物被膜的最小抑膜浓度（SMIC）,显微镜下观察药物对生物膜形态的影响。结果穿心莲内酯对铜绿假单胞菌的MIC 50μg/mL,和阿奇霉素有协同抗菌作用。穿心莲内酯对铜绿假单胞菌生物被膜的SMIC501天25μg/mL、3天25μg/mL、7天50μg/mL;SMIC801天50μg/mL、3天50μg/mL、7天100μg/mL,形态观察提示穿心莲内酯SMIC80浓度对铜绿假单胞菌生物被膜的抑制作用明显。结论穿心莲内酯具有抗铜绿假单胞菌生物被膜作用,对阿奇霉素也有协同抗菌作用。     

靶向破坏铜绿假单胞菌生物被膜的定向蛋白投放技术

[目的]随着合成生物学的发展,通过在细菌体内设计合成复杂、多功能的基因线路进行靶向治疗已经取得巨大进展.虽然这种使用细菌作为治疗传递系统,选择性地在体内释放有效治疗成分的方式具有极大优势,但是如何使细菌在代谢负荷增加较低的情况下有效地分泌功能蛋白并发挥作用依旧是一个难题.[方法]针对这一难题,本研究提供了一种新的策略,...     

绿原酸通过增强RsmA的表达抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成

铜绿假单胞菌是常见的人类条件致病菌,其生物被膜的形成会增强菌体的耐药性。已有文献报道绿原酸可抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成,本研究在此基础上主要探究了其对全局性次级代谢调控系统Gac-Rsm表达的影响。结果显示,绿原酸可抑制铜绿假单胞菌生物被膜形成的能力,降低胞外总多糖合成量,但关键胞外多糖psl的合成酶基因pslA转录未受影响,还可增强Gac-Rsm系统中关键调控因子RsmA的表达水平,降低细胞内关键信使分子环二鸟苷酸(cyclic dimeric guanosine monophosphate,c-di-GMP)水平。结果表明,绿原酸可通过增强RsmA的表达来抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成。     

铜绿假单胞菌生物被膜对巨噬细胞的免疫逃逸作用及机制

目的 探讨铜绿假单胞菌生物被膜对巨噬细胞的免疫逃逸作用以及相关机制。方法 用PMA刺激THP-1细胞获得巨噬细胞模型。用6孔板建膜法获得铜绿假单胞菌生物被膜菌。分别用铜绿假单胞菌的生物被膜菌和浮游菌感染巨噬细胞,观察巨噬细胞形态的变化,并检测巨噬细胞的细胞毒性和吞噬功能的变化。进一步用ELISA试剂盒检测感染的巨噬细胞培养上清中炎症细胞因子IL-1β的变化。结果 成功构建巨噬细胞模型和铜绿假单胞菌生物被膜菌模型。与感染了浮游菌的细胞相比,感染了生物被膜菌的巨噬细胞形态变化小,释放的LDH降低,吞噬功能减弱,IL-1β的表达量减少。结论 铜绿假单胞菌生物被膜菌可以逃逸巨噬细胞的免疫防御作用,其机制可能与降低巨噬细胞的炎症反应有关。     

PH826噬菌体与抗生素联用有效抑制多重耐药铜绿假单胞菌生物被膜的形成

【目的】铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种重要的革兰氏阴性病原体,可以加重囊性纤维化患者的肺部感染,最终会导致患者的死亡。然而由于多重耐药(multi-drug resistant,MDR)和泛耐药(pan-drug resistant, PDR)铜绿假单胞菌菌株的出现,使其防控变得更为严峻。【方法】从养殖场污水中分离能有效裂解多重耐药铜绿假单胞菌的噬菌体,研究其形态特征、生物学特性、宿主谱范围、基因组特征和体外抑菌能力等,并采用噬菌体和抗生素联用的方法进行生物被膜的抑制试验。【结果】透射电子显微镜的形态分析和基因组分析结合表明,该噬菌体属于Nankokuvirus病毒属。生物学特性试验表明,PH826具有广泛的温度稳定性(4-60℃)和pH稳定性(3.0-11.0)。宿主谱测试显示,PH826可以裂解13株铜绿假单胞菌(包括人源和动物源),体外抑菌试验显示,PH826在感染复数(multiplicity of infection, MOI)分别为10、1、0.1时对铜绿假单胞菌均有强烈的裂解作用。根据基因组分析,PH826噬菌体的基因组大小为87 95...     

植物精油对铜绿假单胞菌群体感应系统的抑制作用研究进展

群体感应（quorum sensing,QS）是细菌个体与个体之间的一种交流机制,广泛存在于细菌中。铜绿假单胞菌是人类的一种条件致病菌,它具有至少3种QS系统,即las、rhl和pqs系统,且各系统之间存在着级联调控关系,它们共同作用调控着该菌众多毒力基因的表达和毒力因子的产生。近年来,通过抑制铜绿假单胞菌的QS系统以控制其毒力和致病力,成为一种新型的铜绿假单胞菌感染防控策略。植物精油是一种天然的群体感应抑制剂（quorum sensing inhibitors, QSI）,多种精油活性化合物都能抑制铜绿假单胞菌的QS系统,而且尚未发现细菌对其产生耐药性。基于此,梳理了铜绿假单胞菌QS系统的组成及其级联调控关系,简要介绍了植物精油的QS抑制机制和抑制活性,并重点综述了萜烯类化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物、含硫含氮化合物4类精油化合物对铜绿假单胞菌QS系统抑制作用的研究进展,以期为从天然化合物中发现和筛选安全、高效的细菌QSI的相关研究提供参考,并为致病菌的防控奠定理论基础。     

Effects of quorum sensing autoinducer degradation gene on virulence and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa

The aiiA gene from Bacillus thuringiensis was cloned into the Pseudomonas/E. coli shuttle vector and transformed into Pseudomonas aeruginosa strain PAO1. Western blotting showed that the AiiA protein was expressed in PAO1. After induction by IPTG for 6 h and 18 h, expression of the aiiA gene in PAO1 completely degraded the quorum sensing autoinducers N-acylhomoserine lactones (AHLs): N-oxododecanoyl-L-homoserine lactone (OdDHL) and N-butyryl-L-homoserine lactone (BHL). The reduced amount of AHLs in PAO1 was also correlated with decreased expression and production of several virulence factors such as elastase and pyocyanin. AiiA expression also influenced bacterial swarming motility. Most importantly, our studies indicated that aiiA played significant roles in P. aeruginosa biofilm formation and dispersion, as observed by the differences of the biofilm formation on liquid and solid surfaces, and biofilm structures under a scanning electron microscope. These authors contributed equally to this work Supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 30570020) and Natural Science Foundation of Hubei Province of China (Grant No. 2004ABA120)     

铜绿假单胞菌产酰化高丝氨酸内酯信号分子抑制剂的生产及分离

目的：通过自体诱导信号分子抑制剂的生产获得部分分离纯化的酰化高丝氨酸内酯（AHL）抑制剂。方法：病原菌铜绿假单胞菌经摇床培养后获得AHL抑制剂,采用溶解度差异性和树脂进行分离纯化。结果：铜绿假单胞菌PAO1不仅分泌自体诱导信号分子,而且在生长的后期还合成一种信号分子抑制剂,该信号分子抑制剂对群体感应中的AHL类信号分子有明显的抑制作用;该抑制剂具有醇溶性和水溶性,采用乙醇溶解可以除去糖类和无机小分子等不溶于醇的物质;大孔吸附树脂不具有吸附抑制剂的能力,但可以除去醇溶性糖类物质;阴离子交换树脂能够吸附信号分子抑制剂,具有较好的分离效率。结论：获得了除去大部分杂质,得到部分分离纯化的AHL抑制剂。     

大蒜素对铜绿假单胞菌生物膜早期黏附及胞外多糖的影响

目的研究大蒜素对铜绿假单胞菌PA01菌株生物膜（biofilm,BF）早期黏附及胞外多糖复合物（Extracellular Polymeric Substances,EPS）的影响。方法利用荧光多功能酶标仪检测各组不同时间点96孔板中pGF-Puv转化PA01菌株的荧光强度,计算黏附率以表示干预对不同时间点细菌黏附的影响,利用荧光显微镜下定性观察细菌的黏附量;应用异硫氰酸标记的刀豆蛋白A（FITC conjugated concanavalin A,FITC-conA）特异性结合细菌EPS,荧光显微镜下定性观察各组EPS的变化;利用硫酸-苯酚法定量各组细菌EPS的产量。结果6h组,大蒜素高浓度干预后细菌的黏附率由0．70±0．03下降至0．50±0．01,t=15．014,P〈0．05,大蒜素低浓度干预后黏附率也有下降,但不及高浓度组明显;除了9h组其他时间组趋势与6h组大致相似,可能与大蒜素含量下降有关。荧光显微镜观察可见生理盐水对照组细菌菌落分布,干预组黏附的细菌稀疏散在分布,以高浓度为甚。FITC-conA可使胞外多糖显色,在荧光显微镜下观察可见大蒜素干预后EPS减少,稀薄;EPS定量实验,EPS总量大蒜素高浓度干预组（181．19±1．59）μg较生理盐水对照组（602．66±21．94）μg有明显降低,t=60．589,P〈0．05。结论大蒜素可显著减少PA01菌株黏附及产EPS的能力。     

细菌群体感应参与铜绿假单胞菌胞内聚羟基脂肪酸酯合成的调控

群体感应是细菌根据细胞密度变化调控基因表达的一种调节机制。铜绿假单胞菌中QS系统由lasI和rhlI合成的信号分子3OC12-HSL和C4-HSL以及各自的受体蛋白LasR、RhlR组成,它们以级联方式调控多个基因表达。【目的】研究细菌群体感应(QS)对聚羟基脂肪酸酯合成的调控。【方法】利用铜绿假单胞菌PAO1及其QS突变株为材料通过气相色谱、荧光定量PCR在生理和分子水平上研究QS对聚羟基脂肪酸酯合成的调控。【结果】QS信号分子合成抑制剂阿奇霉素处理铜绿假单胞菌PAO1和QS突变株导致胞内PHA积累量显著减少;铜绿假单胞菌PAO1中C4-HSL合成酶基因rhlI缺失突变株PAO210胞内PHA积累量与野生型无差别;而3OC12-HSL合成酶基因lasI缺失突变株PAO55、3OC12-HSL受体合成酶基因lasR缺失突变株PAO56以及lasI/lasR双缺失突变株PAO57胞内PHA含量与野生型相比明显减少;lasI和lasR的突变株体内PHA合成酶基因phaC1的表达量显著降低,信号分子3OC12-HSL回补实验使phaC1的表达量可恢复到野生株水平,但只可部分恢复lasI缺失导致的胞内PHA合成。【结论】由此推测,铜绿假单胞菌群体感应系统中lasI/lasR系统参与胞内聚羟基脂肪酸酯合成的调控。     

Identification of a novel regulator of the quorum-sensing systems in Pseudomonas aeruginosa

Quorum sensing is a global gene-regulatory mechanism in bacteria that enables individual bacterial cells to communicate and coordinate their population behaviors. Quorum sensing is central to the pathogenesis of many bacterial pathogens including Pseudomonas aeruginosa and therefore has been exploited as a target for developing novel antipathogenic drugs. In P. aeruginosa , three intertwined quorum-sensing systems, las, rhl , and the 2-alkyl-4(1 H )-quinolone system, which includes the Pseudomonas quinolone signal (PQS), control virulence factor production, and pathogenesis processes. Previously, we obtained a mutant with diminished expression of the phzA1B1C1D1E1F1G1 operon that is involved in the production of virulence factor phenazine compounds. In this study, the mutant was further characterized, and evidence indicating that the disrupted gene PA1196 in the mutant is a potential regulator of the rhl and PQS systems is presented. PA1196 positively controls the expression of the rhl and PQS systems and affects bacterial motility and multiple virulence factor expression via the quorum-sensing systems. This adds an important new player in the complex quorum-sensing network in P. aeruginosa .     

铜绿假单胞菌Arr基因突变对生物膜和绿脓菌素合成的影响

为了研究铜绿假单胞菌Arr基因对生物膜和绿脓菌素合成的影响,采用抗庆大霉素基因序列(Gentamycin resistance cassette,aacC1)插入失活的策略构建了铜绿假单胞菌Arr基因突变株PA-AG,通过96孔板静止培养、结晶紫染色的方法检测其生物膜的形成量,利用抽提的方法检测绿脓菌素的合成量。结果在KMB或LB培养基中,突变株PA-AG形成生物膜的量均有所减少,野生株约是突变株的2倍,然而突变株合成绿脓菌素的能力却明显加强,约为野生株的2.5倍。由此推测,铜绿假单胞菌Arr基因在一定程度上促进了生物膜的形成,抑制了绿脓菌素的合成。     

Biofilm inhibition and anti-quorum sensing activity of phytosynthesized silver nanoparticles against the nosocomial pathogen Pseudomonas aeruginosa

Quorum sensing (QS), the communication signaling network, regulates biofilm formation and several virulence factors in Pseudomonas aeruginosa PAO1, a nosocomial opportunistic pathogen. QS is considered to be a challenging target for compounds antagonistic to virulent factors. Biologically synthesized silver nanoparticles (AgNPs) are reported as anti-QS and anti-biofilm drugs against bacterial infections. The present study reports on the synthesis and characterization of Piper betle (Pb) mediated AgNPs (Pb-AgNPs). The anti-QS activity of Pb-AgNPs against Chromobacterium violaceum and the potential effect of Pb-AgNPs on QS-regulated phenotypes in PAO1 were studied. FTIR analysis exhibited that Pb-AgNPs had been capped by phytochemical constituents of Pb. Eugenol is one of the active phenolic phytochemicals in Pb leaves, therefore molecular docking of eugenol-conjugated AgNPs on QS regulator proteins (LasR, LasI and MvfR) was performed. Eugenol-conjugated AgNPs showed considerable binding interactions with QS-associated proteins. These results provide novel insights into the development of phytochemically conjugated nanoparticles as promising anti-infective candidates.