凝胶色谱柱复性在低分子量尿激酶原突变体(DscuPA\|32K)中的应用

将构建的一种具溶栓和抗栓双重功能尿激酶原突变体(DscuPA\|32K)基因,在大肠杆菌中进行表达。由于DscuPA\|32K分子较大并且表达量较高,目的蛋白质基本以包涵体的形式存在。包涵体中的蛋白质是无活性的蛋白质,为了获得有活性的蛋白质,就需要对包涵体进行变性及复性。尝试了一种新的凝胶色谱柱复性方法,并通过柱复性方法与常规的稀释复性方法进行了比较,发现柱复性方法明显优于稀释复性方法,具有成本低,效率高,并对目的蛋白质(DscuPA\|32K)进行了初步纯化等优点,尤其对酶这一类容易失活降解的蛋白质进行复性时,很值得进行推广应用。     

人尿激酶原基因在大肠杆菌中的高效表达

本文用ＰＣＲ方法对人工合成的尿激酶原ｃＤＮＡ基因５＇端进行改造,将之克隆到表达载体ｐＫＫ２３３－２中,转化大肠杆菌ＪＡ２２１,经ＩＰＴＧ诱导,获得了占总菌体蛋白１５％的高表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果显示表达产物主要为单链尿激酶,并且在菌体内基本上以无活性的包含体形式存在,经体外变复性,从１升培养基中可获得３０００００单位的活性尿激酶原。     

人尿激酶原cDNA序列缺失突变体的构建及表达

采用PCR重叠延伸法和基因重组技术构建了人尿激酶原cDNA序列中缺失150～156位氮基酸的突变体,以COS-7细胞中获得暂时性表达以及在CHO细胞中稳定高效表达,其表达水平为450～500IU／10⁶cell／24h,表达产物经SDS-PAGE电转溶实验和westemblot分析证明,细胞分泌的Pro-UK突变体与天然Pro-UK以及完整全长DNA序列表达Pro-UK的分子量相同,为54kDa．绝大多数为单链,比完整cDNA序列表达产物的单链比例明显增高,与纤维蛋白的亲和性有所提高。     

液胶色谱柱复性在低分子量尿激酶原突变体（DscuPA—32K）中的应用

将构建一种具溶栓和抗栓以重功能尿激酶原突变体（DscuPA-32K)基因,在大肠杆菌中进行表达。由于DscuPA-32K分子较大并且表达量较高,目的的性质基本以包涵体的形式存在。包涵体中的蛋白质是无活性的蛋白质,为了获得有活性的蛋白质,就需要对包涵体进行变性及复性。尝试了一种新的凝胶色谱柱复性方法,并通过柱复性方法与常规的稀释复性方法进行了比较,发现柱复性方法明显优于稀释复性方法,具有成本低,效率高,并对目的的蛋白质（DscuPA-32K)进行了初步纯化等优点,尤其对酶这一类容易失活降解的蛋白质进行复性时,很值得进行推广应用。     

纤维蛋白肽与低分子量尿激酶原融合蛋白的构建及性质

将人工合成的寡核苷酸片段进行定向连接后, 得到编码纤维蛋白β链N端(β 15～42)多肽的基因片段及连接区片段(linker), 再与低分子量尿激酶原(scuPA-32k) cDNA分子进一步连接后, 得到了Fβ(15～42)/scuPA-32k的融合基因.在大肠杆菌中经过IPTG诱导表达, 经过变性及复性, Zn²⁺螯合层析及Sephacryl S200凝胶层析后, 目的蛋白被纯化.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)显示为一条蛋白质纯化条带, 分子质量为35 ku. 经纤维蛋白平板法测定比活为87 000 U/mg.经纤溶酶活化后的融合蛋白与低分子量尿激酶相比,对显色底物S2444酶促动力学性质相似.同时Fβ(15～42)/scuPA-32k具有较高的纤维蛋白的亲和性并能抑制纤维蛋白凝块的形成.     

缺失突变法研究尿激酶——单链抗体融合基因在大肠杆菌中的高表达

对抗人纤维蛋白二聚体单链抗体与scu-PA-32K融合基因的表达质粒进行内切酶切割、拼接和外切酶Bal 31消化,得到了该融合基因的一系列缺失突变体,通过对这些突变体表达情况的研究,将影响表达的关键因素定位于基因的841～851位,可能对应于两个连排的大肠杆菌稀有密码子AGG(精氨酸),用PCR定位诱变法把这两个AGG均改造成CGT后,融合蛋白的表达量从改造前的2%～3%提高到了约30%。     

表达人尿激酶原突变体的重组山羊乳腺特异性表达慢病毒载体的构建

目的：构建山羊乳腺特异性表达尿激酶原突变体的重组慢病毒载体,证明其表达的有效性。方法：将劳氏肉瘤病毒增强子／启动子、复制缺陷型人免疫缺陷病毒（HIV-1）的5′端长重复序列（LTR）、HIV-1ψ包装信号、HIVRev反应元件、山羊β-酪蛋白调控序列、尿激酶原M13cDNA、AU3／3′LTR、牛生长激素（BGH）基因poly（A）依次连接,构建乳腺特异性表达的慢病毒载体,通过体外转染人乳腺癌细胞系MCF-7、中国仓鼠卵巢细胞及泌乳山羊乳腺注射证明其表达有效性。结果：酶切鉴定证实山羊乳腺特异性表达载体构建正确;将该载体转染细胞,采用溶圈法和Western印迹检测证实了其表达的有效性;慢病毒载体注射到泌乳山羊的乳腺,在乳汁中也检测到了尿激酶原的表达。结论：为在转基因动物乳腺中表达尿激酶原突变体奠定了基础。     

人尿激酶原cDNA在昆虫杆状病毒真核表达系统中的高效表达

人尿激酶原是一种新型溶栓剂,优于尿激酶,具有血纤维蛋白特异性,为了在昆虫杆状病毒表达系统中高效表达ｐｒｏ－ＵＫ,我们在ｐＡｃ３７３基础上,插入野生型ＡｃＭＮＰＶ ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ启动子区－７～－１碱基序列,构建了一个高表达转移载体ｐＡｃＹＴ．分别经三次克隆将ｐｒｏ－ＵＫ ｃＤＮＡ正向插入到转移载体ｐＡｃ３７３或ｐＡｃＹＴ的ＢａｍＨＩ－ＫｐｎＩ位点上。用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ将ｐＡｃＹＴ－ＵＫＤＮ     

重组腺病毒介导的人尿激酶原突变体在山羊乳汁中的表达

构建携带人尿激酶原突变体cDNA的重组腺病毒,通过该腺病毒介导实现外源基因在山羊乳腺中表达。通过大肠杆菌内同源重组将人尿激酶原突变体cDNA插入到腺病毒载体中,经过293细胞包装获得重组腺病毒,直接注射到泌乳山羊乳腺,收集感染后1~4天的乳汁,利用纤维蛋白溶圈试验、Western blot、ELISA检测乳清中尿激酶原突变体的表达。结果显示病毒注射后1~4天乳清中均可检测到尿激酶原的表达,其表达量可达0.41mg/ml。该方法可以实现重组蛋白在山羊乳腺的短期表达,可能是大规模生产临床医疗蛋白的一条经济有效的途径。     

人尿激酶原（pro－urokinase）基因在大肠杆菌中的高效表达

本文用ＰＣＲ方法对人工合成的尿激酶原。ＤＮＡ基因５’端进行改造,将之克隆到表达载体ｐＫＫ２３３－２中,转化大肠杆菌ＪＡ２２１,经ＩＰＴＧ诱导,获得了占总菌体蛋白１５％的高表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示表达产物主要为单链尿激酶,并且在菌体内基本上以无活性的包含体形式存在。经体外交复性,从１升培养基中可获得３０００００单位的活性尿激酶原。     

载脂蛋白E3的克隆及原核表达

载脂蛋白Ｅ(ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ ,ａｐｏＥ)由 2 99个氨基酸组成 ,分子量 34ｋＤ ,是维持人体正常脂质代谢的必需蛋白质 .它是乳糜微粒 (ＣＭ )、极低密度脂蛋白 (ＶＬＤＬ)和高密度脂蛋白 (ＨＤＬ)的组分 ,是极低密度脂蛋白受体的重要配体 ,是脂质进入细胞不可缺少的中介 .ａｐｏＥ有 3种同分异构体 :ａｐｏＥ2、ａｐｏＥ3、ａｐｏＥ4 ,分别具有不同的生理作用 .ａｐｏＥ4与血浆高胆固醇、心血管疾病和老年痴呆等疾病关联[1～ 3 ] .ａｐｏＥ2与Ⅲ型高脂血症有关 ,并对老年痴呆有防治作用[4,5] .ａｐｏＥ3是大多数健康人所具有…     

中国人γ－干扰素cDNA在大肠杆菌中的高效表达

应用RT-PCR技术从中国人淋巴细胞mRNA反转录产物中克隆了IFN-γcDNA,序列分析证实了分子进化规律对IFN-γcDNA序列存在多态性的推论.在此基础上应用DNA重组技术,将去信号肽中国人IFN-γcDNA克隆到原核表达质粒pBV220 P_RP_L启动子下游,转化大肠杆菌DH5α,通过温度诱导表达,成功地在大肠杆菌中稳定、高效地表达了中国人IFN-γcDNA,其表达水平占全菌可溶性总蛋白的44.4%,初步复性后生物学活性测定结果表明γ-IFN表达量为0.45×10⁷～2.34×10⁷单位/L.     

高赖氨酸蛋白基因在大肠埃希菌中的表达

从四棱豆中克隆高赖氨酸蛋白基因wblys,通过PCR扩增wblys片段,转入原核表达载体pGEX-4T-1,构建pGEX-4T-1/wblys大肠埃希菌工程菌,表达重组蛋白,IPTG诱导后,发现细菌全蛋白在44 ku(含GST标签)处多出1条明显条带。HPLC检测赖氨酸含量。诱导后菌体总赖氨酸含量比正常菌体提高15.84 mg/g。在大肠埃希菌中高效表达植物源高赖氨酸蛋白基因,为该基因在益生菌中表达提供研究工作基础。     

大肠杆菌VT噬菌体受体(vpr)基因突变株的鉴定

近年来大肠杆菌O157引起的人和动物的发病率呈上升趋势^[1-3],O157的强致病性与很多因子有关,如：粘附因子、肠溶血素(Enterohaemolysin,Ehx)、Vero毒素(Vero toxin,VTs)等。VT可致人和动物的腹泻、出血性肠炎、溶血性尿毒综合证、血栓、血球减少性紫癜等疾病^[4],是O157主要的致病因子。大量的研究表明VT是由λ家族具有vT基因的噬菌体(vT—phage)编码的^[5],且在噬菌体感染宿主菌的裂解状态时由晚期调节基因调控毒素的产生。可见大肠杆菌O157所产的vT与vT噬菌体的感染有关。大肠杆菌表面是否存在噬菌体的受体为众多科学工作者所关注,1999年Saunders等在大肠杆菌染色体中克隆出一段与VT2噬菌体敏感性有关的基因^[6],将其定名为vpr(verotoxin phage receptor)。为了进一步确定vpr基因的功能,本试验利用同源重组的方法,将已经构建的含vpr基因片段的重组自杀性质粒pYYvpr,转化到含全长vpr基因的大肠杆菌MC1061,经PCR和southern blot鉴定,获得一株染色体同源基因突变株,并对其进行生物学特性研究,初步证实该基因与噬菌体的裂解性感染有关。     

假单胞菌海因酶基因在大肠杆菌中的高效表达(英文)

为实现利用生物酶转化法进行D 对羟基苯甘氨酸的工业化生产 ,构建了 3株海因酶基因工程菌 .利用PCR技术从恶臭假单胞菌 (Pseudomonasputida)CPU 980 1染色体DNA中扩增得到长约1.8kb的含编码区和自身启动子的海因酶全基因 .通过将海因酶全基因插入pMD18 T质粒、海因酶基因的编码区与pET 17 b质粒重组、海因酶基因编码区和T7强启动子一起插入pMD18 T质粒分别得到重组质粒pMD dht、pET dht和pMD T7 dht.将上述重组质粒分别转化大肠杆菌 (Escherichiacoli) ,通过地高辛标记菌落原位杂交和海因酶活力测定两种方法 ,筛选出具有海因酶活力的阳性转化子 .结果表明 ,大肠杆菌的RNA聚合酶能够识别和结合来自恶臭假单胞菌海因酶基因的自身启动子 ,该启动子在大肠杆菌中能够工作 .基因工程菌E .coliBL2 1 pMD dht、E .coliBL2 1 pET dht和E .coliBL2 1 pMD T7 dht的海因酶活力分别为 170 0U L、190 0U L和 2 5 0 0U L ,比野生菌P .putidaCPU 980 1的海因酶活力分别提高了 8倍、9倍和 12倍 .薄层扫描结果显示 ,这些工程菌的海因酶表达量分别约占菌体总可溶性蛋白质的 2 0 %、31%和 5 7%.SDS PAGE显示 ,海因酶的单体分子量约为 5 0kD .经工程菌E .coliBL2 1 pMD T7 dht催化 ,底物对羟基苯海因的转化率在 13h内可达到 9     

以新霉素抗性基因突变体为筛选标志的真核表达载体的构建

新霉素抗性基因(neo)是真核表达载体的常用筛选标志neo基因编码新霉素磷酸转移酶Ⅱ（NPT Ⅱ）,能催化G418、卡那霉素等多种氨基糖苷抗生素分子磷酸化而使之失去抗菌活性。通过对真核表达载体的筛选标志基因neo进行定点突变,以降低NPTⅡ的活性,然后用含neo突变体的真核表达载体pmDNA构建荧光素酶表达质粒,稳定转染CHO-K1细胞,发现表达荧光素酶的阳性细胞比例达到95%,其中高表达细胞集落的筛选率明显高于对照组。     

人膜联蛋白V在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定

目的：构建人膜联蛋白V的原核栽体并诱导其表达。方法：以IPTG诱导His融合人膜联蛋白V的表达,并应用Ni—NTA Superflow纯化。结果：PCR扩增产物碱基数量与目的片段大小一致,插入片段的序列与发表的人膜联蛋白V基因编码序列一致。在IPTG诱导下,重组大肠杆茵DH5a高效表达分子量约36kDa的目的产物。结论：人膜联蛋白V编码序列已被克隆至His融合表达载体pET-28a（＋）上,并在大肠杆菌DH5α中表达：     

苏云金杆菌以色列亚种cryIVB基因在E.coli中的高表达

韭菜迟眼蕈蚊（Ｂｒａｄｙｓｉａｏｄｏｒｉｐｈａｇａ）幼虫以取食根部危害韭菜的生长．为了研究有效的生防制剂,采用ＤＮＡ聚合酶链式反应方法,从苏云金杆菌以色列亚种（Ｂｔｉ）得到３．５ｋｂ的开放阅读框架（ＯＲＦ）,其包括Ｂｔｉ杀虫蛋白基因ｃｒｙＩＶＢ的结构基因和部分上游启动区．将结构基因亚克隆到高表达载体ｐＱＥ５２中,构建了高表达质粒ｐＱＥ５２Ｂ．在Ｅ．ｃｏｌｉＳＧ１３００９（ｐＲＥＰ４）中,经ＩＰＴＧ诱导,１３０ｋＤ的蛋白表达量约占细胞总蛋白的７．９％,其对韭菜迟眼蕈蚊三龄幼虫具有较强的毒杀作用．为进一步利用ｃｒｙＩＶＢ基因,构建生防工程菌株打下了基础