脲酶在生物工程中的应用

脲酶是一种高效的尿素分解催化剂,化学反应速度是常规化学催化的1014倍,广泛应用于工业、农业和医药行业.论述脲酶在生物工程中的应用,内容包括检测血、尿、酒饮料、天然水和环境污水中尿素;检测肌酐和精氨酸;消除肾衰竭病人体内多余尿素,消除酒饮料和废水中尿素;回收太空飞船上的废水和控制多级酶促反应中的pH.     

第三章 酶(提要)

酶是生物催化剂,因此它既有一般催化剂的共性,又有不同于一般催化剂的特性:有极高的催化效率,高度的专一性,其活性是受调节的,所需作用条件温和,但易失活。酶的种类繁多,根据酶催化反应的性质,对酶进行了系统的分类和命名。酶的化学本质是蛋白质,是经无数实践证实了的,但是从80年代初期陆续发现了一些RNA也有催化活性。这些RNA被认为是非蛋白质的新型的生物催化剂。     

新生物催化剂的筛选与开发

生物催化剂是具有催化作用的游离或固定化细胞和游离或固定化酶的统称.目前,筛选新生物催化剂的方法有两种:一是从环境样品中筛选全新的生物催化剂;二是探索现有生物催化剂的非天然新活力.本文详细综述了筛选新生物催化剂的方法及策略,并着重介绍了从微生物源开发新生物催化剂的方法.     

半理性设计进化土曲霉来源的ω-转氨酶AtTA热稳定性

转氨酶(ω-transaminase,ω-TA)作为一种天然的生物催化剂,在手性胺类化合物的合成中具有较好的应用前景。但ω-TA在催化非天然底物的反应过程中存在稳定性差、活性低的缺陷,大大限制了ω-TA的应用。为改善此缺陷,针对来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的(R)-ω-TA(At TA),采用基于分子动力学模拟的计算机辅助设计与随机突变、组合突变相结合的策略进行酶的热稳定性改造,获得了热稳定性与活性同步提高的最佳突变酶At TA-E104D/A246V/R266Q (M3)。与At TA野生酶(wild-type, WT)相比,M3的半衰期t_1/2 (35℃)由17.8 min提升至102.7 min,提升了4.8倍,半失活温度T₅₀¹⁰比WT (38.1℃)提高2.2℃。最佳突变酶M3对丙酮酸和1-(R)-苯乙胺的催化效率分别是野生酶的1.59倍和1.56倍。分子动力学模拟与分子对接结果表明,分子内氢键与疏水相互作用的增加所导致α-螺旋的加固稳定是酶热稳定性提升的主要原因;底物分子与结合口袋氨...     

作为人造极端酶的交联酶晶体

作为人造极端酶的交联酶晶体林影卢荣德郭勇（华南理工大学生物工程系,广州５１０６４０关键词交联酶晶体极端酶酶作为生物催化剂,催化效率高,立体选择性和底物专一性强,是普通化学催化剂所不可比拟的。然而,在酶的应用过程中还有很多令人不满意之处,如在环境中常常...     

链霉菌A048产几丁质酶最佳发酵工艺研究*

将链霉菌A048在完全培养基中培养至对数生长末期,离心洗涤收集菌丝体,然后接种入发酵产酶培养基中,进行二步发酵工艺生产几丁质酶,几丁质酶活力比一步发酵工艺提高1.1倍,发酵周期共54h,比一步发酵工艺缩短66h;把菌丝体与几丁质粉共固定化,接入发酵产酶培养基中培养36h,几丁质酶活力比一步发酵工艺提高1.8倍,发酵周期缩短54h;在二步发酵工艺中另添加0.4%纤维素,几丁质酶活力可提高4倍,比一步发酵工艺提高10倍,酶活力达18.52U/mL。采用几丁质和纤维素双因子诱导二步发酵工艺可能是链霉菌A048生     

链霉菌A048产几丁质酶最佳发酵工艺研究

将链霉菌A048在完全培养基中培养至对数生长末期,离心洗涤收集菌丝体,然后接种入发酵产酶培养基中,进行二步发酵工艺牛产几丁质酶,几丁质酶活力比一步发酵工艺提高1．1倍,发酵周期共54h,比一步发酵工艺缩短66h;把菌丝体与几丁质粉共固定化,接入发酵产酶培养基中培养36h,几丁质酶活力比一步发酵工艺提高1．8倍,发酵周期缩短54h;在二步发酵工岂中另添加0．4％纤维素,几丁质酶活力可提高4倍,比一步发酵工艺提高10倍,酶活力达18．52U／mL。采用几丁质和纤维索双因子诱导二步发酵工艺可能是链霉菌A048生产几丁质酶的最佳工艺。     

一项有意义的探究活动

“酶的特性”是现行高中生物学课程的一组引导式学生探究实验。其中“酶的高效性、专一性”探究设置在必修教材里,为学生提供了较为规范的探究性学习活动。是学生学习生物学探究实验方案设计的起始课;“温度对酶活性的影响”分布于选修教材中,是必修部分内容的深化和拓展。就实验内容来说,催化剂是学生十分熟悉的内容。但生命体中的特殊催化剂——酶却是他们深感陌生的问题。     

甘薯属植物过氧化物酶同工酶分析

采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对23份甘薯属不同倍性材料进行过氧化物酶同工酶酶谱分析。初步结果表明,过氧化物酶同工酶酶带数目与材料倍性无明显相关性;二倍体或四倍体野生种的种间酶谱差异显著;六倍体野生种不同株系间以及六倍体栽培种甘薯的不同品种间酶谱差异较小;但栽培种甘薯与六倍体野生种I.trifida(6x)、四倍体野生种I.littoralis(4x)以及二倍体野生种I.trifida(2x)的酶谱有4条明显共同标记带,表明其间有一定亲缘关系。     

嗜热子囊菌利用短链有机酸生产角质酶

以嗜热子囊菌(Thermobifida fusca WSH03-11)发酵生产角质酶为模型,研究微生物利用市政污泥厌氧酸化所产短链有机酸为碳源发酵生产高附加值产品的可能。发现：(1)以丁酸、丙酸和乙酸为碳源时,有机酸和氮元素浓度分别为8.0 g/L和1.5 g/L有利于角质酶的生产;而以乳酸为碳源时,最适有机酸和氮源浓度分别为3.0 g/L和1.0 g/L;(2)改变诱导物角质的浓度,以丁酸、丙酸、乙酸和乳酸为碳源,分别比优化前提高了31.0%、13.3%、43.8%和73.2%;(3)在四种有机酸中,T. fusca WSH03-11利用乙酸的速率最快,平均比消耗速率是丙酸的1.3倍,丁酸的2.0倍及乳酸的2.2倍;以丁酸为碳源时的酶活(52.4 U/mL)是乳酸的1.7倍、乙酸的2.5倍和丙酸的3.2倍;角质酶对乳酸的得率(12.70 u/mg)分别是丁酸的1.4倍、丙酸的3.0倍和乙酸的3.8倍;(4)以混合酸为碳源生产角质酶,T. fusca WSH03-11优先利用乙酸,而对丁酸的利用受到抑制。进一步研究发现,混合酸中0.5 g/L的乙酸将导致丁酸的消耗量降低66.7%。这是首次利用混合酸作碳源发酵生产角质酶的研究报道。这一研究结果进一步确证了利用市政污泥厌氧酸化所产有机酸为碳源发酵生产高附加值产品的可行性,为以廉价碳源生产角质酶奠定了良好的基础。     

嗜热子囊菌利用短链有机酸生产角质酶

以嗜热子囊菌(Thermobifida fusca WSH03-11)发酵生产角质酶为模型,研究微生物利用市政污泥厌氧酸化所产短链有机酸为碳源发酵生产高附加值产品的可能。发现：(1)以丁酸、丙酸和乙酸为碳源时,有机酸和氮元素浓度分别为8.0 g/L和1.5 g/L有利于角质酶的生产;而以乳酸为碳源时,最适有机酸和氮源浓度分别为3.0 g/L和1.0 g/L;(2)改变诱导物角质的浓度,以丁酸、丙酸、乙酸和乳酸为碳源,分别比优化前提高了31.0%、13.3%、43.8%和73.2%;(3)在四种有机酸中,T. fusca WSH03-11利用乙酸的速率最快,平均比消耗速率是丙酸的1.3倍,丁酸的2.0倍及乳酸的2.2倍;以丁酸为碳源时的酶活(52.4 U/mL)是乳酸的1.7倍、乙酸的2.5倍和丙酸的3.2倍;角质酶对乳酸的得率(12.70 u/mg)分别是丁酸的1.4倍、丙酸的3.0倍和乙酸的3.8倍;(4)以混合酸为碳源生产角质酶,T. fusca WSH03-11优先利用乙酸,而对丁酸的利用受到抑制。进一步研究发现,混合酸中0.5 g/L的乙酸将导致丁酸的消耗量降低66.7%。这是首次利用混合酸作碳源发酵生产角质酶的研究报道。这一研究结果进一步确证了利用市政污泥厌氧酸化所产有机酸为碳源发酵生产高附加值产品的可行性,为以廉价碳源生产角质酶奠定了良好的基础。     

毕赤酵母表面展示棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶催化合成APG的工艺条件优化

使用毕赤酵母细胞表面展示棘孢曲霉的β-葡萄糖苷酶作为全细胞催化剂,以葡萄糖为底物,在水-醇双相体系中逆水解合成C6-C10烷基糖苷。讨论了含水量、葡萄糖添加量、全细胞催化剂添加量、乙酸-乙酸钠缓冲液pH值和温度等主要因素对反应的影响,并与商品酶苦杏仁β-葡萄糖苷酶、Novozym188进行比较。结果表明,Novozym188不适合逆水解合成APG,苦杏仁β-葡萄糖苷酶反应所需时间短,但最终转化率不如全细胞催化剂。在5 mL反应体系中,合成HG的最优条件:葡萄糖0.1 g,全细胞催化剂0.05 g,10%pH 3.0 buffer;合成OG的最优条件:葡萄糖0.2 g,全细胞催化剂0.05 g,15%pH3.0 buffer;合成DG的最优条件:葡萄糖0.2 g,全细胞催化剂0.2 g,20%pH 3.0 buffer;放置55℃200 r/min恒温振荡器中,反应时间为72 h,HG和DG的最大产率分别为11.69%和3.58%,而OG的产率则在96 h到达最大值6.34%。     

保护酶PPO在木薯种质抗螨中的功能初步研究

目前尚不了解保护酶PPO(polyphenol oxidase)在木薯种质抗螨中的作用,为证实PPO的抗螨功能,本研究通过定量PCR和酶学试验手段分析了朱砂叶螨取食抗、感螨木薯种质后,PPO的基因表达量和酶活分别在木薯和朱砂叶螨中的变化情况。结果表明,一方面,朱砂叶螨取食1d和8d后,感螨木薯种质BRA900体内MePPO的表达量和PPO总酶活仅分别是为害前的0.99、1.02倍和1.05、1.03倍,而在抗螨木薯种质C1115体内则分别较为害前提高1.78、1.74倍和1.74、1.72倍,显著高于感螨木薯水平;另一方面,朱砂叶螨取食感螨种质BRA900 1 d和8 d后,保护酶TcPPO的基因表达量和PPO酶活分别是取食前的0.98、0.97倍和0.98、1.10倍,而取食抗螨木薯种质C1115 1 d和8 d后分别降低至为害前的0.52、0.64倍和0.54、0.57倍,显著低于取食感螨木薯水平。上述结果初步证实了保护酶PPO在木薯种质抗螨中的功能。     

人绒毛膜促性腺激素酶解片段抗原性的研究

 本文应用制备电泳从人绒毛膜促性腺激素(hCG)的嗜热菌蛋白酶酶解混合物中,分离制备出了三个hCG酶解片段。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和酶标免疫染色鉴定,表明它们具有较高纯度。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定了这三个hCG酶解片段的表观分子量分别为4.35×10~4,4.20×10~4和4.00×10~4;而完整hCG分子的表观分子量为4.75×10~4。用DNS-Cl法测知这三个酶解片段各含有两个N末端氨基酸,分别为Leu/Gly,Ile/Gly和Val/Gly,这些末端与完整hCG的N末端氨基酸不同。用ELISA法测定了这三个酶解片段对抗hCG单克隆抗体9C_2的反应性,发现它们的抗原活性分别是完整hCG分子的1.44倍、1.50倍和1.63倍。表明经酶解后,片段的抗原活性有所提高,这可能是其抗原决定区经酶解后向外暴露,使单克隆抗体更加可及之故。     

对酶概念的挑战

概述了Ｒｉｂｏｚｙｍｅ、抗体酶、生物酶工程生产的酶、人工酶、模拟酶、博莱霉素等最新科研成果,对传统的酶概念提出了严峻的挑战,并提出生物催化剂与化学催化剂两概念之间的鸿沟必将被填平。     

蜂蜜酶值的两种测定方法

蜂蜜中的酶颇为丰富,如转化酶、淀粉酶、磷酸酶及葡萄糖氧化酶等九十多种。这些酶的来源,有的是蜜蜂采集的花蜜中固有的;有的是花粉中混合进入的;有的是在采集、酿造过程中由蜜蜂腺体分泌加入蜂蜜中的。蜂蜜中两种最重要的酶是转化酶和淀粉酶。其中淀粉酶易于测定,蜂蜜中的酶值通常就是淀粉酶值的简称。酶作为蜂蜜酿造转化成熟的催化剂,在蜂巢里,蜜蜂将体内分泌出来的酶不断地加入花蜜     

删除Loop区域表面不稳定氨基酸提高 (R)-ω-转氨酶热稳定性

手性胺是一类具有重要价值的医药及精细化工中间体,如何实现手性胺类化合物的不对称合成是目前人们普遍关注的一个焦点问题。ω-转氨酶(ω-Transaminase,ω-TA)是一类能直接合成对映体手性胺的天然生物催化剂。相比于(S)-ω-TA,(R)-ω-TA的研究较少,但其需求量随着手性胺类药物的发展日趋增大。提高具有潜在应用价值的(R)-ω-TA的热稳定性,将有利于手性胺的制备。本文利用Py MOL软件和YASARA软件预测来源于土曲霉Aspergillus terreus的(R)-ω-TA中具有高温度因子(B-factor)的Loop区域,通过定点突变对Loop区域表面不稳定氨基酸逐步进行删除获得突变酶。结果表明,突变酶R131del和突变酶P132-E133del半失活温度分别为41.1℃和39.4℃,比野生酶提高了2.6℃和0.9℃;在40℃下的半衰期分别为15.0 min和10.0 min,为野生酶的2.2倍和1.5倍。此外,在400 K和10 ns的分子模拟条件下,突变酶R131del在Loop区域的均方根涨落(Root mean square fluctuation,RMSF)比野生型低,突变酶P132-E133del在Loop区域增加了4个氢键。本研究通过删除(R)-ω-转氨酶Loop区域表面不稳定氨基酸提高了该蛋白的热稳定性,同时也为其他酶热稳定性的理性设计提供了方法学指导。     

两种水杨酸代谢相关酶在逆境龙须菜中的活性研究

旨在探索水杨酸(Salicylic acid,SA)信号通路相关的两种酶——苯丙氨酸解氨酶(PAL)和β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-GA)在病烂、盐度、温度逆境和添加SA条件下在龙须菜中的活性变化。结果表明,3组病烂龙须菜中PAL和β-1,3-GA活性分别增加为对照组的1.27-1.42倍和1.26-1.35倍;高盐条件下PAL活性与对照组无显著差别,而β-1,3-GA活性在24 h和48 h分别增加为对照组的1.90倍和1.42倍;高温组PAL和β-1,3-GA活性在24 h均显著升高,分别是对照组的1.25倍和1.27倍;100μmol/L SA添加后PAL和β-1,3-GA的活性升高,但高浓度SA却抑制了两种酶的活性。结果表明,在逆境胁迫下龙须菜中PAL和β-1,3-GA的活性增加与水杨酸的抗逆作用有关,而100μmol/L SA诱导两种酶的效果最显著。     

担子菌组成型漆酶产生特性的研究

运用平板筛选法从20株不同来源的菌株中得到一株产组成型漆酶的担子菌(Basidiomycete sp.)。它在自制DC培养基上产酶能力达到058IU/mL;振荡培养的产酶效果约是静置培养的4倍。漆酶的产生与生物量在培养8d内呈现平行关系,但随后酶量并不随之而继续上升。4g/L的酪氨酸和胰蛋白胨有利于酶的产生,分别可使酶活力最高增加到249IU/mL和20IU/mL。某些化学试剂对酶的产量尚未达到诱导效果,但丁香醛连氮和邻联甲苯胺对酶产量有一定的促进作用。40℃下刺激1h后,可使酶活力提高13倍。     

基于易错PCR的黄曲霉毒素解毒酶体外分子定向进化

运用定向进化-易错PCR方法,提高黄曲霉毒素解毒酶的活力及稳定性,并结合辣根过氧化物酶 (HRP)-隐性亮绿 (RBG) 快速高通量筛选系统,构建了库容约为104的突变体库。经过两轮易错PCR,最终分别获得了耐高温70 ℃突变酶A1773、pH 4.0稳定性的突变酶A1476,pH 4.0和pH 7.5均表现稳定性的突变酶A2863,其酶活力比野生酶分别提高了6.5倍、21倍和12.6倍。经序列分析表明,发现突变酶A1773发生了Glu127Lys和Gln613Arg突变;突变酶A2863发生了Gly73