三链形成寡聚核苷酸的反基因作用机理

1957年Felsenfeld等发现一条Poly A链能跟两条Poly U链形成三螺旋,这是三链形成寡聚核苷酸(triple-forming oligonucleotide,TFO)研究的开始[1].随着DNA合成技术的进展,人们能合成各种序列的寡聚核苷酸.1987年Le Doan等[2]发现聚嘌呤或聚嘧啶寡聚核苷酸能序列特异的结合于同聚嘌呤/同聚嘧啶DNA双链的大沟内,识别的机制包括形成Hoogsteen和反Hoogsteen氢键.现在常用的包括含(G、A),含(G、T)或含(C、T)的3种TFO以及它们的类似物.人们根据TFO能序列特异的识别双螺旋DNA,从而可能影响基因的转录而发展出反基因战略.     

反基因策略：基因治疗的新方向

合成的富含嘌呤或嘧啶的脱氧寡核苷酸可与双链ＤＮＡ内特定的同聚嘌呤、同聚嘧啶序列结合形成稳定的三螺旋结构（三链ＤＮＡ）。已在体外及体内证实了在靶基因内形成的局部三链ＤＮＡ可抑制其转录,这给肿瘤和病毒感染性疾病的治疗提示了新的方向,人们称之为反基因策略。然而,三链ＤＮＡ的稳定性不够理想和靶序列的选择范围较窄等问题的存在,在一定程度上限制了反基因策略的应用。     

反基因策略及其靶序列的选择

反基因策略及其靶序列的选择刘定燮,王昌才,黄建生（第一军医大学分子生物学研究所,广州５１０５１５）关键词三链ＤＮＡ,反基因策略合成的脱氧寡核苷酸在一定条件下可缠绕于ＤＮＡ双螺旋的大沟内并以氢键与其相互作用形成三链ＤＮＡ结构。一般把这类能形成三链结构的...     

离子对嘌呤·嘌呤-嘧啶型三链DNA稳定性的影响

TFO(triplex-forming oligonucleotide)缠绕于Waston-Crick双螺旋大沟中并以Hoog-steen或反Hoogsteen氢键与其相互作用所形成的三股螺旋结构称为三链DNA。根据结构及碱基组成的不同可将它分为嘌呤(R)·嘌呤(R)-嘧啶(Y)(R·RY)和嘧啶·嘌呤-嘧啶(Y·RY)两种类型。离子对Y·RY型结构稳定性的影响已较为清楚,但对R·RY型尚未作系统研究。我们以乙肝病毒(HBV)核衣壳启动     

反基因锁核酸体外阻断乙肝病毒前S2基因表达

目的:探讨针对乙肝病毒前S2基因同聚嘌呤区的锁核酸体外抑制细胞内病毒复制的作用.方法:针对乙肝病毒前S2基因同聚嘌呤区,分别设计合成锁核酸、硫代寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以半乳糖配体介导转染HepG2.2.15细胞,采用荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR)、时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)和酶联免疫法(ELISA)分别监测1、3、5和7d细胞培养上清液中HBV DNA、HBsAg和前S2抗原的含量;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测锁核酸对细胞代谢的影响.结果:加入锁核酸后,对HBV DNA复制、HBsAg和前S2抗原表达均显示有较强的抑制作用,且抑制率随时间呈增高趋势,7d后抑制率分别达61.56％、68.18％和72.82％.各实验组与对照组比较差异均具有统计学意义(均P＜0.05).LNA对细胞代谢无明显影响.结论:针对乙肝病毒前S2基因同聚嘌呤区的反基因锁核酸,体外能有效抑制乙肝病毒的复制,既为乙肝病毒治疗提供有效靶位,也为反基因治疗提供理论和实验依据.     

三链形成寡聚核苷酸的反基因作用机制

1957年Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ等发现一条ＰｏｌｙＡ链能跟两条ＰｏｌｙＵ链形成三螺旋 ,这是三链形成寡聚核苷酸 (ｔｒｉｐｌｅ ｆｏｒｍｉｎｇｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ,ＴＦＯ)研究的开始[1] 。随着ＤＮＡ合成技术的进展 ,人们能合成各种序列的寡聚核苷酸。1 987年ＬｅＤｏａｎ等[2 ] 发现聚嘌呤或聚嘧啶寡聚核苷酸能序列特异地结合于同聚嘌呤 /同聚嘧啶ＤＮＡ双链的大沟内 ,识别的机制包括形成Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ和反Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ氢键。现在常用的包括含 (Ｇ、Ａ) ,含 (Ｇ、Ｔ)或含 (Ｃ、Ｔ)的 3种ＴＦＯ以及它们的类似物。…     

小鼠XBP1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及筛选

目的:构建小鼠XBP1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体,筛选具有较好干扰效率的小鼠XBP1 siRNA靶序列.方法:针对小鼠XBP1基因特异性序列,设计4个RNAi靶序列及1个阴性对照序列,合成含有正义和反义Oligo DNA的互补DNA序列,退火形成双链DNA,并克隆到经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,DNA测序鉴定.由病毒包装系统进行包装,经滴度测定后感染NIH3T3细胞,应用Real-time PCR鉴定干扰效率.结果:PCR鉴定与DNA测序证实合成的寡核苷酸链插入正确,293T细胞测定病毒滴度为1×108TU/ml.Real-timePCR证实XBP1-siRNA-3靶点的干扰效率最高,其干扰效率达到95%以上.结论:成功构建并筛选了小鼠XBP1基因RNAi慢病毒载体,为研究XBP1在巨噬细胞免疫功能调控中的作用奠定了基础.     

计算机辅助设计联合斑点杂交筛选铜绿假单胞菌PAO1 motA基因反义寡核苷酸序列

为了筛选出能与铜绿假单胞菌PAO1 motA基因的mRNA结合紧密的反义寡核苷酸序列,采用全基因寻靶技术（full length gene targeting,FLGT）,运用计算机软件（Mfold和RNA Structure4.6）模拟铜绿假单胞菌PAO1 motA基因mRNA的二级结构,根据最小自由能原理设计出8条寡核苷酸探针序列;PCR扩增出全长motA基因,克隆motA基因并进行体外转录,同时用地高辛标记mRNA,以斑点杂交方法筛选出与motA基因mRNA结合紧密、杂交信号较强的寡核苷酸序列。斑点杂交结果显示8条寡核苷酸中的4条有较强的杂交信号,从而成功筛选到了能与motA mRNA牢固结合的反义序列,为进一步研究以motA基因为靶的反义技术抑制生物膜形成打下基础。     

利用聚合酶链反应扩增基因片段

聚合酶链反应(PCR)是一种模拟天然DNA复制过程的核酸扩增法,具有敏感特异、产率高、操作简单、容易自动化等特点。由于它有成指数倍(2~n)扩增靶序列的能力,又被称之为“无细胞分子克隆”或“试管内分子克隆”。我们以化学合成的寡核苷酸的粗提物为引物,含目的基因片段的重组质粒DNA为模板,利用PCR技术成功地扩增出数百至3544bp的特异性     

三链DNA的形成抑制DNA结合蛋白与启动子的结合

电泳迁移分析方法及DNaseⅠ足迹实验表明21nt脱氧寡核苷酸G3TG2T GT2G5TG2TGT(CP1)与乙肝病毒(HBV)核心启动子(Cp)片段之间三链DNA的形成有较高的特异性及稳定性.凝胶滞留实验显示, 在大鼠肝细胞核提取物体外转录系统中, CP1可特异地抑制DNA结合蛋白与Cp片段的结合, 而不能与Cp结合形成三链DNA的脱氧寡核苷酸CP3(TGTG2TG5T2GTG2TG3)对蛋白与Cp的结合并无抑制作用.这些结果表明, 三链DNA的形成有可能抑制HBV DNA的转录.     

RecA蛋白介导的三链核酸结构形成及其序列提取

人工合成的单链DNA分子经PCR扩增形成双链DNA分子。将RecA蛋白与生物素标记的寡聚核酸探针序列在ATPγS存在的情况下共同哺育,使RecA蛋白包裹寡聚核酸探针,然后加入含同源序列的上述双链DNA分子经适当环境哺育形成了稳定的局部三链核酸结构。通过加入链亲和素包裹的磁珠吸附生物素化的探针,这样同源双链DNA分子与寡聚核酸探针形成的局部三链核酸结构也被吸附在磁珠上。使用磁分离装置提取这一结构,逐步降低盐离子浓度以洗脱双链DNA分子。将洗脱液中残留的蛋白质去除,经PCR扩增可获得目的DNA序列。同时使用同源探针和非同源探针在其它序列中提取目的DNA序列,结果显示目的DNA序列只被同源探针提取。实验结果显示了这一三链核酸结构形成的序列特异性,并且其稳定性随盐离子浓度降低而下降。提示在这一结构中同源的寡聚核酸单链与双链DNA分子形成了氢键结合,同时提示使用文中描述的方法可以提取特异的序列,用以克隆相应的基因。     

基因局部改组技术在ubiA基因突变中的应用

辅酶Q(coenzyme Q,CoQ)作为线粒体呼吸链中的递氢体具有较高的学术及应用价值.由ubiA基因编码的4-羟苯甲酸聚异戊二烯转移酶(UbiA)是大肠杆菌CoQ生物合成途径的限速步骤,但通过系统突变对其结构进行研究鲜有报道.[目的]应用化学合成的随机序列寡核苷酸,对ubiA基因编码活性区域的DNA序列进行随机突变...     

抑制启动子的三链DNA的结构模建及稳定性研究

在IRIS Indigo2(SGI公司)工作站上,利用InsightⅡ/MSI软件包,以TAT三链DNA为模板,采用同源模建的方法,分别建立起两个含21nt的脱氧寡核苷酸CP1(G3TG2TGT2G5TG2TGT)和CP3(TGTG2TG5T2GTG2TG3)的三维结构.采用分子力学方法进行能量优化,将得到的能量最低结构作为分子的优势构象.研究结果显示,CP1的能量低于CP3的能量,即前者的结构较后者稳定.从而证明了CP1与乙肝病毒（HBV）的核心启动子（Cp）片段之间能稳定地形成三链DNA,并能特异性地抑制DNA结合蛋白与Cp片段的结合.这些结果表明,三链DNA的形成有可能抑制DNA的转录.     

三螺旋结构寡核苷酸对特定基因抑制作用的研究进展

三股螺旋结构寡核苷酸９ＴＦＯ）能直接与目标双链ＤＮＡ连接,可阻止ＤＮＡ的延伸、抑制转录因子与基因连结,在ＤＮＡ水平干扰基因表达,ＴＦＯ可分为嘧啶型和嘌呤型两大类,其与目标基因双链形成的三聚体复合物的稳定性受多种理化因素的影响,序列的化学修饰以及“拉链”寡核苷酸和多聚赖氨酸衍生物的协同作用能明显增加ＴＦＯ与目标基因的连接及复合物的稳定,增强对目标基因的抑制作用。     

滚环复制技术的建立及在RNA病毒基因检测中的初步应用

滚环复制是噬菌体繁殖所采取的一种基因复制方式,这种方式可使单链的环形分子在聚合酶和引物的作用下进行体外自我扩增。本文中用可特异性连接环化的寡核苷酸链作为探针,分别进行了1份细胞培养的禽流感病毒H5N1亚型样品、1份细胞培养的SARS病毒样品和4份丙型肝炎病毒阳性血清样品的检测。检测原理是探针与靶序列杂交后便可在T4DNA连接酶的作用下形成滚环复制中的环化单链分子,该分子在同温下可被特异性引物滚动复制和支链扩增。本文还利用按禽流感病毒NA1基因区序列合成的模拟DNA分子对该检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示：利用固相RCA技术成功检测到三种RNA病毒的基因,该方法的灵敏度可达到能检测10^3拷贝模式DNA分子的水平。与传统的PCR方法敏感性的比较尚待进一步研究。     

克隆化反向杂交探针的制备

反向斑点杂交是将寡核苷酸探针固定在膜上,用标记的靶序列与固定在膜上的探针进行杂交．与正向杂交相比,它通过一次杂交即可确定多种基因型,是一种快速筛查DNA点突变的诊断方法.我们选择β－地中海贫血基因-28 (A→ G), CD17 (A→T) and CD41～42 (-TTCT) 三种点突变为模型采用PCR扩增产生串联多拷贝序列探针并将其克隆化．将克隆化探针固定于尼龙膜上,与同位素标记的β－珠蛋白基因PCR片段进行杂交,检测β－地贫患者的基因型．     

基于模板切换的mRNA5'末端全长扩增方法

本文介绍一种称为CapFinder的技术,可用于克隆基因mRNA序列的5'末端非翻译区全长。该技术是利用某些反转录酶在反转录达到mRNA的5'末端帽结构时表现出很高的加尾活性(主要添加dC)这一特点,在反转录体系中加入一种带GGG的寡核苷酸序列,当反转录反应到达mRNA模板的5'末端帽结构时,切换到以该寡核酸为模板继续进行反转录反应,即可合成完整的cDNA一链,且在其3'末端还带有一段额外的寡核苷酸序列。用GGG寡核苷酸序列为上游引物和基因特异性的下游引物进行PCR即可扩增得到mRNA5'末端非翻译区的全长。利用该技术克隆了棉铃虫幼虫中肠Bt毒素受体E-钙粘素基因的5'末端非翻译区序列。     

PCR技术在疾病诊断中的应用

多聚酶链反应(PCR)是近几年发展起来的先进的快速体外基因扩增技术,它是以待扩增的两条DNA(或RNA)链为模板,由一对人工合成的寡核苷酸引物介导,通过DNA聚合酶酶促反应,快速体外扩增特异DNA序列,并具有操作简便、快速、特异和灵敏的特点,已在很短的时间里迅速进入生命科学、医学研究、遗传工程、法医学、考古学、疾病诊断等各个领域,本文仅就在疾病诊断中的应用作一介绍。     

10-23型DNA酶作为鉴定mRNA靶点有效性的新工具

10-23DNA酶是能主动切割mRNA的一类反义寡核苷酸.利用10-23DNA酶的直接切割作用验证mRNA结构靶点的有效性.对筛选的绿色荧光蛋白(GFP)基因mRNA的4个靶点平行设计了4条反义寡核苷酸和4条10-23DNA酶,对照组反义寡核苷酸将最佳靶点——靶点2的反义寡核苷酸突变2个碱基,对照组10-23DNA酶将靶点2的10-23DNA酶结合臂中央突变2个碱基.体外4条10-23DNA酶切割mRNA的结果和相应的4条反义寡核苷酸依赖的RNaseH降解结果完全相似,细胞内4条10-23DNA酶对绿色荧光蛋白的表达抑制作用与相应的4条反义寡核苷酸相似,表明10-23DNA酶显示的最佳作用靶点同样是最佳作用效果的反义寡核苷酸结合靶.10-23DNA酶可以作为评价mRNA结构靶点有效性的新工具.     

三斑海马线粒体基因组核苷酸全序列结构与分析

通过PCR扩增并测序获得了三斑海马(Hippocampus trimaculatus)线粒体DNA(mt DNA)全序列。三斑海马线粒体基因组全序列长度为16 534 bp(Gen Bank登录号为KJ956892),编码37个基因,包括13个蛋白编码基因、22个t RNA基因和2个r RNA基因。非编码区域包括1个控制区(D-loop)及一个轻链复制起始区域。大部分基因由H-链编码,包括14个t RNA基因、2个r RNA基因、12个蛋白编码基因;只有ND6和8个t RNA基因是在L-链编码。预测的22个t RNA基因的二级结构均为典型的三叶草状。基因间隔一般1~14 bp不等。此外,还存在7处碱基重叠,其中,4处是鱼类和脊椎动物典型的基因重叠位点。总的碱基含量分别为,A 32.7%,C 23.4%,G 14.6%,T 29.3%,A+T含量为62.0%。其线粒体基因组序列的结构与脊椎动物的典型结构近似。邻接法和贝叶斯法构建的三斑海马系统进化树的拓扑结构相似,这与现有的三斑海马的系统演化地位一致。本研究为海马的进化研究以及保护工作提供了基础数据。