芜菁花叶病毒温州分离物HC-Pro基因序列分析

从浙江温州盘菜上获得芜菁花叶病毒温州分离物（TuMV-WZ）,病毒提纯后,经电镜观察,可发现大量长约700nm的线形粒子。利用免疫捕捉RT-PCR,通过特异性引物对TuMV-WZ的HC-Pro基因进行PCR扩增,经电泳可见1.5kb的特异条带。PCR扩增产物经过纯化后进行序列测定,序列长度为1449个核苷酸,编码482个氨基酸。其核苷酸序列与已报道的TuMV的基础分离物（Canada,UK1和Japanese）同源率分别为83.9%、96.5%和94.0%,氨基酸同源率分别为97.3%、98.8%和99.0%。     

黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ和Ⅱ分离物外壳蛋白基因的序列分析与比较

对我国分离的经生物学和血清学鉴定为黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）亚组Ⅰ和Ⅱ的各一分离物（ＧＢ、ＸＢ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因进行了序列分析和比较。以提纯病毒ＲＮＡ为模板,进行逆转录及ＰＣＲ扩增,并通过常规基因克隆方法得到插入ＣＰ基因片段的重组克隆。对插入ＧＢ和ＸＢ两个分离物ＣＰ基因片段的重组克隆进行全序列测定,结果表明重组克隆序列长分别为７７７ｂｐ和７９２ｂｐ,均只含一个开放读框（ＯＲＦ）,长度为６５７ｎｔ,可编码２１８个氨基酸;两个分离物的ＣＰ基因核苷酸序列同源率为７７５％,氨基酸序列同源率为８２６％。与我国已报道的７个ＣＭＶ分离物的ＣＰ基因序列比较,分离物ＧＢ的同源率为９１３％～９７３％,分离物ＸＢ的同源率为７６６％～７８４％。与国际上已报道部分ＣＭＶ株系的ＣＰ基因序列相比较,分离物ＧＢ与亚组Ⅰ株系有更密切的亲缘关系,而分离物ＸＢ则与亚组Ⅱ株系的亲缘关系更密切。     

人乙型肝炎病毒前表面抗原preS基因的克隆与序列分析

从杭州、兰州两地各一例乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原阳性血清中提取病毒DNA,采取PCR技术扩增出前表面抗原（preS)基因片段,重组到质粒载体上,对该基因进行了全序列测定[GenBank索取号CpreS-HZ:AF 325674;preS-LZ:325675].克隆的HBVpreS基因杭州分离物（preS－HZ）和兰州分离物（preS－LZ）全长522个核苷酸,编码174个氨基酸。preS－HZ与已发表的HBV adr亚型上海分离物、北京分离物、日本分离物、HBVadw亚型和ayw亚型preS基因的核苷酸序列同源性分别为96．7％、96．2％、97．3％、88．7％和84．1％,氨基酸序列同源性分别为96．0％、94．9％、97．1％、85．1％和85．4％;preS－LZ与相应序列的核苷酸序列同源性分别为96．4％、96．2％、96．9％、88．7％、83．7％,氨基酸序列同源性分别为94．9％、94．9％、96．0％、85．1％、84．1％,分子进化分析（ADNASTAR,1999）表明,相对于以上报道的序列二者含有四个特异的氨基酸突变位点,在免疫保护区内二者具有较好的保守性,可用于表达乙肝重组亚单位疫苗。     

香蕉束顶病毒NS株DNA组分5的克隆和序列分析

本文利用PCR技术扩增得到香蕉束顶病毒(BBTV)NS株DNA组分5的全基因,该基因全长为1014nt,具有一个开放阅读框,编码146个氨基酸,蛋白质二级结构包括6个α螺旋,7个β折叠。NS株系与南太平洋组澳大利亚、夏威夷、埃及分离物DNA组分5核苷酸和编码的氨基酸序列相比较,核苷酸序列同源率介于88%～89%之间,氨基酸序列同源率介于80%～88%之间。NS株系与其它分离物在编码成视网膜细胞瘤蛋白(Retinoblastomaprotein,Rb)的基元序列“LXCDE”附近的二级结构上表现明显的差异,推测这种差异可能影响与植物中Rb蛋白的结合效率。     

香蕉束顶病毒NS株DNA组分5的克隆和序列分析

本文利用PCR技术扩增得到香蕉束顶病毒(BBTV)NS株DNA组分5的全基因,该基因全长为1014nt,具有一个开放阅读框,编码146个氨基酸,蛋白质二级结构包括6个α-螺旋,7个β-折叠.NS株系与南太平洋组澳大利亚、夏威夷、埃及分离物DNA组分5核苷酸和编码的氨基酸序列相比较,核苷酸序列同源率介于88%～89%之间,氨基酸序列同源率介于80%～88%之间.NS株系与其它分离物在编码成视网膜细胞瘤蛋白(Retinoblastoma protein,Rb)的基元序列"LXCDE"附近的二级结构上表现明显的差异,推测这种差异可能影响与植物中Rb蛋白的结合效率.     

番茄花叶病毒外壳蛋白基因及3′端非编码区的克隆、序列分析及其表达

根据已报道的番茄花叶病毒Ｌ株系（ＴｏＭＶＬ）序列人工合成引物,经ＲＴＰＣＲ扩增并克隆了我国番茄花叶病毒分离物（ＴｏＭＶＳ１）的外壳蛋白ＣＰ基因及３′端非编码区。序列测定结果表明,所得ｃＤＮＡ共长６８２个核苷酸,其中ＣＰ基因含４８０个核苷酸,编码１５８个氨基酸,３′端非编码区含２０２个核苷酸,其核苷酸序列与ＴｏＭＶＬ株系具有９９．５％的同源率。将该基因片段克隆到ｐＧＥＭＥＸ１载体中,转入Ｅ．ｃｏｌｉ后诱导表达,经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测证明,该基因已在大肠杆菌中正确表达。这是我国首次报道ＴｏＭＶＣＰ基因序列。     

番茄花叶病毒外壳蛋白基因及3‘端非编码区的克隆,序列分析及其表达

根据已报道的番茄花叶病毒Ｌ株系序列人工合成引物,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增并克隆了我国番茄花叶病毒分离物的外壳蛋白ＣＰ基因及３‘端非编码我。序列测量结果表明,所得ｃＤＮＡ共长６８２个核苷酸,其中ＣＰ基因含４８０个核苷酸,编码１５８个氨基酸,３’端非编码区含２０２个核苷酸,其核苷酸序列与ＴｏＭＶ－Ｌ株系具有９９．５％的同源率。     

水稻矮缩病毒最外层外壳蛋白基因（S2）cDNA克隆,序列分析及其在大？…

从水稻矮缩病毒（Ｒｉｃｅｄｗａｒｆｖｉｒｕｓ,ＲＤＶ）中国福建分离物中克隆分离了最外层外壳蛋白基因（Ｓ２）全长ｃＤＮＡ并对其进行序列分析,结果表明ＲＤＶＳ２ｃＤＮＡ全长３５１２ｂｐ,仅含一个３３４８ｂｐ的阅读框架,编码一人含有１１１６个氨基酸的蛋白（Ｐ２）。与基因库中已知基因序列比较,发现它与日本ＲＤＶＨ株系相应片段的核苷酸和氨基酸同源率分别为９４．６％和９５．４％与轮状病毒ＶＰ２氨基酸序列有一定     

两个猪瘟病毒野毒株gp55基因抗原编码区序列的分析及比较

利用反转录－PCR方法扩增了吉林省猪瘟病毒（HCV）两个野毒株gp55基因的主要保护性抗原编码区,并将其克隆到pGEM－T载体中,然后用Sanger双脱氧法测定了其核苷酸序列,并推导了其氨基酸序列。将测定的这两个HCV野毒株的部分序列（350bp）与国内外已知的HCV序列进行比较,结果表明：这两个野毒株的核苷酸序列的同源性为94．9％,氨基酸序列同源性为97．4％,与1985～1992年意大利中部分离4个野毒株的同源性明显高于其它HCV毒株,核苷酸同源性分别为97．2％～98．3％和94.0％～949％,氨基酸同源性分别为98．3％～991％和97.4％～98.3％,而与我国的HCV标准强毒株即石门株的核苷酸同源性仅分别为83.1％和83.1％,氨基酸同源性仅分别为90.6％和91.4％。因此认为吉林省这两个野毒株与意大利中部的4个野毒株具有密切的关系,而与石门株很可能来源不同。     

水稻条叶枯病毒(RStV)基因组组分4的克隆与序列分析

利用RTPCR技术合成并扩增了水稻条叶枯病毒(RStV)中国云南分离物基因组组分4的全长cDNA,将PCR产物克隆在载体pCRII上,并进行全序列测定,所得核苷酸序列及推测的氨基酸序列与日本分离物T进行比较。结果表明,在核苷酸水平,两分离物的vORF、vcORF及基因间非编码区序列的同源性分别为94.9%、94.1%、86.1%,5’端非编码区序列相同,而3’非编码区同源性为96.1%,仅有两个核苷酸不同;在氨基酸水平,vORF及vcORF编码蛋白的同源性分别为99.4%和98.3%。可见,编码区的大小及其氨基酸序列和两末端序列都是很保守的。因此,中国云南分离物Y与日本分离物T可能有很近的亲缘关系。     

甜菜坏死黄脉病毒RNA4 cDNA克隆、序列分析及其编码蛋白基因在大肠杆菌中的表达

以甜菜坏死黄脉病毒(Beet Necrotic Yellow Vein Virus,简称BNYVV)内蒙分离物(NM)RNA为模板,通过反转录和PCR扩增得到了BNYVV RNA4基因组的cDNA克隆pGBF6。序列分析结果表明,pGBF6含有全长RNA4 cDNA插入片段,大小为1465个核苷酸,含有一个849个核苷酸的开放阅读框架,编码产生由282个氨基酸组成的分子量为31kDa的蛋白。与法国F2分离物RNA4相比,其核苷酸序列和由此推导的氨基酸序列同源性分别为97.1％和96.4％,并在5'端非编码区比F2分离物缺失了3个核苷酸。将RNA4编码区cDNA克隆到原核表达载体pFLAG·MAC上,获得融合蛋白表达质粒pFMBF87。所构建的融合蛋白由载体序列编码的14个氨基酸和31kDa蛋白C端的233个氨基酸组成。经IPTG诱导,Westem blotting分析表明,该融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达。本文还对内蒙分离物的株系划分进行了讨论。     

侵染万寿菊的黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与序列分析

应用ELISA的方法检测到感染了黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的万寿菊。根据已报道的CMV外壳蛋白(CP)基因的保守序列设计并合成引物,提取万寿菊叶片总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增,得到约875bp的片断,与预期片断大小相符。序列分析显示:该分离物CMV-WSJ CP基因全长657bp,编码218个氨基酸,其核苷酸和氨基酸序列与CMV亚组Ⅱ的分离物有很高的同源率,分别达到98.33%～99.24%和98.63%～100%;与CMV亚组I分离物的同源率分别仅为74.43%～76.26%和77.17%～78.99%。因此,从万寿菊叶片上检测出的黄瓜花叶病毒分离物CMV-WSJ应归属于亚组Ⅱ。     

番木瓜环斑病毒畸叶株系的CP基因克隆和序列分析

采用RT－PCR方法合成了本研究室保存的番木瓜畸叶病毒（PMaLV）的外壳蛋白（CP）基因,将其CP基因克隆进Promega公司的pGEM-T and pGEM-T Easy Vector System（简称T－载体）,并进行了序列分析。结果表明,PMaLV CP基因核苷酸序列全长为861nt,推导其编码287个氨基酸。与番木瓜环斑病毒（PRSV）美国夏威HA株系和澳大利亚W株系的CP基因相比,在第66nt处开始连续缺失3个核苷酸。与PRSV的华南Ys、Sm和G株系以及夏威夷的HA和澳大利亚的W株系相比,其CP基因序列同源率分别为96％、98％、95％、89％和89％。其的氨基酸序列同源率分别为98％、97％、97％、96％和95％。此结果表明,PMaLV属于PRSV的一个株系,不是一种新病毒。因此,我们称其为番木瓜环斑病毒畸叶株系（ML株系）。     

广东地区两种兰花病毒病害的分子鉴定及检测

根据已报道的建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)基因组核苷酸序列,在其cp基因上下游设计PCR引物。CyMV预计扩增产物784bp,ORSV预计扩增产物604bp。以采集自广东省顺德的墨兰和文心兰表现病毒病症状的病株叶组织总RNA为模板,进行RT—PCR扩增。对预期大小的5个扩增产物进行克隆和测序,结果表明,来源于不同兰种或同一兰种不同兰场的病样CyMV引物扩增产物核苷酸序列存在少量差异,但均与世界各地的CyMV分离物cp基因高度同源;而来源于不同兰种的病样ORSV引物扩增产物核苷酸序列完全相同,与世界各地的ORSV分离物cp基因高度同源。因此可将侵染广东兰花的两种病毒鉴定为CyMV和ORSV。混合上述两种病毒的PCR引物,采用双重RT—PCR扩增,对采自广东顺德23个兰场共153份样品进行病毒检测,76份(49．7％)检出CyMV,52份(34．0％)检出ORSV,2份(1．3％)同时检出CyMV和ORSV。     

水稻条纹病毒两个分离物RNA4基因间隔区的序列比较

通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增了我国水稻秫纹病毒（ＲＳＶ）山东济宁（ＪＮ）、云南宜良（ＹＬ）两个分离物ＲＮＡ４基因间隔区（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｒｅｇｉｏｎ,ＩＲ）序列,并克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ载体上。序列分析结果表明：ＪＮ、ＹＬ两分离物ＲＮＡ４ ＩＲ均由６５４个核苷酸组成,两者之间的同源率为９２％。ＪＮ、ＹＬ两个分离物ＲＮＡ４ ＩＲ在ＡＵ碱基富集处可形成上明显的结构,其中一个序列比较保守,形成的发夹     

枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆及其序列分析

根据Lampel报道的葡萄糖脱氢酶基因序列设计合成两条引物,以野生型枯草芽孢杆菌染色体DNA为模板,PCR扩增得到含有葡萄糖脱氢酶基因的大约780bp的DNA片段,将其克隆到pUC-T载体中。序列分析表明,克隆得到的葡萄糖脱氢酶基因含有783bp,编码261个氨基酸的蛋白质。得到的基因序列与文献报道的进行比较,其核苷酸同源率为75．5％,编码氨基酸序列的同源率为83．9％。     

水稻条叶枯病毒基因组组分3的克隆与序列分析

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术,合成并扩增了水稻条叶枯病毒（ＲＳｔＶ）中国云南分离 物基因组组分３的全长ｃＤＮＡ。将ＰＣＲ产物克隆在载体ｐＣＲⅡ上,进行全序列测定。将所得核苷酸序列及其所推导的氨基酸序列与日本分离物Ｔ进行同源性比较,结果表明,在核苷酸水平上,两分离物的５’端非编码区序列相同,ｖＯＲＦ、ｖｃＯＲＦ及基因间非编码区序列的同源性分别为９７．６％、９６．８％及８７．６％,而３’端非编码区同源性为９８     

马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因的合成,分子克隆和全序列分析

以分离自马铃薯主栽品种“紫花白”的马铃薯卷叶病毒(PLRV)分离物的RNA为模板,用人工合成的引物,用反转录和随后PCR扩增的方法合成了PLRV外壳蛋白(CP)基因的cDNA,并克隆于pUC19中。进一步用限制酶切和核苷酸序列分析表明,合成的cDNA由627个核苷酸组成(包括起始和终止密码),序列中有Hinc Ⅱ和BamH Ⅰ两个酶切位点,与国外报道一致。和国外的4个PLRV分离物CP基因序列对比结果,具有高度同源性,其同源率达99.0—99.7％。     

我国肾综合出血热疫苗生产株LR1株的基因组序列分析

为测定我国肾综合征出血热疫苗生产株LR1株的全基因组序列,了解该株分子基础,从提纯的细胞总RNA逆转录PCR扩增,产物纯化后克隆T载体纯化后测序,结果证明,LR1株全基因组序列由L6533、M3616、S片段的1692个核苷酸组成,依各自读码框架分别编码21511、1135、429个氨基酸。序列同源比较分析表明,LR1毒株与国外HTN型毒株高度同源,属同一亚型,尤其与HTN代表株75－1183个片段同源率高达99．3％－99．8％,而与国内的HTN型病毒差异较大,同源率仅为79．4％－84．6％。氨基酸比较也显示了同样的结果。