金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的克隆

利用PCR方法从金葡菌基因组DNA中扩增出约 80 0bp的DNA片段 ,将之克隆到pUC19 T载体上并转化E .coliDH5α菌株。重组质粒的测序结果表明 ,克隆到了sea基因 ,它含有 774bp的阅读框架 (包括N端 72bp的信号肽编码区 ) ,其核苷酸序列与文献报道完全一致。     

糖化酶、木聚糖酶融合蛋白在毕赤酵母中的高效表达

通过RT-PCR方法,以埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)总RNA为模板,克隆出糖化酶(glucoamylase,amyA)基因的成熟肽编码序列(1 857 bp),编码618个氨基酸;以类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)H10-3基因组DNA为模板,克隆出木聚糖酶(xylanaseA,xynA)基因的成熟肽编码序列(636 bp),编码211个氨基酸.通过重叠延伸PCR( SOE-PCR)得到拼接片段amyA-l-xynA,并将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,得到重组质粒pPIC9-amyA-l-xynA,重组质粒线性化后经电击转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,得到了表达成功的工程菌ALX2.在ALX2发酵上清液中同时检测到糖化酶活性(10.7 U/mL)和木聚糖酶活性( 51.8 U/mL).     

大黄鱼肝表达抗菌肽2基因的克隆和原核表达

抗菌肽是在多种细胞中表达具有抗菌活性的肽类物质的总称,在免疫反应中发挥着非常重要的作用.通过同源克隆法克隆到大黄鱼肝脏表达的抗菌肽2(liver-expressed antimicrobial peptide-2,LEAP-2)基因的完整开放阅读框(Opening Reading Frame,ORF).克隆到的大黄鱼LEAP-2全长2236 bp,包含外显子Ⅰ78 bp,内含子Ⅰ880 bp,外显子Ⅱ179 bp,内含子Ⅱ1044 bp,外显子Ⅲ55 bp,编码序列312 bp,编码103个氨基酸.推断的氨基酸序列羧基端区域存在高度保守的4 个半胱氨酸残基,符合LEAP-2超家族的结构特征.同源性对比后显示LEAP-2基因在进化上高度保守,大黄鱼LEAP-2推断的氨基酸序列与牙鲆、黄颡鱼、蓝色鲶鱼和斑点叉尾鮰等鱼类之间的同源性均在95%以上.将大黄鱼LEAP-2 cDNA连接到pET-32a(+),构建了重组表达质粒pET-32a-LEAP-2,将其转化到大肠杆菌BL21上并用1.0 mmol/L IPTG诱导表达,获得了大小约为27 kDa的重组蛋白,与预期的一致.     

轮状病毒VP7基因的克隆及其植物表达载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了轮状病毒VP7基因,并将其克隆到pMD18-Tvectr载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了DNA全序列.结果表明,克隆片段全长为981 bp.将轮状病毒VP7基因定向的克隆到植物表达载体pBI121启动子下游,构建了植物表达载体.     

盐单胞菌属BYS1四氢嘧啶合成基因ectABC克隆及其盐激表达

利用SEFA-PCR技术从中度嗜盐菌Halomonassp.BYS-1总DNA中克隆了四氢嘧啶合成基因ectABC及其上游序列(GenBank accession number DQ017757);OMIGA软件分析结果显示ectA、ectB、ectC位于同一个操纵子上,大小分别为573bp1、251bp和387bp,预测编码的DAT(L-二氨基丁酸转氨酶)、DAA(L-二氨基丁酸乙酰转移酶)和ES(四氢嘧啶合酶)大小分别为21.1kDa(191 amino acid)、45.7kDa(417 amino acid)和14.5kDa(129 amino acid);将包含ectABC基因及其上游1000bp序列的片段克隆到pUC19中并转化E.coliDH5α,转化子E.coli(pUC19ECT)能够在盐激条件下合成四氢嘧啶,但其耐盐能力没有得到显著改善。     

簇毛麦端体6VS的显微切割及其专化DNA序列的克隆和分析

从簇毛麦(Haynaldia villosa (L.) Schur.)组合CA9211/RW15(6D/6V异代换系)幼胚培养SC2后代中,用原位杂交方法鉴定出T240-6为6VS端体异代换系. 以此为材料,采用微细玻璃针切割法及"单管反应"技术体系,对6VS进行切割分离及LA (Linker adaptor)-PCR扩增.扩增带在100～3 000 bp 之间,大部分集中在600～1 500 bp.利用32P标记的簇毛麦基因组为探针进行Southern杂交,证实扩增产物来源于簇毛麦.扩增产物纯化后,连接到pGEM-T载体上,构建了6VS DNA质粒文库.对文库的分析表明,文库大约有17 000个白色克隆;插入片段分布在100～1 500 bp,平均600 bp.点杂交结果表明,37%克隆有中度到强烈的杂交信号,证明含有中度或高度重复序列;63%克隆有较弱的信号或没有信号,证明为单/低拷贝序列克隆.从文库中获得8个簇毛麦特异克隆,对其中两个克隆pHVMK22和 pHVMK134进行了RFLP分析和序列分析,并利用该探针对小麦抗白粉病基因Pm21进行了检测.RFLP 结果表明,两个克隆一个为低拷贝序列克隆(pHVMK22),另一个为高度重复序列克隆,均为簇毛麦专化DNA序列.以pHVMK22为探针对抗、感病小麦(Triticum aestivum L.)品系的Southern杂交发现抗病品系有一条2 kb的特征带, 该探针可能作为检测抗病基因Pm21的探针.     

马铃薯GBSS基因的克隆与DNA顺序分析

构建了中国马铃薯 (Solanum tuberosum)栽培品种“东农 30 3”基因文库 ,用 PCR扩增得到淀粉粒结合淀粉合成酶基因 (GBSS,granule- bound starch synthase)的部分顺序 (GB3) ,以此为探针从基因文库中筛选到 2 0个阳性克隆。测定其中 1个克隆 (GBSS1 7- 1 )的 DNA顺序共 542 8bp;它包括 GBSS基因 5′侧翼区 1 82 3 bp、结构基因 2 964 bp和 3′侧翼区 641 bp。该顺序与已报道的 GBSS顺序同源性很高 ,但 5′侧翼区最上游 730 bp尚未见文献报道 ;并存在较多的茎环结构。     

苦荞查尔酮合酶基因CHS的结构及花期不同组织表达量分析

采用同源克隆、染色体步移和RT-PCR技术,首次克隆到苦荞查尔酮合酶基因(CHS)的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列.序列分析表明,苦荞CHS DNA序列(GU172165)全长1 632 bp,含1个445 bp的内含子;cDNA编码区(HM852753)全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FtCHS.生物信息学分析表明,FtCHS和推导的氨基酸序列与其它植物CHS基因同源率在95%以上,含有CHS多基因家族的标签序列(GFGPG)、活性位点、底物结合口袋位点和环化反应口袋位点.半定量RT-PCR分析苦荞花期FtCHS空间表达模型表明,其表达量未成熟种子叶茎花根成熟种子,与苦荞芦丁含量的分布基本一致,具有组织特异性。     

无乳链球菌诱导吉富罗非鱼分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的克隆及原核表达

以灭活的无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)诱导后的吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)为材料,构建其头肾SMART cDNA文库,应用同源性克隆和RACE-PCR技术克隆到吉富罗非鱼(O.niloticus)分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析。sIgM基因cDNA全长为1 921 bp,开放阅读框(ORF)为1 740 bp,5'端非编码区(5'-UTR)41 bp,3'端非编码区(3'-UTR)140 bp,编码579个氨基酸,N端有信号肽结构。预测分子量(MW)为64.26 kD,理论等电点(pI)为5.36。系统进化树分析显示,吉富罗非鱼(O.niloticus)sIgM与牙鲆(Paralichthys olivaceus)和军曹鱼(Rachycentron canadum)的亲缘关系较近。sIgM基因有4个恒定区。将吉富罗非鱼(O.niloticus)sIgM基因恒定区序列克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET28-sIgM,诱导表达后确定最优条件为37℃条件下,IPTG浓度为0.05 mmol/L时诱导4 h蛋白表达量最大。纯化蛋白后经Western blot分析,sIgM融合蛋白与鼠抗His-Tag发生特异结合,表明目的蛋白成功表达。     

中国牛朊病毒基因的克隆和序列分析

从中国牛外周血中分离淋巴细胞,提取基因组DNA.用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出不致病的朊病毒蛋白(PrP~c)基因,并克隆到pGEM-Teasy Vector.序列分析表明所克隆的牛PrP~c的片段大小为795bp,包含了牛朊病毒基因的完整编码区序列.该基因无内含子,同国外报道的已知序列完全相同.     

粘质沙雷氏菌几丁质酶chiB基因的克隆与序列分析

采用改进的方法提取粘质沙雷氏菌基因组DNA,通过PCR扩增,得到大小为1 500 bp特异性DNA片段(chiB基因),以pUC18质粒构建了pUC-ch iB克隆载体,转化至感受态细胞E.coliDH5α培养,并筛选出重组质粒。经测序分析,证明克隆片段与文献报道相一致。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因的克隆和在大肠杆菌中高效表达

利用PCR方法从金黄色葡萄球菌TSTw基因组DNA中扩增出约700bp的DNA片段,将之克隆到pGEM7Zf(+)载体上并转化大肠杆菌 DH5α菌株。重组质粒的测序结果表明克隆到了seb基因,它含有717bp（不包括N端81bp的信号肽编码区）,其核苷酸序列与文献报道完全一致。将其连接于表达载体7ZTS上,转化到大肠杆菌JM109（DE3）内。表达的SEB占总蛋白33.5%。      

金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药辅助基因femB的克隆和原核表达

金黄色葡萄球菌femB基因与甲氧西林高水平耐药密切相关,可能成为开发抗MRSA药物的新靶位.以金葡菌基因组DNA为模板,PCR扩增femB全长基因,所得片段与pGM-T载体连接并转化感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆以PCR、双酶切及测序鉴定.将鉴定正确的目的片段定向克隆到pGEX-4T-1表达载体中,转化至大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达GST/FemB融合蛋白;采用SDS-PAGE及Western blot对融合蛋白进行鉴定.结果显示,重组质粒在宿主菌中获得了高效表达,融合蛋白相对分子质量为75 kD,该融合蛋白可与抗GST-tag抗体特异结合;表明femB基因的原核表达系统构建成功,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

鼠伤寒沙门氏菌Ⅰ相鞭毛蛋白基因fliC~I的克隆和鉴定

以提纯的鼠伤寒沙门氏菌8705染色体DNA为材料,经EcoR Ⅰ消化,过SepharcylS-400柱,得到大于400bp的酶切片段;然后随机克隆到质粒pGEM-3Zf(—)中,转化大肠杆菌LC2a(hag~-,recA~-);在氨苄青霉素平板上共得到6013个转化子,从中筛选出1个有动力的克隆,小量制备质粒DNA,经酶切电泳鉴定,该克隆的外源片段大小为15.3kb,将其命名为pGI4015。动力、动力抑制试验和Southern blot分子杂交试验证明pGI4015中载有鼠伤寒沙门氏菌Ⅰ相鞭毛蛋白基因fliC~I;利用其BamH Ⅰ和Sal Ⅰ位点删除与鞭毛蛋白表达无关的序列,构建亚克隆质粒pGI4015BS,使得fliC~I定位于更小的区域——3.8kb的BamH Ⅰ/Sal Ⅰ插入片段上。     

glyA基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据已知的序列设计引物,以大肠杆菌XL10-Gold总DNA为模板进行梯度PCR,并进行DNA序列测定,其序列与已经报道的glyA基因完全一致。将其克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905C上,获得表达质粒pHBM1001.该质粒转化毕赤酵母GS115所得重组子经PCR验证后成功进行了诱导表达,并初步测定了酶活力。     

Cloning of the type VII trimethoprim-resistant dihydrofolate reductase gene and identification of a specific DNA probe

Abstract A 1.3 kb Hin III fragment encoding the type VII trimethoprim-resistant dihydrofolate reductase gene was cloned into pBR322. Unidirectional deletion of this cloned fragment with exonuclease III identified the start of the dihydrofolate reductase gene. An internal 300bp Eco RV fragment was identified which could be used as a specific non-radioactive DNA probe to distinguish bacteria carrying the type VII gene from those carrying genes encoding other known dihydrofolate reductase types.     

人成骨蛋白成熟肽基因在毕赤酵母中的克隆及其序列分析

采用PCR方法,根据献报道的人成骨蛋白-1（OP-1）成熟肽基因序列,设计并合一对引物,从含人成骨蛋白基因的质粒中扩增获得大小的420bp的DNA片段,连接到pGEM-T载体进行测序,证明获得人成骨蛋白成熟肽基因片段,继之以pPIC3.5k为表达载体构建重组表达质粒,并经PCR及酶切鉴定。     

苜蓿尺蠖核多角体病毒(AcNPV)DNA的提纯及多角体蛋白基因片段的克隆

本文报道了从被AcNPV感染的大蜡螟中提纯到AcNPV DNA,以质粒pBR325作为载体,从AcNPV基因组DNA EeoRI片段克隆中得到含AcNPV多角体蛋白基因片段的重组质粒。经原位杂交,酶切鉴定,DNA顺序分析,并与Hooft Van Iddekinge等人测定的结果比较,证明筛选到的7.3kb EcoRI片段包含了AcNPV多角体蛋白结构基因及其启动基因。核多角体病毒多角体蛋白启动基因是迄今为止在真核细胞中所发现的最强启动基因之一,是理想的表达外源基因的启动子。     

A型肉毒毒素轻链基因的克隆及其结构分析

以献报道的A型肉毒毒素基因全序列为标准,设计并合成一对引物,自肉毒梭菌基因组中扩增出肉毒毒素轻链基因片段,并将扩增产物与pGEM—T载体在体外连接,构建测序重组质粒,进行测序和基因结构分析。PCR扩增获得了产物为1 364bp的DNA片段,测序结果与DNA数据库对照检索分析证明,此基因片段与GenBank中的A型肉毒毒素LC基因的一致性达99．9％以上,可以认为克隆的基因为A型肉毒毒素LC基因。     

禽白血病病毒p19基因末端片段在大肠杆菌中的表达

根据禽白血病病毒（ALV）p19基因末端序列合成一条82bp的双链DNA片段,将其克隆到表达质粒pGE-MEX-1中,序列分析结果与设计的相符。重组表达质粒转化的大肠杆菌BL21（ＤＥ３）经ＩＰＴＧ诱导后产生３４kD融合表达产物,与理论值相符;Western-blot分析表明该表达产物能与兔抗ＡＬＶ血清发生反应。