蕲蛇蛇毒中一种新型自降解抗凝血酶AA-ACA-I的纯化和表征

利用嗜硫色谱和POROS HQ20离子交换色谱从蕲蛇蛇毒中纯化得到一种新型P-Ⅲ型蛇毒金属蛋白酶（snake venom metalloproteases SVMP) AA-ACA-I.该酶经SDS-PAGE测得分子量为 47.6 kD,含有链内二硫键,加DTT处理后,分子量为50.8 kD,中性糖含量为3.5%,具有出血毒性和抗凝血活性.在70℃和pH 9.0条件下保温60 min,该酶会自降解成分子量30 kD左右的新蛋白,降解得到的新蛋白抗凝血活性高于原蛋白     

嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var. levisporus内切β-葡聚糖酶的分离纯化及特性研究

采用培养分离、室内测定等方法,对嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var. levisporus产生的内切β-葡聚糖酶进行了分离纯化及特性研究.粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的内切β-葡聚糖酶.结果表明,经12% SDS-PAGE测得酶的单亚基分子量约为31.5 kD,凝胶过滤层析测得酶的分子量约为34.5 kD.该酶反应的最适温度为55 ℃,最适pＨ为2.5～3.0该酶在pH3.0条件下60 ℃较为稳定;80 ℃保温30 min有20%原酶活性.金属离子对内切β-葡聚糖酶活性影响较大, 其中K⁺、 Ca²⁺、Mn²⁺对酶有激活作用;Al⁺、Cu²⁺ 、Al³⁺对酶有显著抑制作用.该酶对羧甲基纤维素具有很强的底物特异性.     

蕲蛇蛇毒中一种新型金属蛋白酶AA-MP-I的纯化和表征

本研究通过嗜硫色谱、Sephadex G-75、蓝胶和POROS HQ20离子交换色谱,从蕲蛇蛇毒中分离得到一种新组分AA-MP-I。该酶为分子量22.9kDa的单体蛋白,等电点为5.55,不含中性糖基,N端序列为STE-FQRYMEIVIVVDHSMVK,结果表明其为新型P-I型金属蛋白酶,对温度敏感,具有抗凝血活性,40℃下抗凝血活性最强,具有出血毒性,无磷脂酶A2活性。     

高产菊粉酶酵母筛选、发酵和酶学性质研究

筛选到1株菊粉酶高产克鲁维酵母菌株,采用酵母高密度细胞发酵方法,最高菊粉酶产量达到288.78u/mL,比80～90年代国际上报道的克鲁维酵母菊粉酶最高产量高6.8倍。该酶的菊粉酶/转化酶活性比为1/24.72;菊糖m=13.3mmol/L,蔗糖Km=62.6mmol/L;最适反应pH值为4.4,但在pH3.8～5.6的范围内均保持了较高的活性,相当于最适pH值下活性的90%;最适反应温度为55℃,在50～575℃范围内能够保持较高活性,50℃下酶的半衰期约为16h;外加Mg2+提高酶活性11.28%。     

大麦种子萌发过程核酸分解酶的研究

大麦种子萌发后,幼苗中存在着丰富的磷酸酯酶,主要五种磷酸酯酶在幼根中活性最高,其次是胚乳(RNase,DNase,PDase)或幼芽(PMase,5′-NDase)未萌发种子五种酶活性均低。五种磷酸酯酶在种子萌发过程中的消长表现了明显的规律性,幼芽五种酶的活性峰出现在种子萌发后第二天,胚乳在5～6天,幼根的RNase,DNase,PMase消长规律类似胚乳,PDase和5′-NDase类似幼芽。说明大麦磷酸酯酶的活性和种子萌发过程有一定的相关性。大麦幼苗五种磷酸酯酶都有很高的最适反应温度,一般在50～70℃之间,反应温度低于20℃活性急剧下降,低于10℃活性趋于零。五种磷酸酯酶的最适pH都偏酸性,一般在pH 5～6,但PDase和DNase除在酸性区有一最适pH外,在碱性区也各有一最适pH,推测大麦幼苗RNase,PMase,5′-NDase均只有一种酸性的酶,而PDase和DNase各有一种酸性酶和碱性酶。     

五带虻溶纤活性蛋白的纯化和性质

五带虻Tabanus qutnquectnctus Rlcardo腹部匀浆液经硫酸铵沉淀、Sephadex G-75凝胶层析、Fibrin-Sepharose 4B亲和层析和电泳制备等方法纯化后,获得在SDS—PAGE图谱上呈现单一区带的溶纤活性蛋白。该蛋白质既具有纤溶酶作用,又具有激活纤溶酶原的作用,其分子量为40kD,等电点为4.5,最适作用pH为9.0,最适作用温度为28℃,37℃处理2h活性完全丧失,Ca²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Hg²⁺和PMSF能抑制其活性。     

星天牛幼虫肠道木聚糖酶的纯化和性质

星天牛Anoplophora chinensis (Frster)幼虫肠道匀浆液经80%丙酮沉淀、Q-Sepharose阴离子交换柱层析、PAGE制备电泳等方法纯化后,获得在SDS-PAGE上呈现单一区带的木聚糖酶。该酶的分子量约25 kD,等电点约4.0,最适温度50℃,最适pH 5.4,pH 3.0～7.8对酶活性的恢复无大的影响, 50℃保温2 h仍有60%酶活性。Hg²⁺、M_nO^-4、变性剂SDS完全抑制该酶活性, Cu²⁺、Mn²⁺、Ag⁺、Zn²⁺、Pb⁺、脲对酶活性有强烈的抑制作用。该酶具有水解纤维素的交叉活性,其K_m值为2.47 mg/mL,V_max为0.6 IU/mL。     

小麦叶片磷酸酯酶生化特性的研究

采用分光光度法对小麦叶片磷酸酯酶的生化动力学特性进行了研究.实验结果表明:叶片磷酸酯酶水解pNPP的Km值为6.554 mm o l/L,Vm ax为0.774×103U/(m g prote in).该酶的最适pH为6.8,保温10 m in的最适温度为45℃,在50、60、70℃保温时,该酶活力丧失50%所需的时间分别为12、3.75和1.8 m in.不同的金属离子及络合剂对该酶活力有影响,M g2 和C a2 对该酶有激活作用,Zn2 、Cu2 和M n2 对酶活力则有不同程度的抑制作用.EDTA、磷酸氢二钠和偏钒酸铵对该酶活力也有抑制作用.利用L inew eaver-Burk作图法判定抑制类型分别为非竞争性、竞争性和非竞争性抑制,抑制常数分别为5.87、2.47和8.2μm o l/L.     

大豆磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酯酶研究Ⅲ、非专一性酸性磷酸酯酶的纯化与特性

从大豆叶片中分离能水解磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的酸性磷酸酯酶,通过硫酸胺分部(20%～50%饱和度)沉淀、DEAE纤维素层析、刀豆球蛋白琼脂糖凝胶亲和层析将酶纯化了422.47倍,活性达78.16U/mg蛋白。该酶对PEP专一性不强,Km为1.09mmol/L(PEP),最适pH5.8,在pH4.8～7.0范围内及60℃以下较稳定,水解PEP的活性被Mg2+、Mn2+激活,F、Cu2+、Zn2+、PO43、MoO42及3磷酸甘油酸(3PGA)、三磷酸腺苷ATP等代谢物抑制,受异柠檬酸等有机酸影响较小。     

螺旋藻POD对温度和pH值适应性的研究

以毛乌素沙地碱湖特有的钝顶螺旋藻S₁、引进的钝顶螺旋藻S₂和极大螺旋藻S₃为材料,采用愈创木酚法探讨温度和pH值对其POD活性影响。结果表明:S₁、S₂和S₃的POD活性分别为480 U/g.FW、447 U/g.FW和408 U/g.FW(25℃、pH 6);最适温度分别为30℃、40℃和40℃;最适pH均为6.0。S₁的POD对温度和pH适应范围宽,在低、高温、强酸和强碱下的活性均比引进种的高。     

微生物凝乳酶的研究 Ⅱ.酶学性质

从2502株菌中筛选到一株真菌Y85-8512经诱变育种,发酵物的凝乳酶活力为5000 u/g以上。对该酶的酶学性质进行了研究,其最适反应温度为70℃,酶在50℃保温半小时稳定;pH 5.0时酶活最高,pH 7.0酶几乎失活;pH 2—5,室温保持1小时,剩余酶活力为66—100%。该酶凝乳活性与水解蛋白质活性之比为4782。还与胃蛋白酶、小牛凝乳酶及毛霉凝乳酶进行了比较,初步认为该酶不同于这几种酶。     

影响叶螨磷酸酯酶活性的四因子数学模型

应用二次回归通用旋转组合设计,组建了影响叶螨磷酸酯酶（酸性和碱性）活性的四因子（缓冲液Ph值X₁、温浴时间X₂、反应温度X₃、底物浓度X₄）数学模型: Y_酸性=0.456380+0.107889X₂+0.069027X₃-0.026836X₁²-0.030794X₃², F=24.98,P<0.01;Y_碱性=0.267286-0.200736X₁+0.049541X₂+0.030930X₃-.049063X₁X₂+0.053585X₁²-0.049665X₂^2, F=57.68,P<0.01。结果表明,温浴时间是影响叶螨酸性磷酸酯酶活性的关键因子,在缓冲液pH 4.4、底物浓度8.5×10^-3 mol/L、42℃温浴40 min测得该酶活性最强。影响碱性磷酸酯酶活性的关键因子则是缓冲液pH值,pH 9.0、37℃恒温30 min、底物7.5×10^-3 mol/L的条件下,光密度值最大。两种酶的最大吸收峰波长为405 nm。     

微生物凝乳酶的研究 Ⅱ.酶学性质

从2502株菌中筛选到一株真菌Y85-8512经诱变育种,发酵物的凝乳酶活力为5000 u/g以上。对该酶的酶学性质进行了研究,其最适反应温度为70℃,酶在50℃保温半小时稳定;pH 5.0时酶活最高,pH 7.0酶几乎失活;pH 2—5,室温保持1小时,剩余酶活力为66—100%。该酶凝乳活性与水解蛋白质活性之比为4782。还与胃蛋白酶、小牛凝乳酶及毛霉凝乳酶进行了比较,初步认为该酶不同于这几种酶。     

鱼源副乳房链球菌前噬菌体裂解酶Sply828的抗菌活性

【背景】副乳房链球菌（Streptococcus parauberis）是重要的水产病原菌,该病原菌已逐渐出现新的血清型及多重耐药性状,因此亟须开发出一种新的抗菌药物用于该病害的防治。研究发现,前噬菌体编码的裂解酶能够有效地杀死其宿主,具有良好的抗菌应用前景。【目的】以副乳房链球菌前噬菌体裂解酶为对象,研究其杀菌宿主谱并优化其裂解活性的条件。【方法】利用PHASTER工具对副乳房链球菌菌株KRS02083全基因组序列分析发现,其前噬菌体包含一种裂解酶的基因Sply828;通过基因克隆、表达和纯化等技术得到裂解酶Sply828蛋白;通过浊度递减实验探究裂解酶Sply828对不同细菌的杀菌活性及其最适的裂解条件。【结果】裂解酶Sply828对鱼源副乳房链球菌具有最佳的杀菌活性,并发现该酶对处于指数生长期的细菌杀菌效果最好;其最适裂解温度为28°C,最适pH为6.2;Ca²⁺和Mg²⁺对该酶的杀菌活性有促进作用,但是Zn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺明显抑制...     

嗜冷枯草芽孢杆菌低温脂肪酶纯化与酶学性质研究

从筛选出的产低温脂肪酶的菌株发酵液中,经硫铵沉淀、疏水色谱和阴离子交换色谱纯化得到电泳纯酶。酶的最适作用温度为25℃,0℃以下仍可保持25%左右的相对酶活;在pH5.8～8.8的范围内有较高活力,其最适作用pH为7.8;对热很敏感,在60℃保温30min活性即全部丧失,具有典型的低温脂肪酶特征;酶催化不需要金属离子的参与,结构中可能含有二硫键。在25℃,pH8.0测得酶水解反应的Km值为2.65×10-5mol/L,Vmax值为5.21mmol/(L.min)。     

刺芹侧耳芳基醇氧化酶的分离纯化及其酶学性质

分离纯化刺芹侧耳Pleurotus eryngii芳基醇氧化酶,并探究其酶学性质。通过硫酸铵盐沉、DEAE-Sepharose Fast Flow弱阴离子交换层析、Sephacryl S-200 High Resolution凝胶过滤层析和Source 15Q强阴离子交换层析,得到纯化的单一酶。经肽指纹图谱鉴定,确定其为芳基醇氧化酶,酶活回收率25.5%,纯化倍数38.2。结合SDS-PAGE和IEF-PAGE分析,确定其分子量和等电点分别为70kDa和4.2。以藜芦醇为底物,该酶最适反应pH为6.0,最适反应温度为70℃,金属离子Zn²⁺、Fe²⁺和Cu²⁺对芳基醇氧化酶的活性抑制作用明显,K_m和V_max分别为0.921mmol/L和80U/mg。     

产木聚糖酶白地霉培养特性及部分纯化的酶学特性

本文对白地霉Ref1的培养特性、产酶条件和酶学特性进行了初步研究。结果表明:该菌为低温型菌株,其最佳生长条件为pH6、20℃和酵母膏作为氮源;最佳产酶条件为pH3-7、15℃及以酵母膏氮源;条件优化后产酶可达118.7U/mL,可溶蛋白含量可达到60μg/mL,酶溶液的比活可达到1250U/mg蛋白质;该木聚糖酶的最适反应温度和pH分别为50℃和5,金属离子Mg2+、Na+和8mmol/L的Fe2+、Cu2+、Zn2+等对木聚糖酶的活性有抑制作用,而Ca2+、4mmol/L的Fe2+、Cu2+、Zn2+和8mmol/L的Mn2+等对该酶反应则有促进作用;该木聚糖酶在保温2h后在15-40℃范围内能保持80%以上的酶活性,在50℃时能保持68%的酶活性;用lineweaver-Burk作图法(双倒数作图法)求得该酶的最大反应速度Vmax和Km值分别为163.38mmol/mg/min和0.75mg/mL。     

萌发绿豆种子中的一种大豆胰蛋白酶抑制剂钝化酶

通过 30 %～ 6 0 % (NH4 ) 2 SO4 分级沉淀、DEAE_SepharoseCL_6B离子交换层析、SephacrylS_2 0 0凝胶过滤层析和WatersAP_1离子交换层析 ,从萌发的绿豆 (Vignarabiata (L .)Wilczek)种子中分离纯化出一种可降解大豆胰蛋白酶抑制剂 (STI)的蛋白酶。SDS_PAGE测定该酶的分子量为 2 9.8kD。该酶催化降解STI的Km 值为 76 9.2BAEE/mL ,Vmax为 115 .3BAEE·mL-1·min-1。该酶在 5 0℃、pH 8.0、相对酶活力 5 0 0 0BAEE/mL和 4h的反应时间时可将脱脂大豆粉中的STI活性钝化 90 .91%。该酶在温度低于 5 0℃及pH 6 .5～ 8.5时能保持其活性。     

球孢白僵菌Bb174固态发酵产几丁质酶产酶及酶学特征研究

对球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bb174产几丁质酶进行了固态发酵条件及酶学特征的研究.结果表明,以4:1麸皮:蚕蛹粉、蛋白胨1g·L^-1作为产酶最适培养基,在75g培养基中接种3ml液态种子,自然pH下28℃培养2d,酶活可达最高,为126U·g^-1(干培养基).粗酶液的最适反应温度为40℃,最适反应pH5.0,在30～70℃保温1h,得半失活温度48℃.在30～40℃、pH4～6范围内,酶的性质最稳定.根据Lineweaver-Burk作图法,得到该酶的动力学参数K_m为0.52mg·ml^-1,V_m为0.7△E₆₈₀·h^-1.     

金黄杆菌ZHDP1菌株基因组分析及其蛋白酶活性特征与产酶优化

【背景】蛋白酶活性研究对于理解金黄杆菌属（Chryseobacterium）菌株的生态角色、工业价值及潜在致病机理十分重要。【目的】分析一株细菌的新型基因组序列,以此推断其中潜在的蛋白酶基因,并对其蛋白酶活性进行验证与优化,为后续研究提供数据支撑。【方法】利用高通量测序技术对菌株基因组序列进行测定与组装,并利用单因素优化方法对菌株的蛋白酶作用条件与产酶条件进行优化。【结果】分离得到一株蛋白酶活性菌株,通过分子生物学手段鉴定为金黄杆菌属菌株,并命名为Chryseobacterium sp. ZHDP1。该菌株基因组大小为4 917 748 bp,GC含量为35.95%,平均核苷酸相似性和DNA-DNA杂交指数分别为91.39和47.8。该菌株基因组中发现超过20条蛋白酶基因,上清液中也检测到蛋白酶活性,其最适反应温度和pH值分别为50℃和7.0。Zn²⁺、Mn²⁺和Cr₂O₇^2-对蛋白酶活性有强烈抑制作用。ZHDP1菌株在培养温度35℃、培养时间35 h、接种量4%、碳源和氮源为...