肽合成中多对二硫键的形成策略及分析方法

二硫键的正确配对是富含二硫键多肽合成的关键。本文综述了含两对二硫键以上的多肽二硫键的形成策略,优化方法、以及二硫键配对方式的测定方法。     

链霉菌降解角蛋白的生化机制研究*

对弗氏链霉菌S-221变种降解角蛋白的生化机制进行了初步研究。该菌在角蛋白底物作用下诱导产生角蛋白酶。它是一种复合蛋白酶,含有二硫键还原酶和多肽水解酶等多种酶活性组分。硫酸钠、亚硫酸钠和巯基乙醇对角蛋白酶具有强烈的激活作用,其主要表现作用于角蛋白酶中的二硫键还原酶。亚硫酸钠在0·01mol/L浓度下不仅作用于二硫键还原酶,而且还作用于多肽水解酶。硫代硫酸钠对二硫键还原酶有强烈的抑制作用。角蛋白酶降解羽毛角蛋白首先是角蛋白酶中的二硫键还原酶使角蛋白中二硫键裂解产生变性角蛋白,然后变性角蛋白在多肽水解酶的共同     

从噬菌体多肽文库中筛选α—葡萄糖苷酶的抑制剂

以黑曲霉葡糖淀粉酶为靶分子,筛选噬菌体展示的多肽文库,经过3轮生物淘选法筛选,得到3个特异性结合的噬菌体克隆,分别命名为GB-1、GB2和GB-3。其插入多肽中都含有一对二硫键,破坏二硫键将大大降低噬菌体与葡糖淀粉酶的结合。化学合成的环状多肽KCHFEECLAY,其序列对应于结合力最强的一个克隆GB-1的N端的10个氨基酸残基,该多肽可以竞争性地抑制黑曲霉葡糖淀粉酶（Ki=0.2mmol/L)以及大鼠小肠的α-葡萄糖苷酶（Ki=1.4mmol/L)。     

链霉菌降解角蛋白的生化机制研究

对弗氏链霉菌S-221变种降解角蛋白的生化机制进行了初步研究。该菌在角蛋白底物作用下诱导产生角蛋白酶。它是一种复合蛋白酶,含有二硫键还原酶和多肽水解酶等多种酶活性组分。硫酸钠、亚硫酸钠和巯基乙醇对角蛋白酶具有强烈的激活作用,其主要表现作用于角蛋白酶中的二硫键还原酶。亚硫酸钠在0．01mol／L浓度下不仅作用于二硫键还原酶,而且还作用于多肽水解酶。硫代硫酸钠对二硫键还原酶有强烈的抑制作用。角蛋白酶降解羽毛角蛋白首先是角蛋白酶中的二硫键还原酶使角蛋白中二硫键裂解产生变性角蛋白,然后变性角蛋白在多肽水解酶的共同作用下逐步水解成多肽、寡肽和游离氨基酸,使角蛋白彻底降解。在角蛋白降解过程中,角蛋白中的硫也随之转化成巯基化合物,H2S和硫酸盐3种含硫化合物存在于降解产物中。     

人类垂体和血浆中存在裂解型催乳素

1980年,在大鼠和小鼠垂体中发现了裂解型催乳素(cleaved prolactin)。完整的催乳素(PRL)分子含有三个二硫键,分子内部形成一个大环和两个小环。裂解型PRL分子内二硫键大环中出现一个断口,处于130位和140位两个赖氨酸残基之间,分子中虽出现断口,但大环中二硫键仍保留,因而裂解型PRL仍为一连续分子。当二硫键还原而断裂时,裂解型PRL即断裂成两个片段,按其分子量大小分别称为16K片段(N端)和8K片段(C端)。裂解型PRL与完整PRL的作用不同,前者的16K部分能诱发乳腺上皮细胞DNA合成和细胞分裂,为一种促乳腺有丝分裂因子;后者则促进乳汁特异性蛋白质合成。     

敬钊缨毛蛛毒素-Ⅷ的分离纯化与鉴定

从敬钊缨毛蛛（Chilobrachys jingzhao）粗毒中,通过阳离子交换色谱和反相高效液相色谱分离得到一种新的多肽神经毒素,命名为敬钊缨毛蛛毒素-Ⅷ（jingzhaotoxin-Ⅷ,JZTX-Ⅷ）.经MALDI-TOF分析表明该多肽分子质量为4 329.37 Da,结合氨基酸序列分析和RACE的cDNA快速扩增法得到了敬钊缨毛蛛毒素-Ⅷ的氨基酸序列和全长cDNA,序列为LFECSFSCDIKKNGKPCKGSGEKKCSGGWRCKMNFCVKV-COOH,其中6个半胱氨酸形成3对二硫键.敬钊缨毛蛛毒素-Ⅷ能阻断小鼠膈神经-膈肌标本的神经肌肉接头传递,经初步膜片钳实验分析,表明该多肽是一种钙离子通道抑制剂.     

指形龙隙蛛毒腺中抗凝活性多肽挖掘

目的：有毒动物毒腺分泌大量结构多样和功能丰富的活性多肽,是多肽药物开发的天然宝库。目前仅有一小部分有毒动物活性多肽被研究,因此有必要建立一种更加高效的活性多肽挖掘方法。方法：以指形龙隙蛛为研究对象,通过对毒腺样本进行转录组测序、数据分析与多肽挑选,多肽重组表达制备,体外活性筛选和动物模型体内活性评价等方法,进行抗凝活性多肽的开发。结果：筛选到一种凝血因子Xa抑制剂PDBPE-001,多肽分子量为9 889.82 Da,由92个氨基酸残基组成,有4对二硫键。该多肽可通过重组表达的方式高效制备,对凝血因子Xa的抑制活性呈浓度依赖性,其半抑制浓度约为0.807μmol/L。在体内血栓模型中,30 mg/kg PDBPE-001能起到良好的抗血栓效果。结论：首次从指形龙隙蛛中获得了一个新型Factor Xa抑制剂,为新型抗凝血药物开发提供了一个全新的先导多肽分子。     

人红细胞生成素的研究和应用现状

人红细胞生成素(EPO)主要是由与近侧肾小管邻近的对氧敏感细胞生成的一种糖蛋白,在成人,极少部分由肝脏合成,胎儿时期肝脏则是合成EPO的重要器官。EPO在红细胞发育成熟过程中起着重要作用,临床上用于治疗各种贫血性疾病有特殊的治疗效果。1 EPO的理化特性及生物学活性 天然EPO分子包括多肽部分和糖链部分。多肽全长为193个氨基酸残基,分泌前27个氨基酸的前导信号肽被除去。事实证明,成熟EPO分子多肽的羧端精氨酸残基也被除去,为165个氨基酸残基。肽链中有两个二硫键,分别为7位与161位、29位与33位。4个糖基化位     

抑制剂胱氨酸结多肽的抗菌和杀虫活性及进化

抑制剂胱氨酸结(inhibitor cystine knot, ICK)多肽是胱氨酸结(cystine knot, CK)多肽的三大家族成员之一。这种类型的多肽含有反向平行的3个β折叠,由3对二硫键形成稳定的拓扑学打结。它们广泛地分布在动物、植物、真菌甚至原核生物中,具有蛋白酶抑制剂,离子通道毒素以及抗微生物、抗疟疾及抗病毒活性等多种生物学功能。本文首先总结了昆虫中已发现的抗微生物活性和离子通道毒素活性的ICK肽;然后介绍了有毒动物尤其是蜘蛛、蝎子,以及植物中一些神经毒素活性的ICK肽,它们通常靶向昆虫体内的各种离子通道,从而发挥杀虫效果;最后结合ICK肽的基因序列特征,结构域和二硫键数目以及物种分布,对其进化多样性进行了探讨。     

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ-(HWTX-Ⅰ)28肽类似物的化学合成与活性鉴定

虎纹捕鸟蛛毒素-(huwentoxin-,HWTX-)是从我国虎纹捕鸟蛛毒素中分离纯化得到的一种多肽类神经毒素.该多肽分子由33个氨基酸残基组成,含三对二硫键.其一级结构和三级结构均已测定.弄清该毒素的活性部位,是研究其结构功能关系的基础.用固相Fmoc化学合成的方法,合成了虎纹捕鸟蛛-的28肽类似物.该突变体去掉了天然毒素分子N端的Alal和C端的Lys30-Trp31-Lys32-Leu33共5个残基.用氧化还原型谷胱甘肽法完成二硫键配对,并用HPLC进行纯化,所得突变体与天然HWTX-的紫外光谱相似.质谱鉴定确认合成产物正确,分子量为3124,浓度为1×10-5g/ml的突变体能可逆阻断小白鼠膈神经-膈肌的接头传递,阻断时间为60～70min.与天然毒素比较,活性有所下降.结果说明HWTX-的N端、C端残基对其生物活性有一定影响,但不是位于活性中心的重要残基.由结果推测,虎纹捕鸟蛛毒素-的活性中心位于该分子中连接β-折叠的回环区     

一种新型贻贝抗菌肽的分离纯化及鉴定

厚壳贻贝（Mytilus coruscus）广泛分布于我国东部海域,其体内富含各种抗菌肽分子,是研究软体动物免疫防御机制以及开发抗菌肽来源的新型生物抗生素的重要对象。采用多步反相高效液相色谱对厚壳贻贝血清进行分离纯化,获得一种分子量为6261.55 D的具有抗菌活性的多肽成分;经多肽N端测序和基因克隆,结果表明该抗菌肽由55个氨基酸残基构成,含6个半胱氨酸并形成三对二硫键。结构域分析表明该抗菌肽具有几丁质结合结构域（Chitin-biding domain）,因此将该抗菌肽命名为mytichitin-A。Mytichitin-A对革兰氏阳性菌具有较强的抑制作用,同时对真菌及革兰氏阴性菌也具有抑制作用。荧光定量PCR检测表明,mytichitin-A主要在厚壳贻贝的性腺组织中表达且在细菌诱导后12h其表达量达到峰值。研究为深入了解厚壳贻贝抗菌肽的分子多样性及免疫机制奠定了基础。       

虎纹捕鸟蛛毒素-X的化学合成及其鉴定

应用芴甲氧羰基（Fmoc）固相方法化学合成了虎纹捕鸟蛛毒素-X（huwentoxin-X,HWTX-X）,并在含5mmol／LGSH和0．5mmol／LGSSG的0．1mol／L Tris-HCl溶液（pH8．0）中氧化复性：复性产物与天然多肽具有相同的分子质量,在反相HPLC上共洗脱,其一维核磁共振谱规则分散,表明合成多肽形成了3对二硫键和稳定的空间结构,并与天然多肽相同：此合成的多肽能专一性抑制大鼠背根神经节细胞上N-型电压敏感钙离子通道．其IC50约40nmol／L. HWTX-X的成功合成和鉴定为进一步研究HWTX-X的结构与功能关系、药理学性质以及新型镇痛药物研发奠定了基础．     

生物化学与生物物理进展专刊征稿启事

正《生物化学与生物物理进展》拟于2022年1月出版主题为"蛋白质与多肽的检测和治疗(Protein and Peptide Diagnostics and Therapeutics)"的基础研究专刊。现诚邀海内外科研工作者来稿,稿件形式为研究报告或者综述,稿件文字中英文皆可。专刊内容主要包括以下研究方向: 蛋白质或多肽分子作为疾病诊断标志物的基础与应用研究; 蛋白质或多肽分子作为疾病治疗靶点的机制与应用; 实验室及临床检测蛋白质或多肽分子新技术新方法的基础研究; 蛋白质及多肽药物开发的基础研究。     

用质粒pUC18在大肠杆菌中表达人蛋白质二硫键异构酶

 用质粒ｐＵＣ１８在大肠杆菌中表达人蛋白质二硫键异构酶高音,王志珍（中国科学院生物物理研究所,生物大分子国家重点实验室,北京１００１０１）蛋白质二硫键异构酶（ｐｒｏｔｅｉｎｄｉｓｕｌｆｉｄｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ,ＰＤＩ）催化蛋白质分子内天然二硫键的形成,...     

生物化学与生物物理进展专刊征稿启事

正《生物化学与生物物理进展》拟于2022年1月出版主题为"蛋白质与多肽的检测和治疗(Protein and Peptide Diagnostics and Therapeutics)"的基础研究专刊。现诚邀海内外科研工作者来稿,稿件形式为研究报告或者综述,稿件文字中英文皆可。专刊内容主要包括以下研究方向: 蛋白质或多肽分子作为疾病诊断标志物的基础与应用研究; 蛋白质或多肽分子作为疾病治疗靶点的机制与应用; 实验室及临床检测蛋白质或多肽分子新技术新方法的基础研究; 蛋白质及多肽药物开发的基础研究。     

生物化学与生物物理进展专刊征稿启事

正《生物化学与生物物理进展》拟于2022年1月出版主题为"蛋白质与多肽的检测和治疗(Protein and Peptide Diagnostics and Therapeutics)"的基础研究专刊。现诚邀海内外科研工作者来稿,稿件形式为研究报告或者综述,稿件文字中英文皆可。专刊内容主要包括以下研究方向: 蛋白质或多肽分子作为疾病诊断标志物的基础与应用研究; 蛋白质或多肽分子作为疾病治疗靶点的机制与应用; 实验室及临床检测蛋白质或多肽分子新技术新方法的基础研究; 蛋白质及多肽药物开发的基础研究。     

类胰岛素生长因子-1的C结构域不影响胰岛素二硫键的热力学稳定性

胰岛素和类胰岛素生长因子-1(IGF-1)都属于胰岛素超家族,两者不但一级、三级结构有较高的同源性,而且生理功能也有少量交叉.然而两者的折叠行为却有很大的差别：胰岛素及其重组前体(PIP)只折叠成一种热力学稳定的二硫键配对,而IGF-1却折叠成两种热力学稳定的二硫键异构体.为了了解两者折叠行为差异的分子机制,制备了由胰岛素的A,B链和IGF-1的C结构域构成的单链杂交分子——[B10Glu]Ins/IGF-1(C),研究了该杂交分子二硫键的热力学稳定性以及它在含有少量巯基试剂的变性剂中的解折叠程度,同时还纯化了该杂交分子一种主要的非天然二硫键异构体,并研究了它的再折叠情况. 观察到IGF-1中C结构域的引入并未改变胰岛素分子的折叠热力学,但是影响了折叠的动力学过程.     

蛋白质的氧化重折叠

经过近几十年来广泛而深入的研究,蛋白质氧化重折叠的机制已得到相当详细的阐明。1在已研究过的蛋白质中,大多数蛋白质都是沿着多途径而非单一、特定的途径进行氧化重折叠,这与折叠能量景观学说是一致的。2正是氨基酸残基间的天然相互作用而不是非天然的相互作用控制蛋白质的折叠过程。这一结论与含非天然二硫键的折叠中间体在牛胰蛋白酶抑制剂（BPTI）折叠中所起的重要作用并非相互排斥,因为后者仅仅是进行链内二硫键重排的化学反应所必需,与控制肽链折叠无直接关系。3根据对BPTI的研究,二硫键曾被认为仅仅具有稳定蛋白质天然结构的作用,既不决定折叠途径也不决定其三维构象。这一观点不适用于其它蛋白质。对凝乳酶原的研究表明,天然二硫键的形成是恢复天然构象的前提。天然二硫键的形成与肽键的正确折叠相辅相成,更具有普遍意义。4在氧化重折叠的早期,二硫键的形成基本上是一个随机过程,随着肽链的折叠二硫键的形成越来越受折叠中间体构象的限制。提高重组蛋白质的复性产率是生物技术领域中的一个巨大的挑战。除了分子聚集外,在折叠过程中所形成的二硫键错配分子是导致低复性率的另一个主要原因。氧化重折叠机制的阐明为解决此问题提供了有益的启示。如上所述,在折叠的后期,二硫键的形成决定于折叠中间体的构象,类天然、有柔性的结构有利于天然二硫键形成和正确折叠,具有这类结构的分子为有效的折叠中间体,最终都能转变为天然产物;而无效折叠中间体往往具有稳定的结构,使巯基、二硫键内埋妨碍二硫键重排,并因能垒的障碍不利于进一步折叠。因此,降低无效折叠中间体的稳定性使之转变为有效折叠中间体是提高含二硫键蛋白质复性率的一条基本原则,实验证明,碱性pH、低温、降低蛋白质稳定性的试剂、蛋白质二硫键异构酶、改变蛋白质一级结构是实现这一原则的有效手段。此外,这里还就氧化重折叠的基础和应用研究的前景进行了讨论。     

人防御素HNP-1基因在原核系统中的克隆与表达

通过化学合成法制备人防御素 HNP- 1基因 ,并将其构建于带有 GST基因的表达载体中 ,进行融合表达 ,表达融合蛋白可占菌体蛋白的 70 %左右 ,且主要以包含体形式存在。改变培养条件可适当提高可溶性融合蛋白的比例。融合蛋白通过凝胶色谱进行纯化 ,然后经凝血酶切释放出防御素多肽 ,并通过抑菌试验对其活性进行检测。结果显示 ,可能由于分子间的二硫键错配造成了防御素分子构象改变 ,使制备的防御素分子未显示出活性     

二硫键异构酶

天然二硫键的形成是许多蛋白正确折叠中的限速步骤,在稳定蛋白质构象和保持蛋白质活性方面起重要作用。讨论的二硫键异构酶是内质网中一种重要的蛋白折叠催化剂,它催化蛋白二硫键的形成和错误配对二硫键的重排,并有抑制错误折叠蛋白聚集的分子伴侣活性。PDI广泛应用于基因工程上提高外源蛋白表达水平。