低氧诱导因子在肾透明细胞癌中作用的研究进展

VHL基因具有调节转录、稳定细胞生长相关基因和调节细胞周期的功能,其突变、缺失、重排和超甲基化与肾细胞癌(RCC)的发生密切相关。VHL基因产物VHL肿瘤抑制蛋白(p VHL)是泛素连接酶的成分,具有调节低氧诱导因子(HIF)稳定性的作用。HIF家族主要包含三种HIFα因子(HIF1α、HIF2α、HIF3α)和两种HIFβ因子(HIF1β、HIF2β)。HIF1α位于14q染色体上,在肾透明细胞癌中该染色体经常缺失,且这种14q的缺失常伴有预后不良。HIF2α的表达异常促进了p VHL缺陷型肾透明细胞癌中的发生。目前,抑制HIF2α及其下游的血管内皮生长因子(VEGF)的药物都处于临床试验的不同阶段,已有四种VEGF抑制剂获准用于肾透明细胞癌的治疗。选择抑制HIF或具有HIF靶基因抑制选择性的药物进行研究,可能为肾透明细胞癌的治疗提供新的方法。本文就HIF在VHL蛋白缺陷型肾透明细胞癌中作用的研究进展进行了综述。     

VHL综合征遗传学研究

VHL综合征(von Hippel-Lindau syndrome,VHL;MIM 193300)是一种常染色体显性遗传的多系统肿瘤综合征,最常见临床表现是视网膜或中枢神经系统(central nervous system,CNS)血管母细胞瘤.CNS血管母细胞瘤和肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)的并发症是VHL患者最主要的死因.VHL综合征主要因VHL基因(the vonHipple-Lindau gene,VHL)突变所致,细胞周期素D1基因(the cyclin D1 gene,CCND1)突变和蛋白异常也可能参与其发生.目前已建立了多个VHL基因缺陷动物模型.在此就VHL综合征的遗传学研究进展作一概述.     

von Hippel-Lindau病的分子机制研究

VHL病(Von Hippel-Lindau disease)是一种遗传性肿瘤综合征,由VHL抑癌基因突变引起.研究表明,VHL蛋白在体内具有多种功能,VHL基因突变形式和部位的差异所造成的VHL蛋白功能增加、减少或缺失可能是导致肿瘤不同表型的重要原因.     

Mnk2与CBCVHL泛素连接酶E3复合物的相互作用

Mnk2即MAPK相互作用的激酶-2(MAP kinase-interacting kinase-2, Mnk2)是MAPK激活的蛋白激酶之一, 具有磷酸化真核翻译起始因子eIF4E(Eukaryotic translation initiation factor 4E)的作用, 但是eIF4E磷酸化的生理功能以及Mnk2在蛋白翻译过程中的确切地位并不清楚. 除了eIF4E外, Mnk2生理底物尚缺乏鉴定. 为了进一步寻找Mnk2新的生理底物, 揭示Mnk2的生理功能, 我们以Mnk2为“诱饵”, 运用酵母双杂交系统发现Mnk2能够与VHL(von Hippel-Lindau tumor suppressor), Rbx1(ring-box 1)和Cul2(Cullin2)相互作用, 并在哺乳动物细胞中验证了Mnk2和VHL的结合. 由于VHL, Rbx1和Cul2均为CBCVHL泛素连接酶E3复合物成分, 所以Mnk2参与了CBC^VHL泛素连接酶E3复合物的相互作用, 可能是其新的泛素化底物. 此外, 在酵母双杂交系统中, Mnk2还与VHL结合蛋白-1(von Hippel-Lindau binding protein 1, VBP1)相互作用, 由于VBP1在细胞骨架蛋白的成熟过程起重要作用并与胚胎形态的发生有关, 所以Mnk2可能还参与了细胞形状的调控.     

Von Hippel—Lindau（VHL）基因

Von Hippel-Lindau(VHL)病虽然发病率较低,但受影响的个体容易产生多种肿瘤,如眼部肿瘤,肾和脑肿瘤等,最近已发现了VHL基因,将其定位在染色体3p25区,很可能是一个新的肿瘤抑制基因,这将对VHL病或肿瘤的诊断和治疗都有重要意义。     

Elongin的转录延伸调控及其与VHL肿瘤抑制蛋白的关系

一种新的转录延伸因子Elongin能催化哺乳动物细胞中RNA pclⅡ的转录延伸速度。El-ogin复合体是由分子量分别为110、18、和15KD的A、B、C三种亚基组成的异源三聚体。VHL蛋白对Elongin的转录延伸作用有负调控作用,VHL蛋白由VHL基因(Von Hippel-Lindau tumor suppressor gene)所编码。VHL基因的突变会引起VHL型肿瘤,一种遗传性癌症综合征。VHL蛋白能与Elongin的B,C亚基紧密结合,从而抑制Elongin复合体的转录延伸活力,这可能是VHL型肿瘤抑制的基础。这些发现表明,VHL蛋白在Elongin的转录调控中起着一定的作用。     

VHL基因的研究进展及其在肾癌基因治疗中的应用

VHL基因是抑癌基因,定位于染色体3p25-26,其产物pVHL与Wnt-β-catenin信号通路、缺氧诱导因子、氧化磷酸化的调控有关。VHL基因的失活会导致VHL蛋白不能正常合成,这与散发性肾透明细胞癌的发生、发展有着密切的关系。VHL基因的失活机制主要包括基因突变,杂合性缺失和甲基化。通过对VHL基因失活机制的研究有助于筛选用于肾透明细胞癌早期诊断与预后的新分子标志物。目前利用VHL基因开展了肾癌基因治疗的试验探索。     

低氧诱导因子-1：细胞适应氧供应改变的关键蛋白

2019年诺贝尔生理学或医学奖授予威廉·凯林(William Kaelin Jr)、彼得·拉特克里夫爵士(Sir Peter Ratcliffe)和格雷格·赛门扎(Gregg Semenza),以表彰他们在细胞感知和适应缺氧机制上做出的重要贡献.低氧诱导因子-1 (hypoxiainducible factor-1,HIF-1)在细胞适应氧供应改变中起关键作用,可作为转录因子改变基因表达,通过提高机体携氧能力、增加血液供应、改变代谢方式等途径来适应缺氧环境.而HIF-1的功能也受到各种机制调控:泛素化-蛋白酶体途径降解和转录因子活性抑制. HIF-1与抑癌蛋白(protein von Hippel-Lindau,pVHL)、脯氨酸羟化酶(proline hydroxylase,PHD)、HIF抑制因子(factor inhibiting HIF,FIH)等构成了严密有序的调节网络.本文总结了3位诺贝尔奖获得者的研究成果,并结合最新的研究进展,系统阐述了HIF-1表达量调节机制和HIF-1介导的细胞适应缺氧环境机制.     

E3泛素连接酶VHL通过调控HIF-1α维持Treg稳态及功能

正调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)是CD4+T细胞的重要亚群,参与了免疫耐受和对自身抗原的耐受反应。Von Hippel-Lindau(VHL)基因的失活或者突变促进多种肿瘤发生。HIF-1α是VHL复合物的底物,在常氧状态下,HIF-1α经脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase domain,PHD)的羟化后被VHL识别,进而被泛素化修饰,再经由蛋白酶体降解,所以维持在较低水平。有研究表明,HIF-1α参与维持Th17和Treg平衡。本文作者,对于VHL是否参与了Treg细胞的调控进行了研究。     

细胞如何适应外界变化的氧环境——解读2019年诺贝尔生理学或医学奖

人的生命活动时刻离不开氧气,在低氧环境或者高氧环境中,机体不断对代谢过程进行调节,以适应环境。缺氧条件下,机体可产生促红细胞生成素(EPO),美国塞门扎教授发现了可对EPO基因转录进行调控的缺氧诱导因子(HIF)。但在正常氧气条件下,HIF1-α在细胞中几乎不存在,威廉·凯林发现了VHL蛋白通过给HIF-1α泛素化以调控其降解和代谢。凯林和拉特克利夫进而在HIF-1α的分子结构中发现了一个氧依赖性降解区(ODD),当氧气浓度较高时,这个部位可被VHL结合。有关此通路的研究临床价值极大,诺贝尔奖实至名归。     

人VHL基因真核表达载体的构建及其对肿瘤细胞生长的抑制

目的:构建人抑癌基因VHL的真核表达载体,并验证其对肿瘤细胞生长的影响。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增人VHL基因,将其克隆到p XJ-40-myc载体中,酶切和测序验证后转染人胚肾293T细胞,通过蛋白免疫印迹鉴定其表达;转染人乳腺癌ZR75-1细胞和肝癌Hep G2细胞,通过CCK8法测定细胞生长曲线。结果:从人乳腺文库中扩增得到约650 bp的DNA片段,并克隆至p XJ-40-myc载体上,且测序与目的序列完全一致;转染人胚肾293T细胞后,蛋白免疫印迹检测到相对分子质量为26×103的目的基因表达产物;细胞生长曲线显示,转染myc-VHL的乳腺癌、肝癌细胞较空载体细胞生长慢。结论:构建了myc-VHL真核表达载体,myc-VHL抑制癌细胞生长,为进一步研究VHL在肿瘤发生发展中的功能奠定了基础。     

酿酒酵母转运蛋白Agp1p泛素化对氮源利用的影响

摘要:【目的】研究酿酒酵母细胞膜关键氮源转运蛋白Agp1p的泛素化对其氮源利用的影响。【方法】构建一个基于双分子荧光互补技术的泛素化检测载体,检测Agp1p是否受到泛素化。采取定点突变的方法对Agp1p中可能的泛素化位点进行突变,研究其泛素化的关键作用位点及其对酿酒酵母氮源利用的影响。【结果】在谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸及铵盐为唯一氮源的培养基中,转运蛋白Agp1p均受到泛素化调控。定点突变实验结果显示,与出发菌株相比,潜在泛素化位点突变后,菌体荧光强度均有一定程度减弱。其中四重突变体Agp1pK11,14,98,112R荧光强度最弱,表明泛素化过程被显著抑制。系列突变菌株在9种氨基酸为复合氮源以及尿素为单一氮源的发酵实验表明,四重突变体菌体氮源利用率提高效果显著。【结论】转运蛋白Agp1p的泛素化受到不同氮源的影响,泛素化位点突变可以显著影响其泛素化过程,从而改变细胞对氮源的利用过程。     

一VHL 家系致病基因突变的检测与分析*

目的:研究中枢神经系统血管母细胞瘤(VHL)基因突变的主要类型和发生情况,探讨VHL疾病发生的原因、临床特点等。方法:以基因组DNA为模板,PCR扩增VHL基因3个外显子及5’UTR区域,结合DNA直接测序的方法,对一个有多个小脑血管母细胞瘤患者的家系进行VHL基因突变检测。结果:发现该家系VHL基因5’UTR区、外显子1和外显子2正常,外显子3存在c.499C>G的改变,为一个错意突变,氨基酸改变为Arg-Gln(p.R167Q),该突变是导致这个家系的患者发病的直接原因。结论:VHL疾病的突变主要集中在VHL蛋白的α、β结构域,位于α结构域的p.R167Q突变为该VHL家系致病的主要原因。     

酿酒酵母组氨酸转运蛋白Hip1p的泛素化水平对组氨酸利用的影响

【目的】为了研究泛素化对组氨酸转运及调控的影响。【方法】应用泛素化位点预测及定点突变等技术手段,Hip1p的3个潜在的泛素化位点K30、K42和K52被突变。这些突变的Hip1p被克隆到泛素化检测质粒中,检测泛素化位点突变对Hip1p的泛素化水平的影响。同时这些突变对细胞生长及组氨酸利用的影响也进一步做了检测。【结果】Hip1p的3个赖氨酸位点K30、K42和K52突变能有效降低其泛素化水平。同时,双重突变对其泛素化水平有明显的协同作用,并进一步影响了细胞生长和组氨酸利用。【结论】泛素化水平调控能有效调节组氨酸代谢,引起细胞对组氨酸利用的改变,为进一步研究氨基酸转运蛋白的调控机制提供了重要的依据。     

散发性大肠癌组织及粪便脱落细胞p53蛋白的检测

为了解大肠癌组织及粪便脱落细胞中 p5 3蛋白表达对大肠癌诊断的临床意义 ,采用 S- P法对 38例大肠癌患者的癌组织及其中的 30例患者的粪便脱落细胞 p5 3蛋白进行检测。大肠癌组织中 p5 3蛋白阳性表达率为 39.47% (15 / 38) ,p5 3蛋白阳性与癌组织的分化程度及是否存在淋巴结转移均无相关性 (P>0 .0 5 )。粪便脱落细胞 p5 3蛋白阳性表达率为 36 .6 7%(11/ 30 ) ,脱落细胞与相应患者的癌组织中的 p5 3表达一致率为 83.33% (2 5 / 30 )。表明粪便中脱落细胞 p5 3蛋白的表达忠实反映了相应癌组织的 p5 3突变情况 ,对其检测有望成为大肠癌诊断及筛查的无创分子途径。同时表明粪便中脱落细胞核保持了肿瘤抗原决定簇的主要结构及生物特征 ,进行免疫细胞化学检测是可行的 ,为进行脱落细胞核其它肿瘤标志物或其它生物研究奠定了可行性的基础     

NIRF泛素化p53的作用过程中NIRF与p53结合域的测定

NIRF(Np95/ICBP90-like RING finger protein)是2002年发现的一种核蛋白,其功能涉及细胞增殖调节、蛋白多聚泛素化降解、细胞癌变进程控制等领域．已有研究报道,NIRF能与p53相互作用, NIRF本身也是一个高度调节蛋白,在细胞正常的生理状态下发挥泛素化E3连接酶的作用,结合p53并将其降解,但NIRF与p53结合的蛋白结合域目前尚不清楚．本文研究证明,NIRF能与p53结合成复合体参与泛素化蛋白降解途径,并测定出NIRF与p53结合的区域．为了检测NIRF的蛋白结合域,将空载体和NIRF缺失突变体质粒分别转染于HEK293细胞,蛋白表达水平通过Western印迹用两种抗体分别检测. 结果显示,所有的突变体都能在细胞中表达,并且两种抗体检测结果完全一致. 同时,免疫共沉淀技术用于进一步分析实验结果. 由于泛素化蛋白通常伴随蛋白酶体通路介导的降解,免疫共沉淀的蛋白纯化过程中用蛋白酶体抑制剂MG-132以抑制蛋白降解. 本研究结果显示,NIRF 通过PHD区域与p53形成复合体. 该复合体可能参与蛋白分选、蛋白降解、DNA修复以及细胞凋亡等一系列重要的细胞活动,从而形成与细胞增殖相关的新的信号通路,在肿瘤的发生发展中可能发挥某种程度的作用．     

癌症中p53失活的分子机制和靶向p53的抗癌药物研究进展

肿瘤抑制因子p53主要作为转录因子发挥作用.当细胞受到诸如缺氧、DNA损伤等胁迫时,p53蛋白迅速在细胞内积聚并激活,从而调控一系列基因的转录,导致细胞周期停顿、凋亡或衰老,避免细胞癌化.p53功能的失活往往导致癌症发生.编码p53蛋白的TP53基因的突变是p53失活的主要方式.突变型p53不仅失去抑癌作用,而且还具有...     

SPOP在肿瘤发生中的作用

SPOP(speckle type BTB/POZ protein)是E3泛素连接酶接头蛋白,SPOP的缺失或突变通常引发包括肿瘤在内的多种疾病。迄今为止,已经报道多种肿瘤的发生发展与SPOP基因的缺失或突变有关。SPOP发挥的功能具有组织特异性,SPOP主要通过泛素–蛋白酶体途径降解促进肿瘤生长、侵袭和转移等过程的蛋白,从而在前列腺癌、子宫内膜癌和乳腺癌中发挥抑癌基因的作用。该文讨论了SPOP在不同组织来源肿瘤的进展过程中的作用及其作用机制。     

缺氧诱导因子与肾细胞癌关系的研究进展

缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)对维持肿瘤细胞的能量代谢、肿瘤血管生成、促进肿瘤细胞增殖和转移起着重要作用,是肿瘤细胞低氧条件下产生的关键信号分子。本综述旨在总结前人研究,阐述HIF与肾癌细胞之间的内在关系。HIF成员是参与肾癌细胞对缺氧应答反应中的关键因子,并通过靶基因的调节,促进新生血管的生成,导致肿瘤生长。其中,HIF-1α及HIF-2α在促进新生血管的生成方面发挥着主要作用。HIF-1α及HIF-2α与VEGF密切相关,随着其的表达增高,VEGF在数量上及m RNA水平上均显著增高,显示其可通过调控VEGF参与肾癌血管生成,而HIF-2α转录激活VEGF m RNA的特异性较HIF-1α更强。HIF-3α可能存在的负性调控作用,其异构体-4的作用可能与HIF-lα的负性调节有关,其可以阻止HIF-lα与下游靶基因的缺氧反应元件(hypoxia response elements,HRE)结合,同时可在转录水平抑制HIF-lα。HIF在未来可能有成为肾细胞癌治疗的靶点。